מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים

פרוטוקול זה מדגים מתודולוגיות עבור מודל העכבר של פגיעה במוח הגולגולת טראומה טראומטית השתלת הגוף האנושי המושרה pluripotent שפעה התאים הנגזר לתוך האתר פציעה. מבחנים התנהגותיים והיסטולוגיים של תוצאות מהליכים אלה מתוארים גם בקצרה.

הפרוטוקול שלנו מדגים זרימת עבודה פרה-קלינית מקיפה לבדיקת היעילות הטיפולית של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם לאחר פגיעה מוחית. מודל זה של פגיעה מוחית טראומטית מספק רמה גבוהה של רב-תכליתיות ושחזור על ידי שליטה הדוקה בפרמטרים של הכוח המכאני ולכן מתן פגיעה מוגדרת היטב. הליכים אלה יכולים לשמש לחקר תהליכי פציעה והתאוששות באזורי מוח אחרים ושיטת ההשתלה נוחה לשימוש עם סוגי תאים רבים.

קידוח גולגולתי הוא מאתגר כמו הטכניקה דורשת זרז ידני כדי לשלוט בלחץ המתאים, מהירות, עומק, ותנועות חלקות. לתעד את כל האירועים ולתרגל בהרחבה. כדי לבצע craniectomy חד צדדי, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בעכבר הרדמה ולאבטח את העכבר במסגרת סטריאוטוקסית.

החל משחה אופתלמית אנטיביוטית על העיניים עם צמר גפן סטרילית ופתרון מבוסס יוד לאזור הקרקפת המגולח. מוציאים את היוד עם 70% אתנול ומכסים את החיה בווילון כירורגי. בצע חתך של 1.5 עד 2 ס"מ על הקרקפת ולהשתמש במטליות כותנה סטריליות כדי לנקות את הפצע ולנקות את הפאשיה משמאל לקו האמצע בברגמה.

השתמש בבדיקה משפיעה כדי לזהות את האתר craniectomy ולהגדיר את x שווה אפס, y שווה אפס נקודת התייחסות סטריאוטוקסית bregma. כוונן את הגשוש באופן משני מילימטרים משמאל לקווי האמצע. השתמשו בסמן עדין ובטוח בניתוח כדי לסמן עיגול בקוטר חמישה מילימטרים סביב אזור הפגיעה המשוער.

הרם וסובב את המשפיע מחוץ למיקום והשלם את עיגול חמשת המילימטרים. החזר בקצרה את המשפיע למקומו כדי לאמת את הדיוק של מעגל חמשת המילימטרים. לאחר מכן הרימו וסובבו את המשפיען מחוץ לעמדה ולהשתמש בכלי יד של ערכת מיקרו-מנוע סיבובית במהירות גבוהה המצויד בקצה עגול 0.6 או 0.8 מילימטר בר כדי ליצור חור פתוח בגולגולת במהירות מקסימלית של 70 עד 80%.

יש להפעיל לחץ אור על הגולגולת תוך כדי קידוח לאורך קווי המתאר ההיקפיים של חמשת המילימטרים בתוך גבול זה ולהשתמש במדפים כדי להרים את דש העצם שנוצר. קידוח דרך קווי תפר עשוי להציג קושי נוסף כמו העצם מופרעת ודורש לחץ נוסף. כלי הדם עשויים להיות בשיתוף הדוק ולכן אירועי דימום צפויים.

כדי לגרום לפגיעה קלה בקליפת המוח מבוקרת, נקה את הגשושית המשפיעה עם כרית הכנה לאלכוהול סטרילי והזז את גשוש המשפיע בחזרה למקומו מעל קליפת המוח החשופה. מנמיך את החללית עד שהיא נוגעת במשטח דורה מאטר ומסמן מיקום זה כ- z שווה לאפס. למשוך את הבוכנה ולעבור z שווה מינוס מילימטר אחד ולפריק את הבוכנה כדי להשפיע על קליפת המוח.

מיד להרים את הבוכנה ולהזיז את הזרוע מחוץ לעמדה להשקות את קליפת המוח עם נפח נדיב של מלוחים ולהשתמש תפרים קטע פשוט תפר משי 5-0 כדי לסגור את חתך הקרקפת. לאחר מכן לספק 10 מיליגרם לקילוגרם של Cyclosporine A על ידי הזרקה תת עורית לתוך scruff ולנחות את העכבר בכלוב נקי מראש מחומם לאחר הניתוח עם ניטור עד החלמה מלאה. בערך 24 שעות לאחר כריתת הקרניקטו, מניחים את העכבר בחזרה למסגרת הסטריאוטוקסית.

כסו את העכבר בווילון הכירורגי הפנסדור. Lavage אתר החתך עם מלוחים סטריליים כדי לנקות את האתר ולשחרר את התפרים. השתמשו במטלית כותנה ספוגה ב-70% אתנול כדי לעקר בעדינות את אתר החתך ולהשתמש בפינצטה עדינה וב מספריים עיניים כדי להסיר את התפרים.

ואז להשקות את האתר ניתוח craniectomy עם מלוחים סטריליים בשפע. במכסה המנוע biosafety של תאים, בעדינות מערבולת או הקש על הצינור של תאים כדי להבטיח השעיית תא הומוגני. השתמש micropipette לטעון כ 7.5 microliters של תאים לתוך מזרק המילטון דרך קצה הבוכנה.

מחזיק את המזרק בזווית של 120 מעלות עם קצה הבוכנה פונה כלפי מטה, להכניס את הבוכנה דואג לא להציג בועת אוויר בין ההשעיה ואת קצה הבוכנה. חבר את מכלול אטם למחט פיפטה ולחבר את המחט למזרק. לדחוף את הבוכנה כדי להזיז את ההשעיה התא לתוך מחט פיפטה ולחבר את המזרק למשאבת המזרק סטריאוטוקסי.

לקדם את הבוכנה כדי לוודא הרכבה משאבת מזרק עובד כראוי להעביר את המחט לתוך הקואורדינטות להזרקה. יישר את קצה המחט ל bregma ולהגדיר את x ו y-קואורדינטות לאפס. הזז את קצה המחט מעל כריתת הקרניקטו לשני מילימטרים צדדיים ומינוס אחורי מילימטר אחד כדי bregma ולגעת בקצה המחט אל פני השטח של דורה מאטר.

הרם את המחט מעט ואז בצע חתך קטן בדורה מאטר במקום שבו המחט יצרה קשר. הגדר את הקואורדינטות הסטריאוטוקסיות ל- z שווה לאפס ודחוף את הבוכנה כדי לאשר כי ההשעיה התא זורם כראוי לפני החדרת המחט לתוך המוח. הצג את המחט לתוך המוח לעומק של z שווה מינוס 1.4 מילימטרים כדי למקם את השתל בגבול החומר האפור / החומר הלבן של קליפת המוח העמוקה.

התחל את משאבת המזרק כדי להחדיר את ההשעיה התא על פני תקופה של 15 דקות. השתמש במיקרוסקופ למרחקי עבודה ארוכים כדי לפקח על זרימת ההשעיה של התאים להשקות את אתר הניתוח עם מלוחים סטריליים במהלך ההזרקה כדי לשמור על הידרציה של רקמות. כאשר כל התאים נמסרו, לאט למשוך את מחט ההשתלה ולהשקות את אתר הניתוח עם מלוחים נוספים לפני סגירת החתך עם תפרים חדשים.

לאחר מכן ספק טיפול לאחר הניתוח כפי שהוכח. לבדיקת הסרת סרט דבק, השתמש תחילה בסכין גילוח קטנה כדי לחתוך חתיכות צהובות ואדומים של סרט חשמלי לשלוש על חמש רצועות מילימטר על משטח זכוכית חלק. הכניסו את העכברים לחדר בדיקות ההתנהגות לפחות 30 דקות לפני הבדיקה ולהשתמש במטלית טיפול כדי לרסן את העכבר על ידי עורף הצוואר והגב כך שהעכבר יחזיק את הפותים הרחק מהגוף והראש שלו.

השתמש פינצטה כדי למקם רצועת דבק על פני השטח plantar של כל ציפורן ולהשתמש בלחץ אצבע עדין ועקבי כדי לאבטח את הרצועות לכפות הרגליים. מניחים במהירות את העכבר לתוך גליל פלסטיק ולהתחיל שני סטופרים כאשר העכבר יש את כל ארבע כפות על תיבת הבדיקה פלסטיק. לאחר מכן השתמשו בשני סטופרים כדי לתעד את האיחורים בהתראת כפות רגליים שמאליות, הסרת כפות רגליים שמאליות, התראת כף יד ימין והסרת כפות רגליים ימניות.

בניסוי פיילוט זה הושוותה תפקוד האנדלימב בכריתת המוח לבדה, פגיעה מבוקרת בפגיעה בקליפת המוח ועכברים נאיביים. עכברים שעברו ניתוח הראו איחורים מוגברים ארעיים כדי להבחין בגירויים דבקים במשך יום עד שלושה ימים מיד לאחר הניתוח וגירעונות ארעיים לאחר הניתוח בהסרה דבקית מהמצג ההפניה של ipsilateral. עכברים שעברו השפעה קליפתית מבוקרת, לעומת זאת, הציגו ליקויים משמעותיים בביצועים המוטוריים במצחיה לעומת הפציעה בהשוואה לעכברים נאיביים מהיום שלאחר הניתוח 28.

כשל חיסוני של מקטעי מוח עכבר עבור אנטיגן גרעיני אנושי מגלה כי שתלי תאים אנושיים ניתן להבדיל בבירור מרקמות מארחות בפציעה SHAM ומוחות השפעה קליפתית מבוקרת. עליך לבחון נהלי בטיחות מעבדה סטנדרטיים בעת טיפול בתאים אנושיים מתורבתים וכאשר מטפלים במחטי מזרק שבאים במגע עם מכרסמים או תרופות לדיכוי המערכת החיסון. ניתן לנתח מקטעי רקמת מוח לביטוי סמנים נוירו-אינפלציוניים מכיוון שיש ערך לדעת כיצד השתל משפיע על תגובת הפגיעה ברקמה המארחת ולהיפך.

הופתענו לגלות הבדלי מין עדינים בתוצאות ההתנהגות שלאחר הפציעה. כעת אנו חוקרים אם לסקס יש תפקיד בתגובה הנוירואימונית לפגיעה מוחית. ידיים יציבות, סבלנות ותרגול חיוניים לפיתוח טכניקת כריתת סרטן טובה.

נזק משני מכריתת קרניים לא נכונה יכול לסכן את האזור שאתה רוצה למקד להשתלת תאים.