הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

המטרה של מאמר זה היא לתאר פרוטוקול להפקת מטבוליטים מימית מתאי חסיד מתורבת לניתוח metabolomic, במיוחד, אלקטרופורזה-במסה של נימים.

מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול חזותי מפורט, צעד אחר צעד לחילוץ מטבוליטים ימיים מתאים סרטניים מתורבתים לניתוח מטבולום עוקב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות שלה ואת האמינות לחילוץ מטבוליטים מתאים חסידים. אבל מעל לכל, זה ממוטב היטב לניתוח מטבוליום באמצעות ספקטרומטריית מסת אלקטרופורזה נימית או CEMS.

Metabolomics היא טכניקה רבת עוצמה לזהות סמנים ביולוגיים או גילוי סרטן בשלב מוקדם וחיזוי תגובה כימותרפית לחולי סרטן. אנו משתמשים בתאים סרטניים בהדגמה זו. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על מטבוליטים קציר מתאים חסידים אחרים כגון fibroblasts בתאי iPS.

ריכוזי מטבוליט מנורמלים בהתבסס על מספר התאים קיימא. כל כך זהיר הכנה של תרבות, זה המפתח להשגת נתונים לשחזור טוב. המדגים את ההליך יהיה עמי מרויאמה, טכנאי מהמעבדה שלי.

ראשית, צלחת HCC827 ותאי PC-9 במנות של 100 מילימטר המכיל 10 מיליליטר של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% סרום חזיר עוברי. מניחים את הכלים באינקובטור על 5% פחמן דו חמצני ו 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לתרבות. לאחר הדגירה, הטה בעדינות את מנות התרבות של 100 מ"מ כדי לשאוב את המדיה של תרבות התאים.

לשטוף תאים על כל מנה באמצעות שני מיליליטר של תמיסת מלח פוספט-מאגר ללא סידן ומגנזיום. בעדינות רוק כל מנה, כך פתרון PBS מכסה לחלוטין את פני השטח של המנה, ולאחר מכן להטות את הכלים כדי לשוטוף את חיץ לשטוף. חם 0.25% פתרון טריפסין-EDTA ל 37 מעלות צלזיוס.

עם פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר, להוסיף שני מיליליטר של פתרון טריפסין-EDTA מחומם לכל מנה. בעדינות רוק כל מנה, כך טריפסין מכסה לחלוטין את פני השטח של המנה. הדגירה את מנות התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך כחמש דקות.

לאחר מכן, מוסיפים ארבעה מיליליטר של מדיום הצמיחה השלם החם מראש לכל מנה. ובעדינות פיפטה מספר פעמים כדי להשעות מחדש את התאים במדיום. מעבירים כל מתלה תא לצינור חרוט נפרד של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה ב 800 פעמים g במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש כל גלולת תא בשני מיליליטר של מדיום הצמיחה השלם שהתחמם מראש. מערבבים 10 מיקרוליטרים של ההשעיה התא עם 10 microliters של 0.4% פתרון כחול trypan, ב microtube 1.5 מיליליטר.

לטעון 10 microliters של התערובת לתוך תא ספירת תא להחליק דרך פעולה נימי. הכנס את שקופית התא לתוך מונה התאים האוטומטי ולחץ על לחצן הלכידה כדי ללכוד את התמונה ולהציג את התוצאות של המספר הכולל ואת הכדאיות באחוזים של התאים. אם מספר התא הכולל הוא מעל 0.5 מיליון תאים למיליליטר, להוסיף מדיום צמיחה נוספת לצינור חרוט 15 מיליליטר כדי להשיג את ריכוז התא הרצוי.

עכשיו, להוסיף שניים עד חמישה מיליליטר של התרבות לכל צלחת תרבות תאים 100 מ"מ לזרוע כאחד עד 2 1/2 מיליון תאים לכל מנה. הדגירה את מנות התרבות ב 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. ראשית, בבקבוק נפחי של 15 מיליליטר, לדלל פתרון סטנדרטי פנימי מסחרי המכיל L-Methionine סולפון וחומצה D-Camphor-10-sulfonic 1, 000-פי 000 במים אולטרה-חיים.

ממיסים מניטול במים אולטרה-חמים כדי להכין תמיסת מניטול של 0.05 גרם למיליליטר במים אולטרה-חמים כחוצץ כביסה. לאחר מכן, לתוך המסנן של כל יחידת סינון צנטריפוגלית, פיפטה 250 מיקרוליטרים של מים אולטרה-חמים. מכסים את יחידות הסינון בחוזקה, וצנטריפוגה ב 9, 100 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

בדוק את עוצמת הקול של כל סינון. אם סינון משמעותי הצטבר במהלך הסיבוב הקצר הראשון, יחידת הסינון עשויה להיות פגומה. בטל את יחידת הסינון ולהשתמש ביחידת סינון חדשה במקום זאת.

סגור את המכסים של יחידות הסינון בחוזקה צנטריפוגה שוב ב 9, 100 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. ודא כי לא נשארים מים אולטרה-חמים באף אחת מ כוסות הסינון, והסר את מי האולטרה-ure המסוננים בכל צינור איסוף עם פיפטה. מניחים את כוסות המסנן בחזרה לתוך צינורות האיסוף שלהם, ולהשתמש ביחידות סינון צנטריפוגלי בתוך שעה, כדי למנוע נזק על ייבוש.

מוציאים את מנות התרבות של 100 מ"מ מהחממה ושואבים את מדיום תרבות התאים מכל מנה. הוסף 10 מיליליטר של מדיום תרבות PBS עם או בלי 250 דיאמיד micromolar לכל מנה, דואג לא להפריע שכבת התא. הדגירה את מנות התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

לאחר הדגירה, שאפו את מדיום תרבות התאים מכל צלחת תרבות של 100 מילימטר. להטות מעט את המנה, בעדינות להוסיף שני מיליליטר של 5% מניטול לשטוף חוצץ לקצה של כל מנה לשטוף את התאים, דואג לא להפריע שכבת התא. שאפו את חיץ הכביסה מכל תבשיל תרבות, ושטפו שוב את התאים על ידי הטיה קלה של המנה והוספת 10 מיליליטר של חיץ שטיפה למנה.

לאחר מכן, שאפו לחלוטין את חיץ הכביסה מקצה כל מנה תרבותית. עכשיו, להוסיף 800 microliters של 99.7% מתנול לכל צלחת תרבות, בעדינות רוק כל צלחת תרבות קדימה ואחורה, כדי לכסות את כל פני השטח שלה. השאירו את הכלים בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות.

מוסיפים באיטיות 550 מיקרוליטרים של הפתרון הסטנדרטי הפנימי המדולל למנה על ידי טבילת קצה הפיפיאט במתנול וצנרת בעדינות למעלה ולמטה, מספר פעמים. מטלטלים בעדינות כל צלחת תרבות הלוך ושוב כדי לכסות את כל פני השטח שלה, ומשאירים את הכלים בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. לאחר מכן, להעביר את הפתרון המופק מכל צלחת תרבות לצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה הצינורות ב 2, 300 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. העבר 700 מיקרוליטרים של כל על-טבעי לשתי יחידות סינון צנטריפוגליות, עם 350 מיקרוליטר ליחידה. צנטריפוגה צינורות המסנן ב 9, 100 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך כשעתיים, עד שלא נשאר נוזל ב כוסות המסנן.

הסר את כוסות המסנן, וסגור היטב את המכסים של צינורות האיסוף. במחקר זה, תאי HCC827 ו- PC-9 גדלו באופן שווה במשך שלוש שעות. ניתוח CEMS מציין הבדל בין תאים שטופלו בדיאמיד לבין תאים שטופלו ב- PBS עבור שני קווי התאים.

בין אלה, מספר מתווכים במסלול פוספט פנטוז ובגליקוליזה העליונה היו גבוהים משמעותית בתנאים שטופלו בדיאמיד, ואילו כמה ביניים מחזור tricarboxylic היו נמוכים יותר בתנאים המטופלים. פרופילי מטבוליום של מטבוליטים תאיים חשפו 175 ו 150 מטבוליטים דיפרנציאליים בתאי HCC827 ו- PC-9, בהתאמה. לאחר טיפול דיאמיד, רמת החומצה הגלוקונית והגלוקוז מחומצן גדלה פי 12 בתאי HCC827 ו-10 תתיאי PC-9.

באופן דומה, רמת הגלוקוז 6-פוספט, גלוקוז זרחני במוצר הגליקוליזה הראשון של הקסוקינאז, גדלה גם היא פי 6.3 ו-3.5 בתאי HCC827 ו-PC-9, בהתאמה. בנוסף, רמות 6-phosphogluconate, הביניים הראשון במסלול פוספט פנטוז, גדל באופן דרמטי 89 קפל בתאי HCC827 ו 231-פי בתאי PC-9. לעומת זאת, רמות של מתווכים גליקוליטיים אחרים כגון פרוקטוז 6-פוספט לא השתנה במצב הניסיוני diamide.

סה"כ רמות הפוספט של ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד היו כמעט שוות ערך בין טיפול בדיאמיד לבין תנאי בקרה של PBS. שימוש בתתבנת 5%mannitol, מלבד PBS, כחוצץ כביסה לתאי כביסה חשוב מאוד לניתוח CEMS, מכיוון שמאגרים מבוססי מלח מפריעים לניתוח ומשפיעים לרעה על המדידה. פרוטוקול זה אינו מתאים לחילוץ מטבוליטים הידרופוביים כמו שומנים, ולכן עלינו לפתח פרוטוקול לחילוץ נוח של מטבוליטים הידרופיליים והידרופוביים לניתוח מטבוליום מקיף יותר.

טכניקה זו מבינה מיצוי קל של מטבוליטים כמעט מכל תאים חסידים, ולכן, ישים עבור מגוון רחב של מחקרים כגון סרטן, תאי גזע, פרמקולוגיה, תזונה, ומדעי הקוסמטיקה.