Name: הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-09T23:59:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: למדו פרוטוקול אמין לחילוץ מטבוליטים מתאי סרטן מתורבתים לניתוח מטבולומי באמצעות CEMS. השיטה מותאמת לתאים דבקים ומספקת תוצאות ברות-השוואה למחקרי סרטן ותרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל חברי המרכז לקידום התעשייה האזורית שונוב על עזרתם. עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי קרנות מחקר מפריפקטורה של יאמאגאטה ו Tsuruoka העיר, על ידי קרן הלאומי למחקר ופיתוח של המרכז לסרטן [גרנט מספר 28-A-9], ועל ידי החברה היפן לקידום המדע (JSPS) KAKENHI [גרנט מספר 17K07189] ל-HM.

1. תרבות התא ביום 1
הערה: כל דוגמה עבור מיצוי המטולייט צריכה להיות מוכנה ממנה אחת של 100 מ"מ בלבד מרקמת רקמה בינוני, אך לא באופן מלא (המכיל כ-2 – 5 מיליון תאים). חשב את מספר המנות הדרושות לצורך הביצוע והכינו אותם בהתאם.
<ol><li>תרבות HCC827 ותאים PC-9 ב 5% CO2 ב 37 ° c ב RPMI-1640 בינונית בתוספת עם 10% סרום העובר (fbs).</li>
	<li>ממנה את מדיית התרבות הסלולרית. ממנות התרבות 100 מ"מ</li>
	<li>רוחצים את התאים על כל מנה בעזרת 2 מ ל של תמיסת מלח מלוחים באגירה (PBS) ללא סידן ומגנזיום. הסלע בעדינות כל מנה כך הפתרון PBS לחלוטין מכסה את פני השטח של המנה.</li>
	<li>. מכבסת התרבות</li>
	<li>חם 0.25% טריפסין-EDTA הפתרון ל 37 ° c ולהוסיף 2 מ ל של טריפסין-EDTA פתרון עם הצנרת 5 מ ל בתוספת. מטלטל בעדינות כל מנה כך שהטריפסין מכסה לחלוטין את פני השטח של המנה.</li>
	<li>מודקון את מנות התרבות ב 37 ° c עבור כ 5 דקות.</li>
	<li>הוסף 4 מ ל של בינוני מראש מחומם לחלוטין הצמיחה לכל מנה. השהה מחדש את התאים במדיום על-ידי ליטוף מספר פעמים בעדינות.</li>
	<li>העבר כל השעיה התא לתוך שפופרת 1-mL ו צנטריפוגה נפרדת ב 800 × g עבור 5 דקות.</li>
	<li>השהה מחדש את כל הגלולה ב 2 מ ל של מדיום צמיחה מראש מחומם לחלוטין.</li>
	<li>קבע את המספר הכולל ואת הכדאיות הכוללת של התאים באמצעות מונה התאים האוטומטי ו-0.4% טרי, פתרון כחול.<ol>
<li>מערבבים 10 μL של השעיה לתא ו 10 μL של 0.4% הפתרון הכחול.</li>
		<li>טען 10 μL של דגימה לתוך התא ספירת שקופית קאמרית באמצעות נימי הפעולה.</li>
		<li>הכנס את השקופית הקאמרית. לתוך מונה התאים האוטומטי האור המשודר מאיר אוטומטית והכלי מתמקד באופן אוטומטי על התא.</li>
		<li>לחץ על לחצן הלכידה כדי ללכוד את התמונה ולהציג את התוצאות.</li>
		<li>במידת הצורך, להוסיף בינוני גדילה נוסף כדי לקבל את הריכוז הרצוי התא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זרע כ 1 – 2.5 מיליון תאים לכל 100 מ"מ צלחת תרבות התא. הערה: ריכוזי מטבוליט נקבעים על-ידי ניתוח CE-MS יהיה מנורמל על בסיס מספר תאים קיימא. לצורך ספירת תאים, יש צורך להכין לפחות מנה אחת נוספת של תרבות הזריעה עבור כל קבוצה.</li>
	<li>מודיית את מנות התרבות ב 5% CO2 ב 37 ° c עבור 18 h.</li>
</ol>2. הכנת ריאגנטים
<ol><li>לדלל את הפתרון הפנימי המסחרי כולל L-מתיונין סולפון ו d-קמפור-10-sulfonic חומצה 1000-מקפלים במים באולטרטהורים. הערה: עבור פחות מ 80 דגימות, פשוט לערבב 50 μl של התקן הפנימי פתרון 1 ו 45 mL של מים אלקטרופורזה ב בקבוקון מנפח 50 mL, ואז להביא את הפתרון עד 50 ml עם מים באולטרטהורים.</li>
	<li>להכין מ0.05 g/mL פתרון ניטול במים באלקטרופורזה כמו מאגר לשטוף. הערה: עבור פחות מ 30 דגימות, פשוט לפזר 25 גרם של ניטול ב 500 mL של מים אלקטרופורזה. כ 15 מ ל של מאגר לשטוף נדרש לכל 100 mm מאכל התרבות, כך להכין נפח מספיק של שטיפת מאגר על פי מספר דגימות.</li>
</ol>3. כביסה מראש יחידות מסנן צנטריפוגלי
<ol><li>פיפטה 250 μL של מים באולטרסאונד לתוך גביע המסנן של כל יחידת מסנן צנטריפוגלי (ראה את הטבלה של חומרים). הערה: יש צורך בשתי יחידות סינון לכל מדגם.</li>
	<li>כיסוי יחידות מסנן הדוק צנטריפוגה ב 9,100 × g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות.</li>
	<li>בדוק את עוצמת הקול של כל פילטרט — אם פילטרט משמעותי צבר במהלך הספין הקצר הראשון, יחידת הסינון עלולה להיות פגומה. במקרה זה, מחק את יחידת הסינון והשתמש ביחידת סינון חדשה במקום זאת.</li>
	<li>סגור את העפעפיים של יחידות מסנן בחוזקה צנטריפוגה שוב ב 9,100 × g ב 4 ° c עבור 30 דקות.</li>
	<li>ודא שאין מים בעלי בדיקת אולטרה-טהורות באף אחת מכוסות הפילטר; להסיר את המים באולטרסאונד מסוננים בכל צינור אוסף עם פיפטה ולהשליך. הערה: אל תנסו להסיר מים שיורית בגביע מסנן עם פיפטה, כפי שהוא עלול לגרום נזק למסנן.</li>
	<li>החלף את כוסות הפילטר בצינורות האוספים שלהם. הערה: השתמש ביחידות הסינון הצנטריפוגלי בתוך שעה מאז שהמסננים עלולים להיפגע בעת ייבוש.</li>
</ol>4. תרבות התא ביום 2
<ol><li>
קחו את מנות התרבות ה100 מילימטר מהאינקובטור. הערה: משך תרבות התא המומלץ הוא 18 שעות.</li>
	<li>מנושף את מדיום התרבות התאית מכל אחד מכלי התרבות 100 מ"מ.</li>
	<li>הוסף 10 מ ל של מדיום תרבות התא הכולל ריכוזים מתאימים של תרכובות או תרופות לכל מנה, מטפל לא להפריע שכבת התא. הערה: למטרות הדגמה, הוספנו 10 μL של 250 mM diamide מומס PBS (הריכוז הסופי של 250 μM) בניסוי זה.</li>
	<li>מכשלה את מנות התרבות ב-37 ° c למשך 30 דקות בנוכחות diamide או PBS כפקד.</li>
	<li>מנושף את מדיום התרבות התאית מכל אחד מכלי התרבות 100 מ"מ.</li>
	<li>לשטוף את התאים על ידי הוספת בעדינות 2 מ ל של 5% ניטול פתרון לקצה של כל מנה, מטפלת לא להפריע את שכבת התא, ואז קצת להטות את הצלחת. הערה: PBS או פתרון מלוחים מפריעה לניתוח metabolomic מבוסס CE-MS ומשפיע לרעה על תוצאות המדידה, ובכך לא צריך לשמש ככביסה מאגר.</li>
	<li>מטפי את מאגר הכביסה מכל צלחת התרבות, ולאחר מכן לשטוף את התאים שוב על ידי הוספת בעדינות 10 מ ל של מאגר לשטוף לכל מנה והטיית מעט את הצלחת.</li>
	<li>מטפי לגמרי את מאגר הכביסה. מהקצה של כל מנה תרבותית הערה: מרוב מאגר לשטוף ככל האפשר, תוך שימת לב לא למשוך את התאים. מננירול משיורי עלול להפריע לניתוח CE-MS; השאיפה של תאים תפחית את מספר התאים וכך תהפוך למקור של שגיאה בנורמליזציה של נתונים.</li>
</ol>5. הפקת מטבוליטים מתאים מתורבתים
<ol><li>הוסף 800 μL של 99.7% מתנול לכל מאכל תרבות. הסלע בעדינות כל צלחת התרבות הלוך ושוב כדי לכסות את כל המשטח. השאירו את הכלים בטמפרטורת. החדר במשך 30 ס מ</li>
	<li>לאט להוסיף 550 μL של הפתרון תקן פנימי מדולל לכל מנה על ידי המהול את קצה הפיפטה לתוך מתנול ובעדינות ללטף למעלה ולמטה מספר פעמים.</li>
	<li>הסלע בעדינות כל צלחת התרבות הלוך ושוב כדי לכסות את כל המשטח.</li>
	<li>השאירו את הכלים בטמפרטורת. החדר במשך 30 ס מ</li>
</ol>6. אולטראפילטרציה של תמציות תאים
<ol><li>העבר את הפתרון המחולצים מכל צלחת תרבות לצינור שפופרת מיקרו-1.5 mL נפרד.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 2,300 × g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות.</li>
	<li>העבר 350 μL של כל סופרנטאנט לשתי יחידות סינון צנטריפוגליים לכל מדגם. הערה: מכל מאכל תרבות, סך של 700 μL של הפתרון שחולץ מועבר לשני צינורות מסנן (350 μL/tube).</li>
	<li>צנטריפוגה את צינורות הפילטר ב-9,100 × g בשעה 4 ° צלזיוס עבור כ-2 מעלות עד שאין שרידי נוזלים בכוסות הפילטר.</li>
	<li>הסר את כוסות הפילטר וסגור בחוזקה את העפעפיים של צינורות הגבייה.</li>
</ol>7. התאיידות לדוגמא
<ol><li>הכינו מאייד צנטריפוגלי-בדרך כלל, זה מורכב מאייד, מלכודת קרה ומשאבת ואקום.</li>
	<li>הניחו את צינורות הגבייה. במאייד הצנטריפוגלי הערה: השאר את העפעפיים של הצינורות פתוחים.</li>
	<li>להתנדף את הפתרונות לדוגמה שחולצו בתנאי ואקום בטמפרטורת החדר. הערה: תצורות טיפוסיות עבור מספר סיבובים והלחץ הם 1,500 rpm ו 1,000 אבא, בהתאמה, וזה בדרך כלל לוקח כ 3 h כדי להתאדות לחלוטין את הדגימות.</li>
	<li>ודא כי לא נשאר נוזל בכל צינורות האוסף ולסגור את העפעפיים של הצינורות בחוזקה.</li>
	<li>אחסנו את צינורות הגבייה בטמפרטורה נמוכה במיוחד (ל80 ° c) עד לניתוח metabolomic.</li>
</ol>8. אנליזה Metabolomic של לסה נ-MS
<ol><li>השהה מחדש את פילטרט ב 50 μl של מים באולטרסאונד באופן מיידי לפני ניתוח CE-MS.</li>
	<li>בצע ניתוח CE-MS לפי שיטות שתוארו בעבר12,13 באמצעות מערכת אלקטרופורזה קפילר ומערכת זמן של טיסה ספקטרומטר מסה מצויד משאבת isocratic, ce-ms מתאם, ו-ce-ESI מרסס. הערה: ניתן לשלוט בשתי המערכות על ידי התוכנה של ספקי המערכת ומחוברים באמצעות סיליקה קפילר מותך (50 יקרומטר קוטר פנימי × 80 ס מ אורך כולל).<ol>
<li>כוונן מכשירים ומבחנות לדוגמה, הכן את הקפילר באמצעות קלטת קפילר, לחדש את נוזלי המעטפת ומאגרי האלקטרופורזה המתאימים, בהתאם למצב ניתוח של האניב או הקטיון ולאחר מכן החל מתח. הערה: מכשור ותנאים אנליטיים מתוארים בפרוטרוט במקומות אחרים12,13.</li>
		<li>פתח את התוכנה והכנת רשימת עבודה המכילה שיטות לרכישת נתונים ומידע לדוגמה.</li>
		<li>התחל בבדיקה ובדוק את הנתונים כגון עוצמת האות וצורת השיא של תקנים פנימיים ורזולוציית השיא של תרכובות סטנדרטיות אחרות.</li>
		<li>כוונן את התנאים האנליטיים במידת הצורך.</li>
		<li>הכנס את הפתרונות לדוגמה ב 50 mbar עבור 3 s ומתח של 30 kV. הערה: CE-MS התנהל גם במצב יון חיובי או שלילי. הגדר את הספקטרומטר כדי לסרוק את טווח המסה m/z 50-1000. מתח נימי הנימים הוגדר ב-4 kV; קצב הזרימה של גז חנקן (טמפרטורת חימום 300 ° c). במצב חיובי, המתח הפרגמנטור, מזרן ומתח ה75 של OCT הוגדרו ב-50 ו-125 V, בהתאמה. עבור מצב יון שלילי, מדריך הפרגמנטור, מזרן, והמתח של OCT RFV הוגדר ב 100, 50, ו 200 V, בהתאמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>. לנתח נתוני ספקטרום<ol>
<li>לחלץ את הפסגות מן הנתונים ספקטרלי מסה באמצעות תוכנה שילוב אוטומטי כדי להשיג מידע השיא כולל m/z, אזור השיא, ואת זמן ההגירה (MT). הערה: השיטה מתוארת בפירוט במקום אחר14.</li>
		<li>אל תכלול את פסגות האותות המתאימות לisotopomers, ליוני האוורור וליונים מוצרים אחרים של מטבוליטים ידועים.</li>
		<li>ביאור פסגות שנותרו עם מידע ממסד הנתונים HMT מטבוליט על פי ערכי m/z ו MTs.</li>
		<li>נרמל אזורים של הפסגות המוערת לרמות סטנדרטיות פנימיות ומספרי תאים לכל מדגם.</li>
		<li>הערכת הריכוז של כל מטבוליט בתאים מתורבתים (pmol/106 תאים) באמצעות עקומות סטנדרטיות מוכן לכל מטבוליט.</li>
		<li>השתמש בריכוזי מטבוליט הקוונט לניתוחים סטטיסטיים נוספים ופרשנויות ביולוגיות14.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lunt, S. Y., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerobic+glycolysis%3A+meeting+the+metabolic+requirements+of+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Aerobic glycolysis: meeting the metabolic requirements of cell proliferation.</a> Annual Review Cell and Developmental Biology. 27, 441-464 (2011).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism%3A+key+players+in+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism: key players in metabolic reprogramming.</a> Cancer Science. 104 (3), 275-281 (2013).</li>
<li>Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and Cancer.</a> Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).</li>
<li>Fukuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+study+for+cancer+diagnosis+with+positron-labeled+fluorinated+glucose+analogs%3A+%5B18F%5D-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose%3A+a+new+tracer+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Meddicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Experimental study for cancer diagnosis with positron-labeled fluorinated glucose analogs: [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannose: a new tracer for cancer detection.</a> European Journal of Nuclear Meddicine and Molecular Imaging. 7 (7), 294-297 (1982).</li>
<li>Miles, K. A., Williams, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Warburg+revisited%3A+imaging+tumour+blood+flow+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Imaging%22%5BJournal%5D)">Warburg revisited: imaging tumour blood flow and metabolism.</a> Cancer Imaging. 8, 81-86 (2008).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Levine, A. J., Puzio-Kuter, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+the+metabolic+switch+in+cancers+by+oncogenes+and+tumor+suppressor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The control of the metabolic switch in cancers by oncogenes and tumor suppressor genes.</a> Science. 330 (6009), 1340-1344 (2010).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+signaling+regulates+global+metabolic+pathways+in+EGFR-mutated+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling regulates global metabolic pathways in EGFR-mutated lung adenocarcinoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20813-20823 (2014).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+the+Phosphatidylinositol+3-Kinase+%28PI3K%29%2FMammalian+Target+of+Rapamycin+%28mTOR%29+Axis+Is+Responsible+for+Aerobic+Glycolysis+mediated+by+Glucose+Transporter+in+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+%28EGFR%29-mutated+Lung+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-mutated Lung Adenocarcinoma.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17495-17504 (2015).</li>
<li>Makinoshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Determinants+of+Sensitivity+to+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathway+Inhibitor+in+Small-Cell+Lung+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic Determinants of Sensitivity to Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathway Inhibitor in Small-Cell Lung Carcinoma.</a> Cancer Research. 78 (9), 2179-2190 (2018).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Characterization+of+Antifolate+Responsiveness+and+Non-responsiveness+in+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Characterization of Antifolate Responsiveness and Non-responsiveness in Malignant Pleural Mesothelioma Cells.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1129(2018).</li>
<li>Ohashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depiction+of+metabolome+changes+in+histidine-starved+Escherichia+coli+by+CE-TOFMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS.</a> Molecular BioSystems. 4 (2), 135-147 (2008).</li>
<li>Ooga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+anatomy+of+an+animal+model+revealing+homeostatic+imbalances+in+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Metabolomic anatomy of an animal model revealing homeostatic imbalances in dyslipidaemia.</a> Molecular BioSystems. 7 (4), 1217-1223 (2011).</li>
<li>Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+mass+spectrometry-based+saliva+metabolomics+identified+oral%2C+breast+and+pancreatic+cancer-specific+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles.</a> Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).</li>
<li>Patra, K. C., Hay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pentose+phosphate+pathway+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pentose phosphate pathway and cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 347-354 (2014).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה נגישה נרחב כדי להכין מטבוליטים מתאי סרטן מתורבת עבור ניתוח metabolomic מבוסס CE-MS. אחת הנקודות הקריטיות ביותר בפרוטוקול זה היא ההכנה הנכונה של תאים סרטניים, כי נמדד ריכוזי מטבוליזם לייט הם מנורמל למספר תאים קיימא. להערכת מדויק של מספר התא, יש להכין לפחות מנה אחת נוספת לתרבות לכל קבוצה ניסיונית כדי לספור את מספר התאים הקיימא במקביל עם החילוץ של מטבוליטים לניתוח metabolomic. בנוסף, יש לזרע את אותו מספר תאים בכל מנה עבור המשכפלת ובצלוחית לספירה; בעתיד, זה יהיה לסייע על ידי מהיר, ללא מלחיץ (למשל, טריפסין-ללא) פרוטוקול ספירת תאים המאפשר את הצלחת זהה לשמש הן לספור תאים קיימא ולחילוץ מטבוליטים. הטיפול צריך להילקח במהלך שוטף כך תאים לא להתנתק מהמשטח של הכלים. בדיקות ציטורעילות חמורה וניסויים אחרים הפחתת הדבקה בתאים עשויים להיות בלתי מתאימים לפרוטוקול החילוץ בשל אובדן פוטנציאלי של תאים במהלך הליך הכביסה.
חשוב להשתמש 5% ניטול פתרון כמו מאגר לשטוף לחילוץ מטבוליטים מתאים מתורבתים עבור ניתוח metabolomic מבוסס CE-MS, משום מאגרים מבוססי מלח, כגון PBS, להפריע ניתוח metabolomic ולהשפיע לרעה מדידה.
שניים או שלושה מאכלים יכולים להיות משולבים כמדגם אחד על ידי חילוץ בנפרד מטבוליטים מכל מנה ולאחר מכן לאגירת דגימות; עם זאת, שילוב מנות מרובות לעתים קרובות מגביר ניטול שיורית בפתרון מטבוליט שחולצו. הדבר עלול גם להפריע לניתוח metabolomic על-ידי CE-MS. לכן, מומלץ לא להשתמש בכלים או בבארות מרובים כמדגם אחד.
שיטת ניתוח metabolomic זו באמצעות CE-MS פותחה עבור מדידה מקיפה של מולקולות טעונה עם משקולות מולקולרית בין 50 ו 1000 Da; לפיכך, פרוטוקול זה ממוטב להפקת מימית, תרכובות במשקל מולקולרי נמוך. לכן, פרוטוקול זה אינו מתאים לחילוץ הידרופובי מטבוליטים כגון שומנים או קרו כגון חלבונים וחומצות גרעין. מאז יש דרישה גוברת לניתוח השומנים המקיף או lipidomics של דגימות תאים מתורבת, הפיתוח של פרוטוקול קל ואפקטיבי לחילוץ סימולטני של שני הידרופיפילית והידרופובי מטבוליטים נדרש.
הצעד הראשון של הפקת מטבוליזם-שוטף בינוני וכביסה תאים עם mannitol-יש לנהל מהר ככל האפשר כדי למזער את השינויים בפרופיל חילוף החומרים של התאים. טיפול בתאים עם מתנול לאחר כביסה עם ניטול הוא הניח החלבונים ובכך למנוע אנזימים לזרז תגובות מטבולית נוספת. עם זאת, גם לאחר הטיפול המתנול, תגובות כימיות לא-אנזימטיות-כגון תגובות נגד חמצון, כמה תהליכים דארבוקלציה, וקשרים מסוג תיול-עשויים להתרחש. ככזה, כל ריכוזים של מטבוליטים המעורבים בתגובות אלה נמדד על ידי פרוטוקול זה צריך להתפרש בזהירות. בניגוד לגנום או טראנסקריפט, המטאבאלי מורכב של מולקולות עם מגוון רחב של תכונות כימיות; מכאן, אף פרוטוקול יחיד יכול לחלץ את כל מטבוליטים ללא כל הפסד או הפרעה. למדידות מדויקות יותר של מטבוליטים מאוד תגובתי כגון, פרוטוקול שתוכנן במיוחד כדי לחלץ קבוצות מסוימות של מטבוליטים, אשר דורש הפסקות ובעלי ללעג, יש להתייעץ. הפרוטוקול המוצג כאן, עם זאת, מתאר הוצאה פשוטה ומהירה של מטבוליטים מימית מדגימות תאים מתורבת לניתוח metabolomic על ידי CE-MS. במאמר זה לא יכולנו לתאר כיצד להגדיר CE-MS בפירוט מכיוון שהמוקד של כתב היד הנוכחי הוא שונה, אולם, המתאר צעדים מפורטים להגדרת CE-MS עשוי לדרוש מאמר ייעודי נפרד.

אוטו ורבורג הבחין כי התאים הסרטניים לרכוש את היכולת יוצא דופן לקחת את הגלוקוז ולהחמיץ אותו כדי לייצר לקטט בנוכחות של חמצן הולם-תופעה כינה אפקט ורבורג או האירובי גליקוליזיס1,2. ליקויים בנשימה מיטוכונדריאלי הם העריכו כבסיס הבסיסי של גליקוליזיס אירובי בתאי סרטן3. אכן, אפקט ורבורג הוא בסיס הדמיה של הגידול על ידי פלואורודיט גלוקוז (fdg)-פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה (PET), אשר נמצא בשימוש נרחב בפרקטיקה קלינית4,5. שיעור גבוה של גליקולוליזיס אירובי נחשב לתכונה מרכזית של סרטן, שאומצה לאחרונה כאחת הידועות "הסימנים הידועים של סרטן", כפי שמתואר על ידי ד. האנהאן ו ב ויינברג6. מוטציות סומטיים באואונגנים וגנים מדכא גידול-כגון HRAS/קראס/nras, egfr, braf, myc, TP53, isocitrate דהידרוגנאז (idh), ו fumarate הידרואטאז (fh ) — קושרו לשינויים מטבוליים ספציפיים בתאי הסרטן, האמינו כתוצאה מאפקט ורבורג7.
ניתוח Metabolomic היא גישה מבטיחה לא רק כדי להבין את הרגולציה המטבולית בתאים סרטניים אלא גם כדי לזהות מוקדם בשלב ביוארקרס סרטן וחיזוי תגובה כימותרפיה. בעקבות הטיפול של תאים סרטניים רגישים או עמידים עם תרכובות נוגדות סרטן, מעקב אחר תגובות מטבולית שלהם מקלה על זיהוי של בסמנים מטבוליים כדי לנבא את היעילות של טיפולים נוגדי סרטן ספציפיים בחולי סרטן8 ,9,10,11. במאמר זה, תא סרטן קווי נגזר אדנוקרצינומה ריאה עם מוטציה Egfr שטופלו diamide-מה שגורם לחץ חמצוני — שימשו מודלים עבור ניתוח metabolomic. היתרון של שיטה אנליטית זו באמצעות אלקטרופורזה-המסה ספקטרומטריה (CE-MS) הוא מדידה מקיפה של הטעונה מטבוליטים עם טווח מסה m/z 50-100012,13. מטרת מאמר זה היא לספק לטירונים פרוטוקול חזותי מפורט ויזואלי להכנת מטבוליטים מימית מתאי סרטן וניתוח metabolomic עוקבות, במיוחד על ידי CE-MS.

<table><tbody><tr><td>מונה תאים אוטומטי</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>Countess II מונה תאים אוטומטי</td></tr><tr><td>תוכנת אינטגרציה אוטומטית</td><td>Agilent Technologies</td><td>MassHunter G3335-60041</td><td>גרסה B.02.00</td></tr><tr><td>מערכת CE Agilent</td><td>Technologies</td><td>Agilent 7100 CE מערכת</td><td></td></tr><tr><td>CE / MS ערכת מתאם</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1603A</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מרסס CE-ESI-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1607A</td><td></td></tr><tr><td>שקופית תא ספירת תאים</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10282</td><td>שקופיות תא ספירת תאים רוזנת</td></tr><tr><td>מכשיר מסנן צנטריפוגלי, 5 kDa</td><td>טכנולוגיות מטבולום אנושי</td><td>ULTRAFREE MC PLHCC,</td> צינור פוליפרופילן סטרילי חרוטי UFC3LCCNB-HMT<td></td></tr><tr><td>, 15 מ"ל</td><td>Thermo Scientific</td><td>N339651</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת פוליפרופילן סטרילית חרוטית, 50 מ"ל</td> פסים <td>של Thermo Scientific</td><td>N339653</td><td></td></tr><tr><td>Costar, 10 מ"ל</td><td>פס קורנינג</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar, 5 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Wako</td><td>133-00845</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>מלח פוספט חוצץ (DPBS) של Dulbecco</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>מאגר אלקטרופורזה</td><td>טכנולוגיות מטבולום אנושי</td><td>H3301-1001</td><td>לניתוח קטיונים</td></tr><tr><td>מאגר אלקטרופורזה</td><td>טכנולוגיות מטבולום אנושי</td><td>H3302-1021</td><td>לניתוח אניונים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Biowest</td><td>S1780</td><td></td></tr><tr><td>קצה מסנן, 1000 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-1000S</td><td></td></tr><tr><td>קצה מסנן, 20 &mu; l</td><td>Watson</td><td>124P-20S</td><td></td></tr><tr><td>קצה מסנן, 200 &mu; l</td><td>Watson</td><td>1252-703CS</td><td></td></tr><tr><td>נימי סיליקה התמזגו</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>50 &mu; תעודת זהות וזמנים; 80 ס"מ אורך כולל</td></tr><tr><td>HCC827</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2868</td><td></td></tr><tr><td>פתרון סטנדרטי פנימי</td><td>Human Metabolome Technologies</td><td>H3304-1002</td><td></td></tr><tr><td>משאבה איזוקרטית</td><td>Agilent Technologies</td><td>Agilent 1100 Series משאבה</td><td></td>איזוקרטית</tr><tr><td>מתנול</td><td>Wako</td><td>138-14521</td><td>1 ליטר, מיקרו-שפופרת בדרגת LC/MS</td></tr><tr><td>, 1.5 מ"ל</td><td>ווטסון</td><td>131-415C</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הפעלה</td><td>Agilent Technologies</td><td>ChemStation G2201AA</td><td>גרסה B.03.01 עבור CE</td></tr><tr><td>PC-9</td><td>RIKEN Bio Resource Center</td><td>RCB4455</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמה סטרילית, 100 מ"מ</td><td>קורנינג</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה זמן טיסה</td><td>Agilent טכנולוגיות</td>: <td>Agilent G1969A תמיסה כחולה LC/MS</td><td></td>זמן טיסה</tr><tr><td>, 0.4%</td> <td>Thermo Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים</td><td>במיוחד</td><td>Merck Milli-Q מים</td><td>18.2 M&Omega; &#183; ס"מ מים טהורים</td></tr><tr><td>בקבוק נפחי, 50 מ"ל</td><td>איוואקי</td><td>5640FK50E</td><td>TE-32</td></tr></tbody></table>

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מmetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

ניתוח Metabolomic היא גישה מבטיחה omics לא רק להבין את התקנה מטבולית ספציפית תאים סרטניים לעומת תאים נורמליים אלא גם כדי לזהות סמנים ביואריטים לאיתור מוקדם בשלב הסרטן וחיזוי של תגובת כימותרפיה ב חולי סרטן. הכנת דגימות אחידה לניתוח metabolomic היא נושא קריטי שנותר לטפל בו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול קל ואמין להפקת חילוף חומרים מימית מתאי חסיד מתורבת לניתוח metabolomic באמצעות אלקטרופורזה-המסה של הקפימטריה (CE-MS). מימית מטבוליטים מתאים מתורבתים מנותח על ידי culturing וכביסה תאים, טיפול בתאים עם מתנול, חילוץ מטבוליטים, והסרת חלבונים וקרו עם עמודות ספין עבור ניתוח CE-MS. תוצאות הנציג באמצעות קווי סרטן ריאות התאים שטופלו diamide, מגיב חמצוני, להמחיש את משמרת מטבולית בבירור הנצפה של תאים תחת לחץ חמצוני. מאמר זה יהיה יקר במיוחד לסטודנטים וחוקרים המעורבים במחקר טבולומיקס, מי הם חדשים לאסוף מטבוליטים מקווי התא לניתוח על ידי CE-MS.

מאז ריכוזי מטבוליט בתאי הסרטן (pmol/106 תאים) הם מנורמל למספר תאים קיימא, תנאים ניסיוניים צריך להיות מוגדר עם טיפול כדי למזער את הווריאציה במספר תאים קיימא בין התנאים. לדוגמה, הטיפול diamide היה בריכוז גבוה יחסית (250 μm) אבל לזמן קצר כדי לאפשר את כל התאים לגדול באותה מידה ככל האפשר, ובכך משווה את מספר תאים קיימא שנותחו. תחת תנאים ניסיוניים אלה, HCC827 ו-PC-9 תאים גדל באופן שווה עבור 3 h (איור 1). CE-MS ניתוח של תאים מטופלים diamide בהשוואה לתאים PBS (שליטה) חשף 175 ו 150 מטבוליטים דיפרנציאלי ב HCC827 ו-PC-9 תאים, בהתאמה. בין השאר, מספר מintermediates במסלול הפנטוז פוספט (PPP) ובגליקולזיס העליון היו גבוהים באופן משמעותי בתנאים שטופלו על-ידי diamide בשני קווי התא, ואילו בכמה מחזורי חומצה tricarboxylic הintermediates היו נמוכים יותר בטיפול מצבים (איור 2 ואיור 3).
ה-PPP יוצר הפחתת המקבילה בצורה של מופחתת באופן מופחת של אדניאוקליטישן פוספט (NADPH), המשמש לתחזוקת הומאוסטזיס מחדש ולחומצת שומן ביוסינתזה15. בעקבות טיפול diamide, רמת חומצה gluconic-גלוקוז תחמוצת-גדל 12-קיפול בתאים HCC827 ו 10-קיפול בתאים PC-9; באופן דומה, בעקבות הטיפול diamide, רמת הגלוקוז 6-פוספט (G6P)-גלוקוז זרחתי ואת המוצר הראשון ההקאוקיאז-מזרז גליקוליוזיס-גם גדל 6.3-ו 3.5-מקפלים ב HCC827 ו-PC-9 תאים, בהתאמה (איור 4). בנוסף, בעקבות הטיפול diamide, הרמות של 6-פוספיוגלוקונאט (6PG) — המתווך הראשון ב-PPP — מוגברת באופן דרמטי 89-קיפול בתאים HCC827 ו 231-קיפול בתאים PC-9 בהשוואה לרמות שנראו בבקרי PBS (איור 4). לעומת זאת, רמות של גליקוליטיק intermediates אחרות, כגון פרוקטוז 6-פוספט (F6P) ו פרוקטוז 1, 6-ביספופוספט (F1, 6P), לא שינוי במצב ניסיוני diamide (איור 4). סך הכול משמש כמעט שווה ערך בין הטיפול באמצעותdiamide לבין תנאי הבקרה PBS (איור 4), הרומז כי גלוקוז היה בעיקר ביטול באמצעות PPP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig1.jpg"> איור 1. מספרי תאים ללא שינוי על טיפול diamide. התגובות צמיחת תאים ל 250 יקרומטר של diamide נמדדו באמצעות טרימין כחול כתמים. מספרי תאים של (A) HCC827 ו-(ב) PC-9 תאים שטופלו PBS (כחול) או diamide (אדום; 250 μm) עבור 1 או 3 h מוצגים. נתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig2.jpg"> איור 2. הנציגה MS פסגות של מטבוליטים. Electropherograms מסומן כ (א) חומצה גלוקונאית, (ב) גלוקוז 6-פוספט (G6P), (ג) 6-פוספופגלוconate (6Pg), ו-(ד) ניקטינויד אדנוטין פוספט (NADP+) המתקבל על ידי ניתוח CE-MS. כל שורה מציינת את קו התא (מלא, HCC827; מנוקד, PC-9) וטיפול (כחול, PBS; אדום, diamide) בשימוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig3.jpg"> איור 3. פרופילים של מטבווליטים של החומר החשמלי התאיים. מקפלים שינויים של מטבוליטים ב (א) HCC827 ו (ב) PC-9 תאים שטופלו diamide מוצגים כיומן2(diamide/PBS). בסך הכל, 175 ו 150 מטבוליטים היו מוHCC827 בתאים PC-9, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59551/59551fig4.jpg"> איור 4. התקנה של PPP על טיפול diamide. ריכוזים תאיים (pmol/106 תאים) של מטבוליטים מפתח מעורב גליקוליזיס ומסלול פוספט פנטוז (PPP) לאחר הטיפול עם diamide מוצגים. מטבוליטים חולצו מ HCC827 ו-PC-9 תאים שטופלו PBS (כחול) או diamide (אדום, 250 μm) עבור 30 דקות. נציג מטבוליטים כגון חומצה gluconic, גלוקוז 6-פוספט (G6P), פרוקטוז 6-פוספט (F6P), 6 -פוספולגלוקונאט (6Pg), וניאוניאואיד אדנינויאמיד פוספט (nadp+) מוצגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59551/59551fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

המטרה של מאמר זה היא לתאר פרוטוקול להפקת מטבוליטים מימית מתאי חסיד מתורבת לניתוח metabolomic, במיוחד, אלקטרופורזה-במסה של נימים.

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול חזותי מפורט, צעד אחר צעד לחילוץ מטבוליטים ימיים מתאים סרטניים מתורבתים לניתוח מטבולום עוקב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות שלה ואת האמינות לחילוץ מטבוליטים מתאים חסידים. אבל מעל לכל, זה ממוטב היטב לניתוח מטבוליום באמצעות ספקטרומטריית מסת אלקטרופורזה נימית או CEMS.Metabolomics היא טכניקה רבת עוצמה לזהות סמנים ביולוגיים או גילוי סרטן בשלב מוקדם וחיזוי תגובה כימותרפית לחולי סרטן. אנו משתמשים בתאים סרטניים בהדגמה זו. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על מטבוליטים קציר מתאים חסידים אחרים כגון fibroblasts בתאי iPS.ריכוזי מטבוליט מנורמלים בהתבסס על מספר התאים קיימא. כל כך זהיר הכנה של תרבות, זה המפתח להשגת נתונים לשחזור טוב. המדגים את ההליך יהיה עמי מרויאמה, טכנאי מהמעבדה שלי.ראשית, צלחת HCC827 ותאי PC-9 במנות של 100 מילימטר המכיל 10 מיליליטר של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% סרום חזיר עוברי. מניחים את הכלים באינקובטור על 5% פחמן דו חמצני ו 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לתרבות. לאחר הדגירה, הטה בעדינות את מנות התרבות של 100 מ"מ כדי לשאוב את המדיה של תרבות התאים.לשטוף תאים על כל מנה באמצעות שני מיליליטר של תמיסת מלח פוספט-מאגר ללא סידן ומגנזיום. בעדינות רוק כל מנה, כך פתרון PBS מכסה לחלוטין את פני השטח של המנה, ולאחר מכן להטות את הכלים כדי לשוטוף את חיץ לשטוף. חם 0.25% פתרון טריפסין-EDTA ל 37 מעלות צלזיוס.עם פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר, להוסיף שני מיליליטר של פתרון טריפסין-EDTA מחומם לכל מנה. בעדינות רוק כל מנה, כך טריפסין מכסה לחלוטין את פני השטח של המנה. הדגירה את מנות התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך כחמש דקות.לאחר מכן, מוסיפים ארבעה מיליליטר של מדיום הצמיחה השלם החם מראש לכל מנה. ובעדינות פיפטה מספר פעמים כדי להשעות מחדש את התאים במדיום. מעבירים כל מתלה תא לצינור חרוט נפרד של 15 מיליליטר.צנטריפוגה ב 800 פעמים g במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש כל גלולת תא בשני מיליליטר של מדיום הצמיחה השלם שהתחמם מראש. מערבבים 10 מיקרוליטרים של ההשעיה התא עם 10 microliters של 0.4% פתרון כחול trypan, ב microtube 1.5 מיליליטר.לטעון 10 microliters של התערובת לתוך תא ספירת תא להחליק דרך פעולה נימי. הכנס את שקופית התא לתוך מונה התאים האוטומטי ולחץ על לחצן הלכידה כדי ללכוד את התמונה ולהציג את התוצאות של המספר הכולל ואת הכדאיות באחוזים של התאים. אם מספר התא הכולל הוא מעל 0.5 מיליון תאים למיליליטר, להוסיף מדיום צמיחה נוספת לצינור חרוט 15 מיליליטר כדי להשיג את ריכוז התא הרצוי.עכשיו, להוסיף שניים עד חמישה מיליליטר של התרבות לכל צלחת תרבות תאים 100 מ"מ לזרוע כאחד עד 2 1/2 מיליון תאים לכל מנה. הדגירה את מנות התרבות ב 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. ראשית, בבקבוק נפחי של 15 מיליליטר, לדלל פתרון סטנדרטי פנימי מסחרי המכיל L-Methionine סולפון וחומצה D-Camphor-10-sulfonic 1, 000-פי 000 במים אולטרה-חיים.ממיסים מניטול במים אולטרה-חמים כדי להכין תמיסת מניטול של 0.05 גרם למיליליטר במים אולטרה-חמים כחוצץ כביסה. לאחר מכן, לתוך המסנן של כל יחידת סינון צנטריפוגלית, פיפטה 250 מיקרוליטרים של מים אולטרה-חמים. מכסים את יחידות הסינון בחוזקה, וצנטריפוגה ב 9, 100 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.בדוק את עוצמת הקול של כל סינון. אם סינון משמעותי הצטבר במהלך הסיבוב הקצר הראשון, יחידת הסינון עשויה להיות פגומה. בטל את יחידת הסינון ולהשתמש ביחידת סינון חדשה במקום זאת.סגור את המכסים של יחידות הסינון בחוזקה צנטריפוגה שוב ב 9, 100 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. ודא כי לא נשארים מים אולטרה-חמים באף אחת מ כוסות הסינון, והסר את מי האולטרה-ure המסוננים בכל צינור איסוף עם פיפטה. מניחים את כוסות המסנן בחזרה לתוך צינורות האיסוף שלהם, ולהשתמש ביחידות סינון צנטריפוגלי בתוך שעה, כדי למנוע נזק על ייבוש.מוציאים את מנות התרבות של 100 מ"מ מהחממה ושואבים את מדיום תרבות התאים מכל מנה. הוסף 10 מיליליטר של מדיום תרבות PBS עם או בלי 250 דיאמיד micromolar לכל מנה, דואג לא להפריע שכבת התא. הדגירה את מנות התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר הדגירה, שאפו את מדיום תרבות התאים מכל צלחת תרבות של 100 מילימטר. להטות מעט את המנה, בעדינות להוסיף שני מיליליטר של 5% מניטול לשטוף חוצץ לקצה של כל מנה לשטוף את התאים, דואג לא להפריע שכבת התא. שאפו את חיץ הכביסה מכל תבשיל תרבות, ושטפו שוב את התאים על ידי הטיה קלה של המנה והוספת 10 מיליליטר של חיץ שטיפה למנה.לאחר מכן, שאפו לחלוטין את חיץ הכביסה מקצה כל מנה תרבותית. עכשיו, להוסיף 800 microliters של 99.7% מתנול לכל צלחת תרבות, בעדינות רוק כל צלחת תרבות קדימה ואחורה, כדי לכסות את כל פני השטח שלה. השאירו את הכלים בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות.מוסיפים באיטיות 550 מיקרוליטרים של הפתרון הסטנדרטי הפנימי המדולל למנה על ידי טבילת קצה הפיפיאט במתנול וצנרת בעדינות למעלה ולמטה, מספר פעמים. מטלטלים בעדינות כל צלחת תרבות הלוך ושוב כדי לכסות את כל פני השטח שלה, ומשאירים את הכלים בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. לאחר מכן, להעביר את הפתרון המופק מכל צלחת תרבות לצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה הצינורות ב 2, 300 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. העבר 700 מיקרוליטרים של כל על-טבעי לשתי יחידות סינון צנטריפוגליות, עם 350 מיקרוליטר ליחידה. צנטריפוגה צינורות המסנן ב 9, 100 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך כשעתיים, עד שלא נשאר נוזל ב כוסות המסנן.הסר את כוסות המסנן, וסגור היטב את המכסים של צינורות האיסוף. במחקר זה, תאי HCC827 ו- PC-9 גדלו באופן שווה במשך שלוש שעות. ניתוח CEMS מציין הבדל בין תאים שטופלו בדיאמיד לבין תאים שטופלו ב- PBS עבור שני קווי התאים.בין אלה, מספר מתווכים במסלול פוספט פנטוז ובגליקוליזה העליונה היו גבוהים משמעותית בתנאים שטופלו בדיאמיד, ואילו כמה ביניים מחזור tricarboxylic היו נמוכים יותר בתנאים המטופלים. פרופילי מטבוליום של מטבוליטים תאיים חשפו 175 ו 150 מטבוליטים דיפרנציאליים בתאי HCC827 ו- PC-9, בהתאמה. לאחר טיפול דיאמיד, רמת החומצה הגלוקונית והגלוקוז מחומצן גדלה פי 12 בתאי HCC827 ו-10 תתיאי PC-9.באופן דומה, רמת הגלוקוז 6-פוספט, גלוקוז זרחני במוצר הגליקוליזה הראשון של הקסוקינאז, גדלה גם היא פי 6.3 ו-3.5 בתאי HCC827 ו-PC-9, בהתאמה. בנוסף, רמות 6-phosphogluconate, הביניים הראשון במסלול פוספט פנטוז, גדל באופן דרמטי 89 קפל בתאי HCC827 ו 231-פי בתאי PC-9. לעומת זאת, רמות של מתווכים גליקוליטיים אחרים כגון פרוקטוז 6-פוספט לא השתנה במצב הניסיוני diamide.סה"כ רמות הפוספט של ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד היו כמעט שוות ערך בין טיפול בדיאמיד לבין תנאי בקרה של PBS. שימוש בתתבנת 5%mannitol, מלבד PBS, כחוצץ כביסה לתאי כביסה חשוב מאוד לניתוח CEMS, מכיוון שמאגרים מבוססי מלח מפריעים לניתוח ומשפיעים לרעה על המדידה. פרוטוקול זה אינו מתאים לחילוץ מטבוליטים הידרופוביים כמו שומנים, ולכן עלינו לפתח פרוטוקול לחילוץ נוח של מטבוליטים הידרופיליים והידרופוביים לניתוח מטבוליום מקיף יותר.טכניקה זו מבינה מיצוי קל של מטבוליטים כמעט מכל תאים חסידים, ולכן, ישים עבור מגוון רחב של מחקרים כגון סרטן, תאי גזע, פרמקולוגיה, תזונה, ומדעי הקוסמטיקה.

extraction-aqueous-metabolites-from-cultured-adherent-cells-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

האמינות של תוצאות בניסויי metabolomics תלוי באפקטיביות והשחזור של הכנת המדגם. תאר היא שיטה קפדנית ומעמיקה שבמאפשרת מיצוי של מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים עם האפשרות של המשך ניתוח עד אלפי תרכובות, או רק את שיעורי המתחם של עניין.

טכניקת הכנה רב שלבים לשחזר חוגים מתחם המטבוליט מרובים לעומק וניתוח Metabolomic אינפורמטיבי

פרוטוקול עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסת נימים באמצעות עיצוב ממשק טיפ נקבובי sheathless מוצג.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

מאמר זה מתאר שיטה לחקר חילוף חומרים תאי בקהילות מורכבות של סוגי תאים מרובים, תוך שימוש בשילוב של מעקב איזוטופים יציב, מיון תאים לבידוד סוגי תאים ספציפיים וספקטרומטריית מסה.

שיטה למדידת מטבוליזם ב ממוינות תת-אוכלוסיות של קהילות Cell מורכבות באמצעות איתור איזוטופ יציב

פרוטוקול מיצוי מקיף של שומנים, מטבוליטים חלבונים מ רקמות ביולוגיות באמצעות מדגם אחד מוצג.

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

אנו מתארים צעדים המאפשרים דיגום מהיר בתוך באתרו של חלק קטן של תא יחיד עם דיוק גבוהה, הפלישה מינימלי באמצעות נימי מיקרו-דגימה, כדי להקל על אפיון כימי של תמונת מצב של פעילות מטבולית חיים העוברים באמצעות אלקטרופורזה נימי תא בודד לפי הזמנה ספקטרומטר מסה פלטפורמה.

Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול יציב כדי לכמת 40 תרכובות מעורב מטבוליזם פחמן מרכזי ואנרגיה בתגובות סינתזה של חלבון-ללא תא. תערובת הסינתזה התאית היא ללעג עם אנילין להפרדה אפקטיבית באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשלב היפוך, ולאחר מכן כימות על-ידי ספקטרומטר מסה באמצעות מisotopically מתויג בתקנים פנימיים.

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

הפרוטוקולים מתארים שיטות כרומטוגרפיה נוזלית בעלות ביצועים גבוהים בשילוב עם אינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה לחקר תגובות מטבוליות במערכות מורכבות המבוססות על ליסאט ללא תאים.

כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב לאינדקס שבירה או זיהוי ספקטרומטרי מסה ליצירת פרופיל מטבוליט במערכות ללא תאים מבוססות ליסאט

פרוטוקול זה נועד לשמר מטבוליטים של תאים עבור ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) על ידי שילוב של שטיפת תמיסת מלח נדיפה, מרווה חנקן נוזלי מהיר, ייבוש בהקפאה ואחסון של -8 מעלות צלזיוס. הוא מדגים כי כיבוי חנקן נוזלי חיוני לשמירה על פרופילי מטבוליטים, בעוד שיש למזער אחסון קר ממושך כדי למנוע שינויים מטבוליים.

הכנת מדגם למחקרי מטבולומיקה של ספקטרומטריית מסה של תא בודד: שטיפת תאים משולבת, מרווה, ייבוש ואחסון

למדו פרוטוקול אמין לחילוץ מטבוליטים מתאי סרטן מתורבתים לניתוח מטבולומי באמצעות CEMS. השיטה מותאמת לתאים דבקים ומספקת תוצאות ברות-השוואה למחקרי סרטן ותרופות.

הפקת מיכלי מטבוליטים מחומרים מתורבתים מMetabolomic לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בספקטרומטר המסה

גלה סרטונים נוספים