אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)
20 ביוני 2019
פרוטוקול זה מתאר את השילוב של כרומטוגרפיה של החרגת מהגודל עם פיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל) לאפיון מוחלט של חלבונים ומכלולי מערכות בתמיסה. SEC-דוליטל קובע את המשקל המולקולרי והגודל של חלבונים טהורים, מקומיים מקוריים, הטרוקומנים וחלבונים משתנים כגון גליקורופטינס.
SEC-MALS היא שיטה כמותית לקביעת המשקל המולקולרי, הגודל וההתאמות של מקרומולקולות בתסרון. הוא יכול לזהות אוליגומרים ותסביפים, ולאפיין דגימות קשות, כמו גליקופרוטאינים וחלבוני קרום. SEC-MALS היא שיטה מוחלטת.
היא מסתמכת על פיזיקה בסיסית, אינה תלויה בשיתוף פעולה נגד סטנדרטים מולקולריים, קונפורמציה של המולקולה או האופן שבו אנו מתקשרים עם מדיום ההפרדה. ניתן להחיל SEC-MALS על מערכות רבות המופרדות באמצעות שניות. מפפטידים ופולימרים קטנים לחלבונים, נוקלאוקפזידים, פוליסכרידים, פולימרים סינתטיים, חלקיקים דמויי וירוס ווירוסים קטנים.
חשוב לוודא שהמערכת והמאגרים שלך מפספסים את המלצות הספק לתוכן חלקיקי נמוך. התייעץ עם נציג התמיכה הטכנית של הספק כדי להיות בטוח. התחל הליך זה עם הכנת מערכת SEC-MALS כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
באמצעות כל ריאגנטים בדרגת PLC, הכינו ליטר אחד של מלוחים עם זרחן עם נתרן כלורי 50 עד 100 מילימולרים. סנן את המאגר ל- 0.1 מיקרון באמצעות מסנן קצף תא פוליתר בבקבוקים, או דומה. סנן את 50 עד 100 המיליליטרים הראשונים של המאגר לבקבוק פסולת כדי לחסל את החלקיקים מהמסנן היבש.
לאחר מכן, סנן את השארית לבקבוק נקי וסטרילי שנשטף בעבר במים מסוננים, דה-מיוננים ונשמר כדי למנוע כניסת אבק. רוקן את העמודה בן לילה בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה כדי לצייד את העמודה במאגר ולהסיר חלקיקים. השתמש במצב הזרימה הרציף של ה- FPLC וודא שהזרימה לא תעצור עד להשלמת כל ריצות ה- SEC-MALS.
מקם את תא הזרימה DRI במצב ניקוי במהלך ריקון הלילה. בעת התחלת הסומק, שיפוע בהדרגה את קצב הזרימה כדי למנוע את אפקט שפיכת העמודות, הנגרם על-ידי שינוי פתאומי של הלחץ בעמודה. בטל את הטיהור לפני תחילת הפעלת הדגימה.
בדוק את ניקיון המערכת על ידי הקשה קלה על צינורות במורד הזרם של העמודה כדי לשחרר חלקיקים מצטברים. שימו לב לאות בגלאי של 90 מעלות בתצוגה הקדמית של מכשיר ה-MALS. ודא כי רעש השיא לשיא הוא לא יותר מ 50-100 microvolts.
כמו כן, ודא שאינדקס השחזור, או אות ה- RI, יציב לפחות מ- 1 1 פעמים עד למינוס שבע יחידות אינדקס שבירה. בצע זריקה ריקה כדי לוודא כי המזרק נקי מחלקיקים. ריק הוא פשוט המאגר פועל מוכן בקבוקון טרי, סטרילי.
אם שיא החלקיק הוא לא יותר ממיליליטר אחד בנפח, ולא יותר מחמישה מילי-וולט מעל קו הבסיס, אז המערכת מוכנה לדגימות. אחרת, לבצע זריקות ריקות נוספות עד נקי, או לבצע תחזוקה כדי לנקות את המזרק. עכשיו, להכין לפחות 200 microliters של BSA באחד עד שני מיליגרם למיליליטר במאגר SCC.
מסננים את החלבון ל-02 מיקרון, בעזרת מסנן קצה מזרק. השלך את הטיפות הראשונות של סינון, על מנת לחסל חלקיקים מן המסננים היבשים. לחלופין, צנטריפוגה המדגם ב 10, 000 פעמים G במשך רבע שעה כדי לאפשר משקעים של אגרגטים שאינם מסיסים וחלקיקים גדולים אחרים.
לאחר מכן, להזריק 100 microliters של פתרון BSA לתוך הלולאה. פתח ניסוי חדש מהשיטה בתפריט התוכנה MALS. לאחר מכן, בחר את השיטה המקוונת מתוך תיקיית שיטות המערכת של פיזור האור.
אם קיים גלאי DLS, בחר את השיטה המקוונת מהאור המתפזר עם תיקיית QELS. הגדר פרמטרים של השלב לדוגמה ותוייד במקטע התצורה. בתצוגת המשאבה הכללית, הגדר את קצב הזרימה לזה המשמש ב- FPLC.
לאחר מכן, נווט אל תצוגת המשאבה הכללית, ענף ממס, שדה שם ובחר PBS. בתצוגת המזרק, ענף לדוגמה, הזן את השם כ- BSA. הגדר dn/dc ל 0.185, להגדיר A2 עד 0, ולהגדיר את מקדם הכחדת UV ל 0.667 מיליליטר לס"מ מיליגרם.
במקטע שגרות, תצוגת אוסף בסיסית, בחר את הגורם המפעיל של תיבת הסימון בהזרקה אוטומטית. הגדר את משך הריצה ל- 70 דקות, כך שהנתונים ייאספו עבור הרמיזה כולה, עד להגעה לנפח ההזנה הכולל של עמודת ה- SEC. התחל את הניסוי בתוכנת MALS על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה.
הוא יתחיל לקרוא את הנתונים לאחר קבלת אות הדופק ממכשיר FPLC באמצעות גלאי MALS. אפס את אות ה- DRI על-ידי לחיצה על לחצן האפס האוטומטי בלוח הקדמי של הכלי. עבודה בתוכנת FPLC, לנווט ידנית, לבצע הוראות ידניות, להגדיר סימן, ולהכניס את שם החלבון ואת הריצה.
החלף את שסתום ההזרקה מעומס ידני כדי להזריק, מתחת לנתיב הזרימה, שסתום הזרקה. כלול אות פולס על-ידי החדרת פעימה של 0.5 שניות מתחת לפולס תיבת ה- IO דיגיטלי החוצה. פעולה זו תגרום לאיסוף נתונים בתוכנת MALS.
עכשיו, להזריק את הדגימה לתוך הלולאה. לחץ על בצע בתוכנת FPLC כדי להתחיל את הפעלת הניסוי. בצע ניתוח שלב אחר שלב, תחת המקטע שגרות בתוכנת MALS.
ודא שהפסגות מופיעות בערך באותו נפח רפסיסה ב- UV, MALS ו- RI על-ידי בדיקת תצוגת האוסף הבסיסית. בתצוגה הבסיסית, הגדר את קו הבסיס עבור כל האותות. בתצוגת פסגות, הגדר את הפסגות שיש לנתח על-ידי לחיצה וגרירה של העכבר.
בחר את 50% המרכזיים של כל שיא. תחילה בחר את שיא המונומר ולאחר מכן את השיא העמום יותר. מתחת לכל שיא, אמת את הערכים הנכונים של מקדם dn/dc והכחדה ב- 280 ננומטר עבור BSA.
בהליכים, תצוגת יישור, בחר את האזור המרכזי של הפסגות על-ידי לחיצה וגרירה של העכבר. לחץ על ישר אותות ולאחר מכן על אישור. בהליכים, תצוגת הרחבת הלהקה, בחר את ה-50% המרכזיים של פסגת המונומר.
ודא שגלאי האינדקס הש שבירה מצוין ככלי הייחוס. לאחר מכן לחצו על 'בצע התאמה' והחלו כדי להתאים את אותות פיזור ה-UV והאור לאות האינדקס השחזור. הגדל את התצוגה לפסגות כדי לוודא שהן חופפות באופן הדוק מאוד בתוך ה- 50 עד 70% המרכזי ולאחר מכן לחץ על אישור.
בהליכים, תצוגת נורמליזציה, בחר שיא אחד. הזן 3.0 ננומטר כערך RG, לחץ על לנרמל ולאחר מכן לחץ על אישור. הצג את גרף התוצאות בתצוגת הגרף של EASI.
בחר מסה טוחנת מהרשימה הנפתחת של התצוגה בחלק העליון של החלון. השתמש בפקד, לחץ וגרור כדי להגדיל את התצוגה לאזור השיא. כדי להציג את התוצאות הסופיות של מסה טוחה במשקל בטבלה עבור פסגות מונומר ועמעום, לנווט לתוצאות שיא, רגעי מסה טוחן, MW, ובחר את התוצאות, סיכום הדוח.
טוהר מדווח תחת תוצאות שיא, שבר מסה. מתפריט הקובץ, בחר שמור כשיטה ושמור את נתוני ה- BSA שנותחו כשיטה סטנדרטית למדידות עתידיות של כל סוגי החלבונים. פרמטרי הנורמליזציה והרחבת הלהקה שנקבעו עבור BSA יבוצעו בניתוח.
מוצגים כאן ניתוחי SEC-MALS של BSA, באמצעות עמודת אי הכללה בגודל נקבוביות אנגסטרום 200. עקבות כרומטוגרמה מנורמלות לשיא המונומר, ומוסטות לבהירות. חפצים נפוצים שניתן להתעלם מהם מצביעים, כולל פסגת חלקיקים בסמוך לתחילת אות פיזור האור, כמו גם מלח ופסגות אוויר מומסות ליד נפח החלחלה הכולל באות האינדקס השבר.
הכרומטוגרמה מציגה הפרדה מעולה בין מונומר לטרימר, ואות פיזור האור מפגין אות גבוה לרעש. ערכי המסה הטוסרים הממוצעים במשקל מונומר ועמעום מפגינים הומוגניות גבוהה. להלן דוגמאות לניתוחי SEC-MALS באיכות נמוכה.
בדוגמה זו, הפרדה לקויה בעמודת אי הכללה בגודל נקבובי אנגסטרום 75 גורמת לשיא חלקיקים בין שמונה לתשע דקות, זה לא מופרד היטב מהחלבונים. כאן, יש יחס אות לקוי לרעש, וחלקיקים נרחבים הסמוכים לחלבונים ניכרים באות פיזור האור. המפתחות לתוצאות טובות של SEC-MALS בוחרים עמודה מתאימה, ומבטיחים שהמערכת מכוילת ברעש פיזור אור נמוך, וסינון מראש או צנטריפוגה של הדגימות להסרת חלקיקים.
בעקבות SEC-MALS, דגימות חלבון ניתן לנתח עוד יותר עבור זיקה מחייבת, bioliza, תהודה פלסמון פני השטח, קלורימטריית טיטרציה איזותרמית, פרומטריה biolerid, תרמופורזה מיקרוסקאלית, או שיפוע הרכב, פיזור אור רב זוויתי. מבנה החלבון עשוי להיקבע על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, מיסקרוסקופיה קריו-אלקטרונית או NMR.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השילוב של כרומטוגרפיית הדירה לפי גודל עם פיזור אור רב-זוויתי (SEC-MALS) לצורך אפיון מוחלט של חלבונים וקומפלקסים בתמיסה. SEC-MALS קובע את המשקל המולקולרי ואת הגודל של חלבונים טהורים, אוליגומרים טבעיים, הטרקומפלקסים וחלבונים שעברו שינוי, כגון גליקופרוטאינים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- אפיון חלבונים
- כימיה אנליטית
רקע
- SEC-MALS היא שיטה כמותית לקביעת משקל מולקולרי וגודל.
- היא יכולה לזהות אוליגומרים וקומפלקסים, כולל גליקופרוטאינים.
- שיטה זו אינה נסמכת על סטנדרטים מולקולריים.
- ניתנת ליישום על מגוון רחב של מקרומולקולות.
מטרת המחקר
- מתן שיטה מהימנה לאפיון חלבונים בתמיסה.
- הקלה על ניתוח של דגימות ביולוגיות מורכבות.
- שיפור ההבנה של אינטראקציות ומבנים של חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של מערכת ה-SEC-MALS ושל הבאפרים.
- סינון ושטיפה של המערכת להבטחת ניקיון.
- הכנת דגימה והזרקתה למערכת ה-SEC-MALS.
- איסוף נתונים וניתוח באמצעות תוכנת MALS.
תוצאות עיקריות
- אפיון מוצלח של חלבונים וקומפלקסים.
- אימות ניקיון המערכת ושלמות הדגימה.
- קביעה מדויקת של משקלים מולקולריים וגדלים.
- זיהוי של אוליגומרים וקומפלקסים בדגימות.
מסקנות
- SEC-MALS היא שיטה יעילה לאפיון חלבונים.
- היא מספקת מדידות מוחלטות ללא תלות בתקנים.
- ניתן ליישם טכניקה זו על מגוון של מקרו-מולקולות ביולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטת SEC-MALS מספקת אפיון מוחלט של המשקל המולקולרי והגודל של חלבונים וקומפלקסים בתמיסה, ובכך היא מבטלת את ההסתמכות על סטנדרטים מולקולריים ומצמצמת את אי-הוודאות האנליטית בשלבי הגילוי המוקדמים. יכולת זו תומכת בתיקוף המטרה על ידי אישור המצב הביופיזיקלי של מועמדים טיפוליים, כולל אוליגומרים, אגרגטים ומינים משוערים כגון גליקופרוטאיןים. באמצעות אספקת נתונים כמותיים שאינם תלויים בקונופורמציה, SEC-MALS משפרת את הביטחון החזוי בהתנהגות החלבון, ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ומפחיתה סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים בשרשראות המו"פ של הביופארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאשר הומוגניות ומשקל מולקולרי של מונומרים של חלבון, אוליגומרים וקומפלקסים, ומאפשר הערכה מדויקת של שלמות המטרה הטיפולית.
- ערך תפעולי: מבחין בין שיווי משקל סטטי לדינמי של חלבונים, ומבהיר האם המינים שנצפו מייצגים מכלולים יציבים או אינטראקציות חולפות.
- ערך ניבוי: מזהה אגרגטים ואוכלוסיות הטרוגניות בשלב מוקדם, ובכך תומך בתיעדוף מועמדים מותאם סיכונים לפני השקעה בשלבים הבאים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מאפשר ניתוח של חלבונים שעברו מודיפיקציה, כגון גליקופרוטאינים וחלבונים מממברנה המומסים בדטרגנט, ובכך מרחיב את מגוון המטרות הניתנות לבדיקה במסעי סריקה.
- ערך תפעולי: מספק מדידות כמותיות ואבסולוטיות של המשקל המולקולרי בכל נפח אלואציה, מה שמקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה ועל השחזור שלה בין מעבדות שונות.
- תועלת הפלטפורמה: מייצר נתוני ייחוס עבור BSA וסטנדרטים אחרים שניתן לשמור כשיטות להרצות SEC-MALS עתידיות, ובכך מקדם שימוש חוזר ועקבי ברחבי הארגון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך באפיון של קומפלקסים חלבוניים וצורות שעברו מודיפיקציה הרלוונטיות למנגנוני מחלה, ובכך מגשר בין שלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: קובע האם מינים שנצפו נובעים ממודיפיקציה קוולנטית, אגרגציה לא ספציפית או אוליגומריזציה ספציפית, ובכך מבהיר את מנגנון הפעולה ואת הסיכונים בניסוח (formulation).
- סנכרון פרה-קליני: מספק נתונים על גודל וקונפורמציה מבוססי תמיסה המשלים טכניקות מבניות כגון cryo-EM או NMR, ומאפשר אפיון אינטגרטיבי של המטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
SEC-MALS משמשת כשלב אנליטי בסיסי ברצף הגילוי, הממוקמת לאחר ביטוי וטיהור חלבונים אך לפני בדיקות פונקציונליות או קביעת מבנה, ובכך מבטיחה שרק מולקולות שאופיינו כראוי ימשיכו בשלבי העבודה.
- ביולוגיה של הגילוי: מאשרת את המצב האוליגומרי והמונו-דיספרסיות של חלבונים מטוהרים, ובכך מפחיתה תוצאות חיוביות כוזבות במבחני מעורבות מטרה (target engagement) ובדיקות אותות.
- סקרים (Screening): מבטיחה שליגנדים חלבוניים או אנליטים המשמשים במבחני סריקה יהיו מוגדרים היטב והומוגניים, דבר המשפר את איכות הנתונים ואת שיעורי אישור הפגיעות (hit confirmation).
- אנליטיקה: מספקת נתונים של מסה מולרית ממוצעת משקל, גודל ושברי מסה, המאפשרים השוואה ישירה בין וריאנטים של חלבונים, מוטציות או תנאי פורמולציה.
- מחקר תרגומי: מאפיינת גליקופרוטאינים וקומפלקסים של חלבוני ממברנה בתנאים קרובים למצב הטבעי, ובכך תומכת ברלוונטיות של סממנים ביולוגיים (biomarkers) ובמחקרים של מנגנון פעולה.
- שימוש חוזר ארגוני: מאפשרת למעבדות לשמור שיטות מאושרות (למשל, מבוססות BSA) ליישום רחב במגוון פרויקטים, מה שמפחית את זמן פיתוח השיטות ומגדיל את הסביריות האנליטית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק קביעה מוחלטת של משקל מולקולרי ללא תלות בקונופורמציה, מה שמעלה את הביטחון בזיהוי המטרה ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מאפשר בדיקות התאמה של המערכת באמצעות הזרקות של דגימות ריק (blank) וניטור חלקיקים, מה שמבטיח הרצות ניתנות לשחזור וממזער ניסויים שנכשלו עקב זיהום.
- ערך אסטרטגי: תומך בזיהוי מוקדם של אגרגציה והטרוגניות, מספק מידע לפיתוח הפורמולציה ומפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים עקב חוסר יציבות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות go/no-go מבוססות נתונים על בסיס איכות ביופיזית, מה שמשפר את יעילות ההון ומקדם רק מועמדים בעלי אפיון מדויק.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיהור חלבונים, הכנת תמיסות בופר ותפעול מערכת SEC-MALS, כולל הליכי כיול ונורמליזציה של גלאי ה-MALS.
- תלוי בגישה למערכת SEC-MALS מכוילת עם גלאי פיזור אור ומדד שבירה בעלי רעש נמוך, ועמודות מתאימות (למשל, גודל נקבים של 200 Å עבור BSA).
- מחייב סינון קפדני של הדגימות והבופרים (0.1–0.2 μm) ושטיפת המערכת כדי לסלק חלקיקים שעלולים לפזר אור ולפגוע באיכות הנתונים.
- נדרש הזנה מדויקת של פרמטרים ספציפיים לחלבון, כגון dn/dc ומקדם כיבוי UV, בתוכנת ה-MALS לצורך חישובים תקינים של המשקל המולקולרי.
- מוגבל על ידי הצורך בדגימות מסיסות ומונו-דיספרסיביות; יש להסיר משקעים או אגרגטים גדולים באמצעות סנטריפוגציה או סינון לפני ההזרקה, כדי למנוע סתימה של העמודה וארטיפקטים באות.
