Name: שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: למד שיטה לעריכה גנטית של תאי CAR-T באמצעות CRISPR/Cas9 במהלך ייצור התאים. הפרוטוקול משפר את יעילות הטיפול ומפחית את רמת הרעילות בתאי T מכוונים נגד סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היתה נתמכת באמצעות מענקים מ K12CA090628 (SSK), הלאומי סרטן מקיף ברשת (SSK), מרכז הקליניקה של מאיו עבור הרפואה האישית (SSK), קרן Predolin (SSK), משרד מרפאת מאיו של תרגום לתרגול (SSK), ו התוכנית מדען רפואי מאיו מרפאת הדרכה רוברט ל. האוול מלגה מדען (RMS).

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של הלוח המוסדי של מרפאת מאיו (IRB) והועדה הביובטיטיתית המוסדית (IBC).
1. הפקת תא CART19
<ol><li>בידוד תא T, גירוי ותרבות vivo לשעבר<ol>
<li>לבצע את כל התרבות תאים העבודה במכסה של תרבות התא ניצול ציוד הגנה אישית מתאים. בציר דם היקפי בתאי מוננובית (PBMCs) מתוך מזוהה התאים הרגילים של התורם מקונוסים דם שנאספו במהלך apheresis כמו אלה ידועים להיות מקור בר קיימא של PBMCs.13
</li>
		<li>כדי לבודד את PBMCs, הוסף 15 מ ל של בינוני מעבר הדרגתי בצפיפות לצינור הפרדה בצפיפות 50 mL. לדלל את הדם התורם עם נפח שווה של מלוחים באגירה פוספט (PBS) המכיל 2% סרום עוברי העובר (FBS) כדי למנוע השמנה תא.<ol>
<li>להוסיף את הדם התורם מדולל מן החרוט לתוך צינור ההפרדה, להיזהר לא להפריע את הממשק בין הדם ואת הצפיפות מעבר הצבע בינוני. צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 10 דקות ב-RT.</li>
			<li>Decant-supernatant לתוך החדש 50 mL חרוטי, לשטוף עם PBS + 2% FBS על ידי הבאת עד 40 mL, צנטריפוגה ב 300 x g עבור 8 דקות ב-RT, ולאחר מכן, השעיית מחדש ב 40 mL של מאגר, ולספור תאים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בידוד תאים T מ-PBMCs באמצעות ערכת חרוזים מגנטית בחירה שלילית באמצעות מפריד תא אוטומטי לחלוטין בהתאם לפרוטוקול של היצרן.</li>
		<li>לתרבות התאים T מבודדים, להכין תא T בינונית (TCM) המורכבת 10% סרום AB האנושי (v/v), 1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (v/v), ו-סרום ללא המטפאות בינונית תא. לחטא את המדיום על ידי סינון באמצעות מסנן ואקום סטרילי 0.45 יקרומטר ולאחר מכן עם 0.22 יקרומטר מסנן ואקום סטרילי.</li>
		<li>ביום 0 (היום של גירוי התא T), לשטוף CD3/CD28 חרוזים לפני גירוי של תאי T. כדי לשטוף, למקם את הנפח הנדרש של חרוזים (להשתמש מספיק CD3/CD28 חרוזים ליחס של 3:1 חרוזים: T תאים; שים לב את הריכוז של חרוזים יכול להיות משתנה) בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 mL ו להשעות מחדש 1 מ ל TCM.</li>
		<li>. מקום בקשר עם מגנט</li>
		<li>אחרי 1 דקות, מטפי את TCM ולהשעות מחדש 1 מ ל של TCM טריים לשטוף את החרוזים.</li>
		<li>חזור על הליך זה עבור שלושה שוטפים בסך הכל.</li>
		<li>לאחר השטיפה השלישית, השהה מחדש את החרוזים ב 1 מ ל של TCM.</li>
		<li>. תספור את תאי הטי</li>
		<li>העברת חרוזים לתאי T ביחס של 3:1 חרוזים: תאים.</li>
		<li>לדלל תאים לריכוז הסופי של 1 x 106 תאים/mL.</li>
		<li>מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 24 שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>העברה והתמרה של תאים<ol>
<li>לבצע את העבודה האנטי ויראלית באמצעות BSL-2 + אמצעי זהירות, כולל ביגוד תרבות התא, ציוד מגן אישי, חיטוי של חומרים משומשים עם אקונומיקה לפני הסילוק.</li>
		<li>לרכוש מבנה CART19 בתוך וקטור לויראלי. הערה: המבנה CART19 מנוצל כאן תוכנן ולאחר מכן מסונתז דה נובו באמצעות מסחרית זמין מסחרי סינתזה החלבון. בניית הרכב שוכפלה לאחר מכן הדור השלישי לווירוס בשליטה של מקדם EF-1α. קטע האזור של משתנה הרשת נגזר משיבוט FMC63 ומזהה את CD19 האנושי. המבנה הCAR19 בעל דור שני 4-1BB מגירוי וגירוי CD3ζ (FMC63-41BBz). מיכל בן 12
</li>
		<li>ביצוע הפקה ויראלי כמתואר בעבר. מיכל בן 12<ol>
<li>בקצרה, כדי לייצר וירוס, לנצל תאים 293T שהגיעו 70-90% שליטה.</li>
			<li>אפשר דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר של ריאגנטים החצייה כולל 15 μg של הפלסטיות הפלאנטי ויראלי של עניין, 18 μg של מחסום במחסום/פול/תאת/הפוך אריזה וקטור, 7 μg של vsv-G מעטפה וקטור, 111 μl של הקדם-complexing מגיב, 129 μl של ה מגיב החצייה, ו 9.0 mL של מדיום החצייה לפני הוספת התאים 293T. לאחר מכן התרבות התאים הטרנסג ב 37 ° c, 5% CO2.</li>
			<li>הקציר, צנטריפוגה (900 x g עבור 10 דקות), מסנן (0.45 מסנן ניילון μM), ולהתרכז supernatant ב 24 ו 48 h על ידי ביטול הארכה ב או 13,028 x g עבור 18 h או 112,700 x g עבור 2 h.</li>
			<li>הקפא ב-80 ° c לשימוש עתידי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ביום 1, בעדינות מחדש את התאים t כדי לשבור את רוזטות טות של תאי t שהיו מגורה על 1 x 106/mL ביום 0.</li>
		<li>תחת המתאים BSL-2 + אמצעי זהירות עבור כל העבודה האנטי ויראלית, להוסיף וירוס טרי או מוקפא לתאי T מגורה בריבוי של זיהום (מוי) של 3.0.</li>
	</ol></li>
	<li>רכב-T הרחבה תא<ol>
<li>במהלך שלב של התרחבות, להמשיך להוסיף את תאי T מתתמרים ב 37 ° c, 5% CO2. ספירת רכב-T תאים בימים 3 ו-5, ולהוסיף טריים, מחומם מראש כדי התרבות כדי לשמור על מכונית-T ריכוז תא של 1 x 106/Ml.</li>
		<li>הסרת חרוזים מתאי T שעברו התמרה 6 ימים לאחר גירוי (יום 6) באמצעות מגנט. קציר, השהה מחדש, והמקום תאים T ב 50 מ"ל צינורות חרוטי ב מגנט עבור 1 דקות. לאחר מכן לאסוף את supernatant (מכיל את התאים-T רכב), ולהשליך את החרוזים.</li>
		<li>למקם את התאים שנאספו-T בחזרה בתרבות בריכוז של 1 x 106 תאים/mL כדי לחדש את ההתרחבות.</li>
		<li>ביום 6, לאמוד את הביטוי פני השטח של המכונית על ידי הזרמת cy, לנסות. הערה: מספר שיטות ניתן להשתמש כדי לזהות את הביטוי פני השטח של מכונית, כגון כתמים עם העין אנטי עכבר IgG (H + L) חוצה-adsorbed נוגדן משני או על ידי הצביעת עם CD19 פפטיד מסוים, מצועם ל fluorochrome. כאן, לקחת סדרת מחלקים (כ 100,000 T תאים) מן התרבות ולשטוף עם מאגר זרימה הכין עם מלוחים פוספט באגירה של dulbecco, 2% סרום העוברי העובר, ו 1% נתרן azide. להכתים את התאים עם נוגדן נגד מכונית ולשטוף פעמיים. הכתם את התאים עם כתם חי/מת ונוגדנים CD3 שבטיים (OKT3). שטוף את התאים והשהה מחדש במאגר הזרימה. לרכוש על cytometer כדי לקבוע התמרה יעילות.</li>
	</ol></li>
	<li>הקפאה קריוגנית<ol>
<li>כדי הקציר והקפאת המכונית-T תאים 8 ימים לאחר גירוי (יום 8 של הרחבת התא T), לקצור את התאים מן התרבות.</li>
		<li>ספין למטה עבור 5 דקות ב 300 x g.</li>
		<li>להשעות מחדש ב הקפאה בינונית ב 10,000,000 תאים לכל mL למבחנה בהקפאה בינונית המורכבת 10% דימתיל תיל סולפוקסיד ו 90% העובר סרום.</li>
		<li>להקפיא במיכל קפוא כדי להשיג שיעור קירור של 1 ° c/min ב-80 מקפיא ° c ולאחר מכן להעביר לחנקן נוזלי אחרי 48 h.</li>
		<li>לפני השימוש שלהם בתוך מבחנה או בניסויים vivo, הפשרת תאים רכב T ב-TCM חם.</li>
		<li>לשטוף את התאים כדי לדלל ולהסיר את diמתיל סולפוקסיד ולהשעות מחדש לריכוז של 2 x 106 תאים/ML ב TCM חם. מנוחה ללילה ב 37 ° c, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. GM-שדרתי הייצור k/o CART19
<ol><li>כדי לשבש את מג-שדרתי, לנצל את מדריך RNA (grna) המיקוד אקסון 3 של האדם GM-שדרתי (CSF2) נבחר באמצעות הקרנת grna בעבר דיווחו כי יש יעילות גבוהה עבור הגן CSF2 המקודד עבור ציטוקינים האנושית GM-שדרתי. מיכל בן 14 הערה: מחקר מסחרי מסונתז כיתה Cas9 הדור השלישי לבנה ויראלי המכיל gRNA זה (תחת מקדם U6) שימש. המבנה מכיל גן התנגדות מpuromycin. הרצף של הגרנה הוא גאקTGCCTGACTTTTTTTTTT. מיכל בן 12
</li>
	<li>כדי לייצר וירוס, לנצל 293T תאים שהגיעו 70-90% שליטה.</li>
	<li>הרשו 15 μg של הפלסטיות הפלנגיאני של הריבית, 18 μg של מחסום במחסום/פול/תאת/הפוך אריזה וקטור, 7 μg של VSV-G מעטפה וקטור, 111 μL של הגיב טרום השלמת, 129 μL של מגיב החצייה, ו 9.0 mL של בינונית העברה כדי דגירה עבור 30 דקות בחדר te . מטבע הספרות</li>
	<li>הוספת ריאגנטים לזיהום ה293t תאי t. ואז התרבות ב 37 ° c, 5% CO2.</li>
	<li>הקציר, צנטריפוגה (900 x g עבור 10 דקות), מסנן (0.45 מסנן ניילון μM) ולהתרכז supernatant ב 24 ו 48 h על ידי ביטול הארכה ב-13,028 x g עבור 18 h או 112,700 x g עבור 2 h ו להקפיא ב-80 ° צ' לשימוש עתידי.</li>
	<li>ביום 1, השהה מחדש בעדינות את תאי T כדי להפריד בין רוטות.</li>
	<li>ב BSL-2 + מעבדה מאושרת, להוסיף וירוס קפוא או שנקטפו טרי לתאי T מגורה כדי ליצור תאים מכונית-T. השני תאים עם שניהם CAR19 הנגיף ו-GM-שדרתי מיקוד כשנגיף CRISPR. הוספת CAR19-וירוס ב-משרד הבית של 3. מאז טיטור של הנגיף crispr לא ניתן לביצוע, שימוש חלקיקי וירוס שנוצר מ 15 הכנה בלתי מבוקר הפלסטיות לשנות 10 x 106 תאים T.</li>
	<li>עיין בשלבים הנותרים של גירוי בתאי T, התרחבות והקפאה כמתואר בשלב 1.
</li>
	<li>עבור lentiCRISPR-בעריכת תאי T הנושאים puromycin עמידות, לטפל בתאים עם puromycin דיהידרוטסטוסטרון בריכוז של 1 μg של puromycin per 1 mL ביום 3 ויום 5.</li>
</ol>3. GM-שדרתי שיבוש יעילות והערכה פונקציונלית של GM-שדרתי k/o CART19
<ol><li>בדיקות וניתוח מעקב אחר הפרעות ברצף<ol>
<li>כדי לסדר את הריבית בגנים של ג'נרל מוטורס, השתמש בצבעי היסוד הבאים. להשתמש ברצף פריימר קדימה עבור GM-שדרתי (CSF2) של TGACTACAGAGGCACAGA, ואת הרצף פריימר הפוכה של TCACCTCגנול ACCTCATTAACC.</li>
		<li>לחלץ DNA מ עד 5,000,000 מכונית-T תאים עם ערכת החילוץ גנומית. עבור התגובה PCR, השתמש 25 μl של מיקס מאסטר taq לכל תגובה עם ריכוז סופי של כל פריימר בתגובת ה-pcr של μm, 0.1-0.5 μg של DNA תבנית, וכמות כוללת של תגובת ה-PCR הביא עד 50 μl עם מים חינם נוקלאז.</li>
		<li>עיין בתנאי האופניים של ה-PCR המתוארים בטבלה 1.</li>
		<li>הפעל דגימות PCR על 1-2% agarose ג'ל ב 100 V עבור 30 דקות ולחלץ באמצעות ערכת החילוץ ג'ל.</li>
		<li>. רצף הגברה של הPCR חשב את תדירות השינוי של אלל על-ידי העלאת נתונים גולמיים לתוכנת גאות מתאימה. מיכל בן 15
</li>
	</ol>
</li>
	<li>GM-שדרתי הייצור והערכה פונקציונלית של GM-שדרתי CART19k/o<ol>
<li>כדי לקבוע את הייצור ציטוקינים של מכונית-T תאים, דגירה סוג פראי CART19 תאים GM-שדרתיk/o CART19 עם CD19 ביטוי חריפה לוקמיה לימפובלסטית קו NALM6 ביחס 1:5 עבור 4 h ב 37 ° צ', 5% CO2 בנוכחות monensin הפתרון, האנטי-אנושי CD49d, CD28 אנטי-אנושי והCD107a האנטי-אנושי.</li>
		<li>הקציר תאים מהתרבות עבור cy, לזרום הציטונסה. לשטוף את התאים עם מאגר cy, הזרימה. כתם את התאים עם ערכת מכתים חי/מת. מודטה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. תקן את התאים עם מדיום קיבעון ו-דגירה בחושך בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.</li>
		<li>לאחר כביסה, כתם את התאים הintracellularly עם בינוני החדירות בשילוב עם נוגדן אנטי אנושי IFNγ שבטיים, אנטי אדם GM-שדרתי, אנטי אדם MIP-1β, אנטי אדם IL-2, ו אנטי אדם CD3 ו דגירה בחושך בטמפרטורת החדר עבור 30 min. שטוף והשהה מחדש את הדגימות. לרכוש דגימות על cytometer זרימה מנותח עבור אחוז של הביטוי התאיים GM-שדרתי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kenderian, S. S., Ruella, M., Gill, S., Kalos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+to+target+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T-cell therapy to target hematologic malignancies.</a> Cancer Research. 74 (22), 6383-6389 (2014).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Neelapu, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axicabtagene+Ciloleucel+CAR+T-Cell+Therapy+in+Refractory+Large+B-Cell+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+Children+and+Young+Adults+with+B-Cell+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in Children and Young Adults with B-Cell Lymphoblastic Leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Schuster, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+in+Refractory+B-Cell+Lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor T Cells in Refractory B-Cell Lymphomas.</a> The New England Journal of Medicine. 377 (26), 2545-2554 (2017).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Gust, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Activation+and+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+Neurotoxicity+after+Adoptive+Immunotherapy+with+CD19+CAR-T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Endothelial Activation and Blood-Brain Barrier Disruption in Neurotoxicity after Adoptive Immunotherapy with CD19 CAR-T Cells.</a> Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).</li>
<li>Fitzgerald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Release+Syndrome+After+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cell+Therapy+for+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Critical Care Medicine. 45 (2), e124-e131 (2017).</li>
<li>Liu, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome+editing%3A+Fueling+the+revolution+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome editing: Fueling the revolution in cancer immunotherapy.</a> Current Research in Translational Medicine. 66 (2), 39-42 (2018).</li>
<li>Ren, J., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+chimeric+antigen+receptor+T+cell+therapy+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9.</a> Protein Cell. 8 (9), 634-643 (2017).</li>
<li>Sterner, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+inhibition+reduces+cytokine+release+syndrome+and+neuroinflammation+but+enhances+CAR-T+cell+function+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Dietz, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+leukoreduction+system+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers.</a> Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
</ol>

SSK הוא ממציא על פטנטים בתחום של מכונית T-cell טיפול אשר מורשים Novartis (תחת הסכם בין מאיו קליניק, אוניברסיטת פנסילבניה, ונוברטיס). מחקרים אלה מומנו בחלקו על ידי מענק של הומניגה (SSK). RMS, MJC, RS, ו-SSK הם ממציאים על פטנטים הקשורים לעבודה זו. המעבדה (SSK) מקבלת מימון מ סובלנות, הומניניאן, עפיפון, לנטיגן, מורורסיס, ואקטינום.

בדו ח זה, אנו מתארים מתודולוגיה לניצול CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה כדי לגרום שינויים משניים בתאי רכב-T. באופן ספציפי, זה מוצג באמצעות התמרה ויראלית עם וקטור ויראלי המכיל gRNA מיקוד הגן של עניין Cas9 לייצר GM-שדרתי התאיםk/o CART19. הצגנו בעבר כי הניטרול של GM-שדרתי נטרול קילה CRS ו-NT במודל מבע. 12 כפי שתוארה בעבר, GM-שדרתי מכוניותk/o מכונית T לאפשר עיכוב של gm-שדרתי במהלך תהליך הייצור, ביעילות להפחית את הייצור של gm-שדרתי תוך שמירה על פונקציות קריטיות אחרות תא T, והתוצאה משופרת הפ...

שצ קולטן אנטיגן T (רכב-T) טיפול תא מציג הבטחה גדולה לטיפול בסרטן. מיכל בן , 2 שתי מכונית-T טיפולים תא המיקוד CD19 (CART19) אושרו לאחרונה בארצות הברית הצהיר ובאירופה לשימוש B ממאירות תא לאחר הוכחת תוצאות מדהימות ב מולטיב להיכנס ניסויים קליניים. מיכל שלוש , ד , 5 מחסומים לשימוש נרחב יותר של מכונית-T תאים הם פעילות מוגבלת של גידולים מוצקים ורעלים משויכים כולל תסמונת השחרור ציטוקינים (CRS) ו רעילות נוירו (NT). מיכל שלוש , מיכל 5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9 כדי לשפר את המדד התרפויטי של מכונית-t טיפול בתאים, הנדסת הגנום כלים כגון נוקלאוסים אצבע אבץ, talens, ו CRISPR מועסקים לשנות עוד יותר תאים מכונית-t בניסיון לייצר פחות רעיל או יעיל יותר מכונית-t תאים. מיכל עשור , מיכל בן 11
במאמר זה, אנו מתארים שיטה כדי ליצור CRISPR/Cas9 לערוך תאים רכב-T. המטרה הספציפית של שיטה זו היא לשנות גנטית בתאי רכב-T במהלך ייצור תא רכב-T באמצעות CRISPR/Cas9 כדי ליצור פחות רעיל או יעיל יותר מכונית-T תאים. הרציונל לפיתוח מתודולוגיה זו בנויה על הלקחים שנלמדו מניסיון קליני של הטיפול בתאי רכב T, אשר מצביע על צורך דחוף אסטרטגיות הרומן כדי להגביר את החלון הטיפולי של המכונית-T טיפול בתאי ולהרחיב את היישום לתוך גידולים אחרים נתמך על ידי ההתקדמות האחרונה בביולוגיה סינתטי המאפשר שינויים מרובים של תאים רכב-T שהתחילו להיכנס למרפאה. בעוד כמה כלים הנדסת הגנום מפותחים ומיושמים בהגדרות שונות, כגון נוקלאוסים אצבע אבץ, TALENs, ו CRISPR, המתודולוגיה שלנו מתארת CRISPR/Cas9 שינוי של תאים מכונית-T. מיכל עשור , 11 crispr/Cas9 הוא מנגנון RNA מבוססי הגנה בקטריאלי אשר נועד לחסל DNA זר. CRISPR מסתמך על האנונוקיטיות כדי לדבוק רצף היעד מזוהה דרך RNA מדריך (gRNA). העריכה CRISPR של התאים רכב-T מציע מספר יתרונות על פני כלים אחרים הנדסת הגנום. אלה כוללים דיוק של רצף gRNA, פשטות לעצב gRNA מיקוד את הגן של עניין, גבוה לעריכת היעילות של הגן, ואת היכולת למקד גנים מרובים מאז Grna מרובים ניתן להשתמש באותו זמן.
באופן ספציפי בשיטות המתוארות כאן, השתמשנו בקידוד מדריך CRISPR לקודד וירוס RNA ו Cas9 לשבש גן במהלך התמרה מכונית של תאי T. בבחירת הטכניקה המתאימה כדי לערוך מכונית T תאים, אנו מציעים את הטכניקה המתוארת כאן הוא מנגנון יעיל כדי ליצור מחקר כיתה תא רכב T, אבל בגלל ההשפעה לטווח ארוך של שילוב קבוע של Cas9 לתוך הגנום אינו ידוע, אנו להציע מתודולוגיה זו כדי לפתח הוכחה של מחקר המושג תאים-T בכיתה רכב, אבל לא להפקת טוב בפועל ייצור תאים מכונית-T.
בפרט, כאן אנו מתארים את הדור של גרנולוציט מקרופאג המושבה גורם מגרה (GM-שדרתי) הסתרה מכונית T תאים מיקוד האדם CD19. אלה תאי רכב-T נוצרו על ידי התמרה עם חלקיקים לקידוד מדריך RNA ספציפי GM-שדרתי (שם גן CSF2) ו Cas9. בעבר מצאנו כי הניטרול של GM-שדרתי הCRS קילה ו-NT במודל מבע. 12 GM-שדרתי מכוניותk/o -T תאים לאפשר עיכוב של gm-שדרתי במהלך תהליך הייצור, ביעילות להפחית את הייצור של gm-שדרתי תוך שיפור הרכב-T תא אנטי גידול פעילות והישרדות vivo לעומת ווילטיפ רכב-t תאים. 12 לכן, כאן אנו מספקים מתודולוגיה כדי ליצור CRISPR/CAS9 לרכב תאים T.

<table><tbody><tr><td>CD3 נוגדן חד שבטי (OKT3), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0037-42</td><td></td></tr><tr><td>CD3 נוגדן חד שבטי (UCHT1), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0038-42</td><td></td></tr><tr><td>Choice Taq Blue Mastermix</td><td>Denville Scientific</td><td>C775Y51</td><td></td></tr><tr><td>CTS (מערכות טיפול בתאים) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>בקמן קולטר</td><td>C10343</td><td>ציטומטר זרימה</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט של Dulbecco</td><td></td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S (רכז חלקיקים מגנטיים)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Easy 50 EasySep מגנט</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ערכת בידוד תאי T אנושיים&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17951</td><td>חרוזים מגנטיים לבחירה שלילית; 17951RF כולל טיפים וחוצץ</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>FITC עכבר אנטי-אנושי CD107a&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>555800</td><td></td></tr><tr><td>קיבוע בינוני (בינוני A)</td> <td>Invitrogen</td><td>GAS001S100</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR gRNA מבנה: שם: CSF2 מדריך CRISPR RNA 1; מינים: אדם, וקטור: pLentiCRISPR v2; התנגדות: אמפיצילין; מספר עותק: גבוה; הכנת פלסמיד: משלוח סטנדרטי: 4 &mu; g (חינם של טעינה)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>של עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td></td></tr><tr><td>https://tide.nki.nl.</td>סרום AB אנושי <td>של Desktop Genetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>; תורמים גברים; סוג AB; </td><td>קורנינג</td> ארה<td>"ב 35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>IFN גמא נוגדן חד שבטי (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>47-7319-42</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>L3000075</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים לתיקון, לעירור 405 ננומטר</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07851</td><td></td></tr><tr><td>Monensin Solution, 1000X</td><td>BioLegend</td><td>420701</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD28 שיבוט CD28.2</td><td>BD Pharmingen</td><td>559770</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD49d שיבוט 9F10</td><td>BD Pharmingen</td><td>561892</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי MIP-1&beta; PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>560687</td><td></td></tr><tr><td>מיכל הקפאה Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NALM6, שיבוט G5&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3273</td><td>קו תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה</td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Promega</td><td>P119C</td><td></td></tr><tr><td>Olympus מערכות מסנן ואקום, 500 מ"ל, קרום PES, 0.22uM, סטרילי</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow יחידות מסנן חד פעמיות סטריליות עם קרום CN 0.45uM</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>450-0045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת בינוני (1X), נוזלי</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 עכבר אנטי אנושי IL-2</td><td>BD Horizon</td><td>562384</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (100X), נוזלי</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חדירות (בינוני B)</td><td>Invitrogen</td><td>GAS002S100</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>MP Biomedicals, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל 0210055210 QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>חולדה אנטי אנושית GM-CSF BV421</td><td>BD Horizon</td><td>562930</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep-S</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>21000</td><td>מפריד תאים אוטומטי לחלוטין</td></tr><tr><td>SepMate-50 (IVD)</td> <td>STEMCELL Technologies</td><td>85450</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד, 5% (w/v)</td> <td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 תאים המטופויאטיים ללא סרום</td><td>Lonza</td><td>בינוני 04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש crispr/cas9 כדי לשדוד את gm-שדרתי ב-t מכונית תאים

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

צ ' ושמעון אנטיגן לקולטן T (רכב-T) הטיפול בתאים הוא קצה חיתוך ואפשרות הטיפול המהפכני החדש של סרטן. עם זאת, ישנן מגבלות משמעותיות לשימוש נרחב בטיפול בסרטן. מגבלות אלה כוללות פיתוח של רעלים ייחודיים כגון תסמונת השחרור ציטוקינים (CRS) ו רעילות נוירו (NT) והרחבה מוגבלת, פונקציות אפקטור, ופעילות נגד הגידול בגידולים מוצקים. אסטרטגיה אחת כדי לשפר את היעילות רכב-T ו/או בקרת רעלים של תאי רכב-T היא לערוך את הגנום של התאים רכב-T עצמם במהלך ייצור תא רכב T. כאן, אנו מתארים את השימוש CRISPR/Cas9 gene העריכה בתאי רכב-T באמצעות התמרה עם בניית לנטינגיזציה המכילה RNA מדריך כדי גרנולוציט מקרופאג המושבה מגרה גורם (GM-שדרתי) ו Cas9. כדוגמה, אנו מתארים CRISPR/Cas9 בתיווך מתווכת של GM-שדרתי. הראינו כי אלה מוטורס-מכוניות מסוגk/o מכונית T לייצר ביעילות gm-שדרתי פחות, תוך שמירה על פונקציית התאים הקריטיים t ותוצאה של פעילות אנטי סרטניים משופרת vivo לעומת מסוג פראי רכב-T תאים.

איור 1 מראה הפחתה של gm-שדרתי ב gm-שדרתי CART19 תאיםk/o . כדי לוודא כי הגנום של התאים T שונתה לנוקאאוט GM-שדרתי, רצף הגאות שימש בתאי GM/o CART19 (איור 1a). רכב-T תא המשטח הצביעת מוודאת כי התאים T לבטא בהצלחה את קולטן פני השטח של המכונית בחוץ גופית על ידי העליה על live CD3 + תאים (איור 1B). כתמים תאיים של GM-שדרתי על ידי הזרימה cy, לנסות ממחיש ירידה ביטוי של GM-שדרתי ב GM-שדרתי C...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לערוך גנטית לרכב-T תאים דרך CRISPR/Cas9 מערכת.

שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

הפרוטוקול שלנו מתאר את השינוי הגנטי של תא CAR-T במהלך הייצור שלהם באמצעות טכנולוגיית CRISPR כדי ליצור מוצר יעיל יותר ופחות רעיל. היתרון של טכניקה זו הוא כי ייצור תא CAR-T ומניפולציה גנטית יכולים להתרחש בתא אחד עם יעילות טובה. הדגימה של ההליך תהיה רוזלי סטרנר, דוקטורנטית לרפואה, מישל קוקס, טכנולוגית וסטודנטית לתואר שני, וראונה סאקורה, פוסט דוקטורטורית, מהמעבדה שלי.לאחר בידוד תאי T מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי שנקטפו, התחל ללטף אותם על-ידי הכנת מדיום תאי T ולאחר מכן עיקורו על-ידי סינונו באמצעות מסנן ואקום סטרילי של 0.45 מיקרומטר ולאחר מכן באמצעות מסנן ואקום סטרילי של 0.22 מיקרומטר. ביום של גירוי תא T או יום אפס, לפני הגירוי, לשטוף חרוזי CD3/CD28 על ידי הצבת נפח הנדרש של חרוזים בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר ו resuspending במיליליטר אחד של TCM. מניחים את הצינור במגע עם מגנט לדקה אחת.לאחר מכן שאפו את ה- TCM והקדישו מיליליטר אחד של TCM טרי לשטוף שוב את החמרוזים ולחזור על סך של שלוש שטיפות. ולבסוף, תן שימוש חוזר גם את חרוזים במיליליטר אחד של TCM. לאחר ספירת תאי ה- T, העבר את חרוזים לתאי T ביחס של שלושה עד חרוזים אחד לתאים.לאחר מכן לדלל את התאים לריכוז סופי של מיליון תאים למיליליטר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 במשך 24 שעות. לאחר רכישת מבנה CART19 בווקטור lentiviral, לבצע ייצור lentiviral על ידי הדגירה הראשונה lentiviral פלסמיד, וקטור אריזה, וקטור מעטפה, reagent precomplexing, reagent transfection, ו מדיום transfection בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לבצע עבודה lentiviral באמצעות BSL2 + אמצעי זהירות כולל מכסה המנוע תרבות התא, ציוד מגן אישי, וחיטוי של חומרים משומשים עם אקונומיקה לפני סילוק.לאחר הדגירה, הוסיפו את אותם רה-גנטים טרנספקטיים ל-293 תאי T שהגיעו ל-70%-90% קונפלונציה ותרבות התאים המרובים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5%CO2. ב 24 ו 48 שעות לאחר transfection, קציר, צנטריפוגה, לסנן ולרכז על טבעי המכיל וירוסים על ידי אולטרה צנטריפוגה להקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. ביום הראשון, תן שימוש חוזר בעדינות בתאי T שעוררו במיליון תאים למיליליטר ביום אפס כדי לשבור את רוזט התאים.תחת אמצעי זהירות מתאימים BSL2+, להוסיף וירוס טרי או קפוא שנקטפו לתאי T מדומה בריבוי של זיהום של 3.0. המשך להדרגר את תאי T מתומרים ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2. בימים 3 ו-5, לספור תאי CAR-T ולהוסיף TCM מחומם מראש טרי לתרבות כדי לשמור על ריכוז תא CAR-T של מיליון תאים למיליליטר.שישה ימים לאחר הסימולציה, להסיר חרוזים מן תאי T מתומרים על ידי קציר הראשון ו resuspending התאים. מעבירים את התאים בצינורות חרוטיים 50 מיליליטר ומ מניחים את הצינורות במגנט למשך דקה אחת. לאחר איסוף CAR-T תא המכיל supernatant והשליכת חרוזים, למקם את התאים בחזרה בתרבות בריכוז של מיליון תאים למיליליטר בבקבוק תרבות.השתמש בדגימת תאים עבור ציטומטריית זרימה כדי להעריך את ביטוי פני השטח של רשות האישורים. הדגירה את השאר כדי לחדש את ההתרחבות ולאחר מכן לקצור ול Cryo-לשמר את התאים ביום שמונה כמתואר בכתב היד. כדי לשבש את הגורם מגרה מושבת מקרופאג גרנולוציטים, השתמש במדריך RNA כמתואר בכתב היד.דגירה reagents transfection בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו אותם ל-293 תאי T שהגיעו ל-70%-90% קונפלונציה ותרבות התאים המפוסלים ב-37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 כדי לייצר lentivirus. ב 24 ו 48 שעות, לקצור ולרכז וירוס המכיל על טבעי על ידי אולטרהצנטריפוגציה ב 50 צינורות אולטרהצנטריפוגה מיליליטר להקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.ואז ביום הראשון, בעדינות להשתמש בתאי T כדי לשבור רוזטות. במעבדה מאושרת BSL2+, כדי ליצור תאי CAR-T, להוסיף CAR19 lentivirus ו- GMCSF מיקוד CRISPR lentivirus לתאי T מדומה. ביום השלישי והיום החמישי עבור תאי T שנערכו בהצלחה על ידי lentiCRISPR הנושאים עמידות לפורומיצין, לטפל בתאים עם puromycin דיהידרוכלוריד בריכוז של מיקרוגרם אחד של puromycin למיליליטר.רצף הגאות שימש כדי לאשר הפחתת GM-CSF בתאי CART19 נוקאאוט GM-CSF עם יעילות שיבוש של כ 71% זרימה חלקות של כתם משטח תא CAR-T מגודר על תאים חיוביים CD3 לחיות להראות כי הן פראי סוג CART19 ו- GM-CSF נוקאאוט CART19 בהצלחה ובאופן דומה לבטא את קולטן משטח CAR במבחנה. מצד שני, כתמים תאיים של GM-CSF על ידי ציטומטריה זרימה גם מגודר על תאים חיוביים CD3 חי מדגים ביטוי מופחת של GM-CSF בתאי הנוקאאוט לעומת תאי CART19 מסוג בר המאשרים הצלחה תפקודית של הנוקאאוט. טיפול מסוים צריך להילקח במהלך שלבי ההעתקה של הליך זה כפי שהם הקריטיים ביותר להתפתחות של תאי CAR-T מהונדסים גנטית.המתודולוגיה המתוארת עשויה להיות מיושמת על מגוון גנים כדי לשנות תאי CAR-T באמצעות CRISPR /CAS9 כדי לעזור ליצור מוצר פחות רעיל ויעיל יותר. טכנולוגיית CRISPR/CAS9 מספקת את האסטרטגיות למקד ישירות את הגנום של תאי CAR-T כדי להנדס פתרונות לחסרונות הקליניים הנוכחיים.

using-crisprcas9-to-knock-out-gm-csf-in-car-t-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

הסרטון מתאר תהליך ליצירת תאי CAR T מהונדסים גנטית באמצעות מערכת CRISPR-Cas9. הדבקת תאי T ב-CRISPR וב-CAR lentiviruses גורמת לשינויים בגן המטרה ולסינתזה של קולטן אנטיגן כימרי או CAR, מה שמוביל בסופו של דבר להיווצרות תאי CAR T מהונדסים גנטית.

שינוי גנטי של תאי CAR T באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

סרטון זה מדגים בדיקה לביצוע עריכת גנים בתאי T אנושיים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. תערובת של תאי T ראשוניים CD4+ ו- CD8+ משולבת עם קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9, המכוון לגנים ספציפיים לנוקאאוט. לאחר ההתחשמלות, ה-sgRNA מנחה את Cas9 לרצף הדנ"א של המטרה, ויוצר חתכים מדויקים. חתכים אלה מתוקנים לאחר מכן על ידי מנגנון חיבור הקצה הלא הומולוגי של התא, המוביל לנוקאאוט גנטי.

טכניקת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים בתאי T

ג'ין יישוב עריכה באמצעות CRISPR/Cas9 הנחתה במידה רבה את ההבנה של פונקציות ביולוגיות של גנים. כאן, אנו מנצלים את המתודולוגיה CRISPR/Cas9 כדי דגם calreticulin מוטציות בתאים hematopoietic תלויי-ציטוקין לשם פעילותם oncogenic למידה.

שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי לחקור את פעילות Oncogenic Calreticulin מוטציה בתאים Hematopoietic תלויי ציטוקין

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

מחקרים אובדן-של-הפונקציה המקובלת של גנים באמצעות ההסתרה חיות לעתים קרובות היו יקרים ולגזול. מבוסס-אלקטרופורציה בתיווך CRISPR סומאטית מוטגנזה מכוונת הוא כלי רב עוצמה כדי להבין ג'ין פונקציות בתוך vivo. כאן, אנחנו מדווחים על שיטה לנתח נוקאאוט פנוטיפים מתרבים תאים של הצרבלום.

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעריכת גנים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas לשינוי תאי CAR-T.

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

אסטרטגיות חדשניות למודל נאמן של מוטציות סומטיות בתאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) נחוצות כדי לחקור טוב יותר ביולוגיה של תאי גזע המטופויאטיים וממאירויות המטולוגיות. כאן מתואר פרוטוקול למודל מוטציות רווח הטרוזיגוטיות ב-HSPCs על ידי שילוב השימוש ב-CRISPR/Cas9 והתמרה כפולה של תורמי rAAV.

הנדסת מוטציות הטרוזיגוטיות אונקוגניות בתאי גזע המטופויאטיים אנושיים ובתאי אב

במאמר זה אנו מתארים שיטה לשינוי סלקטיבי של ביטויי גנים במקלעת הכורואידים, תוך הימנעות מכל השפעה באזורים אחרים במוח.

הפלה ממוקדת של גנים במקלעת הכורואיד

המאמר מתאר פרוטוקול ליישום מודל in vitro לתשישות כדי להשלים מסך נוקאאוט CRISPR כלל גנומי בתאי T קולטן אנטיגן כימרי בריא מתורם.

ביצוע מסך CRISPR רחב גנום במבחנה בתאי T של קולטן אנטיגן כימרי

פיתחנו פרוטוקול סקר CRISPR-Cas9 אופטימלי לתאי CAR T ראשוניים. על ידי הפחתת העברת ה-gDNA באמצעות עיכול אנזימטי ומשיכת קלטת sgRNA, גישה זו ממזערת ארטיפקטים של PCR, ומבטיחה זיהוי מדויק של sgRNA וזיהוי חזק של מטרות גנים פונקציונליות.

שיפור מסכי CRISPR-Cas9 בתאי CAR T – שיטה משופרת להכנת ספרייה

למד שיטה לעריכה גנטית של תאי CAR-T באמצעות CRISPR/Cas9 במהלך ייצור התאים. הפרוטוקול משפר את יעילות הטיפול ומפחית את רמת הרעילות בתאי T מכוונים נגד סרטן.

שימוש CRISPR/Cas9 כדי לשדוד את GM-שדרתי ב-T מכונית תאים

גלה סרטונים נוספים