שיטת הפקת מולטי-Omics לניתוח מעמיק של תרבויות מסונכרנות של הירוק Alga Chlamydomonas הקשה

מחקרים כלל-מערכתיים חיוניים להבנה מעמיקה של הפונקציות הביולוגיות. עם זאת, דגימות עצמאיות מרובות נדרשות עבור פלטפורמות omics שונות, הצגת כמות גבוהה של שונות לנתונים. שיטה זו מציעה אסטרטגיה חזקה ותפוקה גבוהה עבור מיצוי בו זמנית של כלורופיל, שומנים, מטבוליטים, חלבונים, ועיוורץ מדגם אחד של האצה הירוקה מודל, Chlamydomonas reinhardtii.

עבור כלורופיל, שומנים, מיצוי מטבוליט, לסדר את הצינורות של כדורי תא כלמידומונס שנקטפו בחנקן נוזלי. תן מחדש את גלולה בכל צינור עם מיליליטר אחד של חיץ מיצוי 20 מעלות אחד. כדי למנוע אידוי של חיץ מיצוי צמיגות נמוכה, במהירות מערבולת הצינורות עד התאים הם הומוגניים היטב בתוך תערובת החילוץ aliquot הפתרון לתוך שני צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר.

Sonicate את התרבויות באמבטיה sonication במים קרים קרח במשך 10 דקות לפני הדגירה על שייקר מסלולית ב 1, 000 סיבובים לדקה במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מוסיפים 650 מיקרוליטרים של מאגר מיצוי 2 ומקצרים את הדגימות לפני הצנטריפוגה. כדי aliquot את השברים, להעביר 500 microliters של שלב השומנים MTBE העליון לתוך צינור שכותרתו 1.5 מיליליטר.

השתמש פיפט 200 microliter כדי להסיר את שלב השומנים ולהעביר 650 microliters של שלב מטבוליט קוטבי וחצי קוטבי התחתון לתוך צינורות חדשים שכותרתו. שאף את הנפח העודף כדי להסיר את השלב התחתון הנותר ולהקפיא את כדורי מוצק חנקן נוזלי לאחסון 80 מעלות. לקביעת מטבוליט בקטביים, יש למצות את גלולת הקוטב המיובשת בתתבת הפיורידין של מתוקסיאמין הידרוכלוריד למתוקסימיזציה של קבוצות הפחמן ולחמם את הדגימות ב-30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.

בסוף הדגירה, לגזור את הדגימות עם n-מתיל-n-trifluoracetamide במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. השתמש כרומטוגרפיה גז יחד עם ספקטרומטריית מסה בזמן הטיסה כדי לנתח את המטבוליטים העיקריים. עבור קביעת מטבוליט לא קוטבית, תן שימוש חוזר את גלולה מיובשת של השלב הלא קוטבי בתערובת של שבעה עד שלושה נפח נפח אצטוניטריל כדי isopropanol ולהכביד את כדורי על ידי צנטריפוגה.

לאחר מכן הפרד את הדגימות בעמודת שלב C8 הפוכה במערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים נמוכים במיוחד. לקביעת תוכן כלורופיל, יש לערבב 100 מיקרוליטרים של שלב MTBE עם 900 מיקרוליטרים של 90% מתנול לשיטה ריקה, כמו גם את הדגימות הניסיוניות. לאחר מכן למדוד את הספיגה על ספקטרופוטומטר ב 655 ו 652 אורכי גל ננומטר להבחין בין כלורופיל a ו chlorophyll b ולחשב את התוכן כלורופיל a ו- b ואת התוכן הכולל כלורופיל.

להפקת חלבון, ממיסים את גלולת השלב התחתון ב-200 מיקרוליטרים של מאגר חלבונים ומדגירים את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בסוף הדגירה, צנטריפוגה המדגם ולהעביר את החלבון המכיל על טבעי לצינור חדש. למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ההתדגם ברדפורד.

כדי לעכל את החלבון, להפחית 15 מיקרוגרם של המדגם ב dithiothreitol מילימול במשך 30 דקות, ואחריו אלקילציה עם 10 מילימולרים iodoacetamide במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף האלקלציה, מערבבים את פתרון טריפסין/ליסי-C ביחס של 25 ל-1 חלבון לפרוטאז ודגירה את המדגם במשך שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס. לדלל את המדגם פי שישה ב 50 מילימולר טריס Hcl עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, לסיים את העיכול עם חומצה trifluoroacetic לריכוז סופי של 0.5 עד 1% לאחר העיכול, לרכז את הדגימות כמעט יובש, משאיר שניים עד חמישה microliters של פתרון במרכז ואקום ללא חימום. התן מחדש את הדוגמה במאגר הטעינה. לנתח את תערובות פפטיד על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה מחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ אולטרה ננו.

כדי להפריד את הפפטידים, העמיסו ארבעה מיקרוליטרים של דגימה על עמוד היברידי נטען פאזה הפוכה באורך 20 ס"מ בקוטר פנימי של 75 מיקרומטר וגודל חלקיקים של 1.7 מיקרומטר. השתמש בהגדרות לא מקוונות חלקיות בלולאה עם מעבר צבע איזוקרטי מוגדר כ- 3%של מאגר B, המוחזק למשך 14 דקות לפני שהלולאה מועברת למיקום המקוון עם העמודה, ולאחר מכן המילוי ההדרגתי יוגדל באופן ליניארי למשך 50 דקות עד להגבלת 20%buffer B. שינוי בנפח התא ניתן לראות כמו התאים לגדול בגודל לאורך כל שלב האור, ואחריו שחרורו של תאים בת החל בסוף שלב האור מ 10 שעות.

לאחר שכל תאי הבת שוחררו, ניתן לראות שינוי בנפח התא, כיוון שתאי הבת החדשים ששוחררו נוטים להתחיל את המחזור הבא. בהתבסס על ניתוח ספקטרומטריית מסת כרומטוגרפיה גז של שבר הקוטב, בניסוי מייצג זה, 65 מטבוליטים היו ביאורים. ניתוח ספקטרומטריית המסה הכרומטוגרפיה הנוזלית של השלב הניטרלי המכיל שומנים הוביל לזיהוי של 204 מיני שומנים שונים המכסים מחלקות שומנים שונות.

ניתוח רכיבים עיקריים יכול לשמש כדי לדמיין שינויים גלובליים במטבוליטים ושומנים לאורך מחזור התא עם הפרדה של שלבים בהירים וכהים, כמו גם שלבים מחזוריים למחצה שנצפו הן עבור מטבולומיים והן עבור נתונים ליפידומיים. כאן, סקירה של העשרה תפקודית של 2, 463 חלבונים מועשרים מזוהים מוצג. גלולה הנותרת לאחר מיצוי חלבון יכול לשמש לכמות להתרבות של עמילן, כפי שצוין על ידי סטיית תקן נמוכה בין שכפולים שונים.

חשוב להימנע ייבוש של השלב האורגני כלורופיל העליון, כמו זה יכול להשפיע על רמות כלורופיל בממס, המשפיעים על גורם הנורמליזציה עבור הדגימות. ניתן ליישם הליכים אנליטיים שונים לאפיון הביוכימי של המינים המולקולריים שחולצו.