פלטפורמת מיקרופלואידיג רב שכבתית לצורך הובלה של ביטוי גנים ממושך ללא תא

Prototyping רשתות גנים סינתטיים משופרת מאוד על ידי שימוש במערכות ביטוי גנים ללא תאים. הפרוטוקול שלנו מתאר את תהליך הייצור של כור זרימה מיקרופלואידי רב שכבתי ומראה כי מכשיר כזה יכול לשמש לביטוי ממושך ללא תאים של GFP. ביטויי חלבון נטולי תאים בשילוב עם כורי זרימה מיקרופלואידיים מספקים את פלטפורמת אב-האב-נתונים המהירה לעיצוב של מכשירים ביולוגיים סינתטיים.

התקנה זו כולה היא רב-תכליתית מאוד ו ניתן להתאים אותה להוליכון של כל תגובה ביוכימית או כימית הדורשת רמות גבוהות של שליטה. הבטחת היציבות של פתרון התגובה ללא תאים היא קריטית וקשה להשגה. הקפד להתמקד במתן קירור מספיק ונצל את הצינורות שצוינו בפרוטוקול זה.

המצאה והכנת הפלטפורמה הניסיונית דורשת חיבור של רכיבים בודדים רבים, תהליך שקשה לעקוב אחריו ללא עזרים חזותיים. כדי להתחיל, בצע יחד בפרוטוקול הטקסט הנלווה כדי להמציא את המכשיר microfluidic ולהגדיר את בקרת פנאומטי ויסות לחץ זרימה אשר ישמש לשליטה על השסתומים קריטי למכשיר זה. כדי להגדיר את הקירור מחוץ לשבב, התחל על ידי סליל אורך של צינורות PTFE על הפנים הקרות של אלמנט פלטייה ולאבטח את סליל עם קלטת.

ודא כי קצה אחד של צינורות PTFE מחובר למאגרים של מערכת בקרת לחץ שכבת הזרימה, כי הקצה השני בולט לא יותר מסנטימטר אחד מפני השטח פלטייה. לאחר מכן הכנס אורך של 5 עד 10 ס"מ של צינורות PEEK לתוך הקצה הבולט של צינורות PTFE. יש למרוח כמות מספקת של תרכובת תרמית על הפנים החמות של אלמנט פלטייה ולהחיל אותה על הצלחת הקרה של גוש המים.

ודאו שהצנרת, אלמנט פלטייה ובלוק הקירור נמצאים בקשר ישיר זה עם זה בכל עת. לאחר מכן חבר את אלמנט פלטייה לבקר הטמפרטורה באמצעות מחבר אפיק טורי, כך שניתן יהיה להסדיר את המתח המסופק לפלטייר. לאחר מכן, הצב בבטחה תרמיסטור על משטח פלטייה וחבר את התפוקה שלו לבקר הטמפרטורה.

לאחר הפעלת מצנן המים, התאם את המתח המסופק לפלדייה עד שהטמפרטורה יציבה בארבע מעלות צלזיוס. עבור כל ערוץ בקרה של המכשיר microfluidic לחתוך אורך של צינורות סטנדרטיים כי הוא מטר אחד ארוך. בקצה אחד, הכנס את הסיכה של מד 23, יתן לולר אחד בגודל חצי אינץ' ובקצה השני הכנס סיכת חיבור מפלדת אל-חלד.

חבר את תקע לור למחבר ניילון דוקרני זכר Luer 3/32 אינץ' והכנס את העקיצה של המחבר לאורך של צינורות פוליאוריתן. ואז להכניס צינורות פוליאוריתן זה ישירות לתוך אחד שסתומי סולנואיד. הבא לצרף 23 מד חצי אינץ ' לולר stub למזרק ולהכניס את זה לתוך חתיכה ארוכה של שלושה עד ארבעה סנטימטרים של צינורות סטנדרטיים.

מניחים את הקצה הפתוח של צינור זה לתוך מאגר של מים טהורים במיוחד ולמלא את המזרק עם מים טהורים במיוחד. מספור כל ערוץ בקרה של המכשיר microfluidic כפי שמוצג כאן. עבור ערוצים 4 עד 29, למצוא את הצינור המתאים ולהכניס את סיכת המתכת לתוך הקצה הפתוח של הצינור המחובר למזרק.

ואז להזריק מים לתוך צינורות תעלת הבקרה עד מחצית האורך כבר מלא. לאחר מכן, נתק את הצינורות מהמזרק והכנס את סיכת מחבר נירוסטה לתוך החור המתאים של המכשיר המיקרופלואידי. חזור על שלב זה עבור כל ערוצי הבקרה.

עכשיו, להשתמש בממשק הבקרה כדי לפתוח את כל שסתומי סולנואיד. פעולה זו תלחץ על הנוזל בתוך צינורות תעלת הבקרה ותאלץ אותו להיכנס למכשיר המיקרופלואידי ולסגור את כל השסתומים מבוססי הממברנה בתוך המכשיר. עבור כל אחד מהריגטים הלא מנוקב חתכו אורך מטר של צינורות סטנדרטיים כדי לחבר את שקע המאגר לתוך ההתקן המיקרופלואידי.

קח קצה אחד של הצינור ולהכניס את זה לתוך המאגר להבטיח כי הצינורות מגיע לבסיס המאגר. יש להדק את שקע צינורות המאגר כך שהושג אטום אטום. לאחר מכן, הכנס סיכת חיבור אל-חלד לקצה הפתוח של הצינור.

לאחר מכן, צרף 23 מד חצי אינץ' לולר תותב לסוף מזרק מיליליטר אחד. הוסיפו אורך קצר של צינורות סטנדרטיים לסטוב לולר. מניחים את קצה הצינור לתוך הפתרון הרצוי reagent ולמלא את המזרק עם reagent.

לאחר מכן הכנס את סיכת מחבר נירוסטה לתוך צינורות פוליאוריתן המחוברים למזרק ולמלא את הצינורות עם reagent. בעת שימוש בנפחי תגובה קטנים, ריאגנט לא ייכנס למאגר ואת הצינור עצמו יפעל כמאגר. בסיום, נתק את המזרק והכנס את סיכת המחבר לאחד חורי הכניסה של שכבת הזרימה של ההתקן המיקרופלואידי.

לאחר מכן להפעיל לחץ על כל אחד המאגרים באמצעות תוכנת רגולטור הלחץ כדי לאלץ את reagents לתוך המכשיר microfluidic. ודא כי מצנן המים ואלמנטים Peltier כבר מופעל עם טמפרטורת פני השטח של פלטייה מוגדר ארבע מעלות צלזיוס. התקן את מערך הקירור קרוב ככל האפשר להתקן המיקרופלואידי כדי למזער את עוצמת הקול הבלתי מעורערת בין ה-Peltier למפרץ המכשיר.

ואז לחבר את אחד מזרק מיליליטר אחד כדי 23 מד חצי אינץ ' לולר תקע עם אורך קצר של צינורות סטנדרטיים מחוברים עד הסוף. צייר את הריג'נט כדי להיות מקורר כדי למלא את המזרק. הבא לחבר את צינורות PEEK למזרק באמצעות צינורות החיבור ולהחיל לחץ מתמיד על המזרק לאלץ את מגיב דרך צינורות PEEK לתוך צינורות PTFE.

לבסוף לנתק את צינורות PEEK מהמזרק ולהכניס אותו ישירות לתוך הכניסות ערוץ הזרימה של המכשיר microfluidic. כאשר הלחץ יוחל, הרוגנט מקורר ייאלץ לתוך המכשיר microfluidic. ודאו שההתקן המיקרופלואידי מאובטח בשלב המיקרוסקופ עם כל צינורות שכבת הבקרה והזרימה המחוברים וסגרו את כל הפתחים באינקובטור.

לאחר מכן להגדיר את טמפרטורת הסביבה של החממה ל 29 מעלות צלזיוס. לאחר מכן תבטח שמערכת הקירור מופעלת ומוגדרת לארבע מעלות צלזיוס לפני תחילת הניסוי. בדוק כי הלחצים המוחלים על וסת לחץ ערוץ הזרימה מוגדר 800 מיליבאר ושימוש בתוכנה, להגדיר את לחץ הפלט של כל ערוץ זרימה בודדים בין 20 ל 100 מיליבאר.

בדוק כי לחצים להחיל על שסתומי סולנואיד ערוץ הבקרה הוא בר אחד עבור ערוצים אחד עד שמונה ושלושה בר עבור ערוצים תשע עד 29. לאחר מכן, סגור את השקע של המכשיר על ידי לחיצה על ערוץ 29 ובו זמנית לדכא ערוצי בקרה אחד עד שלוש ו 15 עד 28. לאחר מכן לחץ באופן סלקטיבי על ערוצי הבקרה של המולטיפלקסר כדי לאפשר לריג'נט נבחר אחד לזרום לתוך ההתקן.

השתמש במיקרוסקופ כדי לפקח על הסרת האוויר ולאחר מכן להבטיח כי כל reagents לזרום כראוי מבלי להציג בועות אוויר. באמצעות חבילת התוכנה שסופקה, הגדר את שדות הנתונים הקשורים לתהליך הכיול כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן לקבוע את נפח הנוזלים שנעקרו מכל כור במהלך שלב זרימה יחיד על ידי ביצוע פרוטוקול הכיול.

בצע יחד עם השלבים שהוצגו על ידי תוכנת הבקרה כדי להשלים את הניתוח של ניסוי הכיול ולקבוע את יחס הרענון של כל כור טבעת בהתקן microfluidic. לבסוף, הגדר את הערכים הדרושים עבור הניסוי הרצוי בתוך ממשק הבקרה הווירטואלית. ליזום את הפרוטוקול הניסיוני על ידי לחיצה על לחצן ביצוע הניסוי בממשק הבקרה.

במהלך ניסוי כיול הכורים מלאים בפלואורופור שעוצמתו מתועדת לאחר כל דילול. הירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות לכל דילול חושפת את נפח טבעת הכור שנעקרו עבור המספר שנקבע של שלבי הזרימה. אמצעי אחסון זה תותקף את יחס הרענון.

יחס הרענון הממוצע וסטיית התקן מוצגים עבור כל שלב דילול באדום. שבעה מתוך שמונת הכורים מראים התנהגות דומה מאוד, אולם כור אחד מראה תנודות לאחר מחזור הדילול השביעי. זה מדגיש את הצורך ביחסי רענון ייחודיים עבור כל אחד מהכורים.

התמליל הממושך במבחנה ותגובת התרגום המוצגים כאן היו 30% מנפח הכור שנעקרו כל 14.6 דקות. שני כורים של המכשיר המיקרופלואידי שבו משמשים כדורי סרק. כל הכורים האחרים כללו 75% תמלול במבחנה ותגובת תרגום ו-25% ממים טהורים במיוחד או קידוד תבניות DNA ליניאריות ננו-מולריות 2.5 לביטוי חלבון deGFP.

בכל ארבעת הכורים שבהם נוסף הדנ"א, היה ביטוי deGFP ברור. כור אחד מציג אות פלואורסצנטי נמוך יותר. זה יכול להיגרם על ידי פער בזרימה וכתוצאה מכך פחות DNA נכנס הכור או בשל וריאציות בממדי הכור.

לאחר 14 שעות, עלייה פתאומית ניכרת באות של הכורים המכילים DNA. זה נגרם על ידי בועת אוויר הנכנסת לשכבת הזרימה של המכשיר המיקרופלואידי. עם חידוש הזרימה, הניסוי חוזר לעוצמת הפלואורסצנטיות הקודמת שלו.

פתרונות תגובה נטולי תאים נתונים לפגיעה לאורך זמן, אלא אם כן הם מקורר מספיק, להפוך את תהליך הקירור המתואר בפרוטוקול זה בעל חשיבות קריטית. בשל הרבגוניות של הפלטפורמה, מגוון תגובות ביוכימיות וכימיות יכולות להתנהל בצורה מדויקת ומבוקרת. היישום של כורי זרימה microfluidic האיץ תכנון רצוף לבנות מחזורי בדיקה עבור prototyping מעגלים גנטיים כפולים.