ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

אלקטרופוזיה mRNA מספקת ביטוי מהיר, יעיל, מבוקר מרחבית ותכופת של חלבונים מרובים בתוך מערכת מודל העופות. שיטה זו מאפשרת ביטוי רחב ומהיר יותר של חלבונים פלואורסצנטיים מאשר התיוג שהושג על ידי אלקטרופורציה DNA סטנדרטית. אלקטרופורציה מקלה על פתיחה בלתי עבורה של נקבוביות בממברנה הפלזמה המשמשות צינורות להעברת מטענים גנטיים כמו RNA ו- DNA לתאים של אורגניזמים מודל רבים.

עבור הניסויים הראשונים לעבוד עם עוברים כי הם מבוגרים יותר מיום מאז הם קשים יותר ועמידים יותר מניפולציות חיצוניות כמו אלקטרופורציה. בשלב ההתפתחותי העוברי המתאים נשברים בעדינות ויוצקים את תכולת ביצת השליו לתוך צלחת פטרי באורך 10 ס"מ. השתמש פיפטה העברה כדי להסיר את רוב האלבום עבה.

השתמש ברקמת מעבדה כדי לנגב בעדינות את פני השטח של עול כדי להסיר את האלבום העבה הנותר סביב העובר כדי להבטיח שהעובר יידבק בחוזקה לטבעת הנייר. מניחים נייר מסנן precut מעל העובר ולהשתמש מספריים לחתוך בצורה חלקה סביב ההיקף של העובר. השתמש פיפטה פסטר לשכב PPS מתחת לעובר באמצעות זרמים עדינים כדי לפנות כל עול דבק לרקמה.

משוך באיטיות את טבעת נייר העובר בזווית אלכסונית למעלה ומן עול. מניחים את הנייר לתוך צלחת פטרי מלא PBS לניקוי נוסף. לאחר שרוב עול הוסר, למקם את הצד הגחוני העובר למעלה בצלחת פטרי 35 מילימטר מכוסה תערובת חצי סולידי של אגר אלבומן.

הכן את תא האלקטרופולציה על ידי חיבור האלקטרודה השחורה הממלאת אותו ב- PBS והצבת העובר בפנים. השתמש microcapillary זכוכית להזריק בולוס של 200 nanoliters של mRNA לתוך החלל בין האפיבלסט קרום vitelline מכסה את האזור הרצוי. ואז להשתמש באלקטרודה האדומה כדי אלקטרופולאט העובר.

מניחים את העובר האלקטרופוי בחזרה על תערובת אגר-אלבומן ודגירה ב 38 מעלות צלזיוס עד השלב ההתפתחותי הרצוי. להדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים אלקטרופורציה להתבונן בכל העוברים אלקטרופולציה תחת סטריאוסקופ חיטוי פלואורסצנטי כדי לבחור את העובר הבריא ביותר ואת האלקטרופוציה הטובה ביותר עבור ניסויי הדמיה דינמית. המשך להתהגר בעוברים אלקטרופלסטיים אחרים ועוברים שאינם אלקטרופלציה באינקובטור נפרד.

שטפו בקצרה את העובר שנבחר עם PBS כדי להסיר את כל הבועות שאולי נוצרו בצד הגבי של העובר במהלך האלקטרופוריה. מניחים את העובר ניקה ישירות לתוך צלחת הדמיה המכיל שכבה דקה של כ 150 microliters של אלבומן אגר דואג לא ליצור בועות על פני הגב של העובר. מוסיפים חתיכת נייר טישו קטנה ומגולגלת לאורך הקצוות הפנימיים של צלחת ההדמיה.

לאטום את המנה עם סרט פרפין כדי למזער את האידוי במהלך ההדמיה ואת הדגירה. מעבירים את המנה במהירות לשלב טרום המלחמה של מיקרוסקופ קונפוקל ולהשתמש בערוץ brightfield כדי לאתר את הצבע הצבעוני בעובר. הגדר את תוכנת ההדמיה למטרה הרצויה, מראה דיכרואית וספקטרום פליטה, והפעיל לייזר מתאים.

יש לדאוג כי התאים יישארו בראיית התמונה עבור כל הסרט. השתמש ברזולוציית דימות גבוהה מספיק, וודא שתנאי ההדמיה לא יגרמו לפוטוטוקסיות. לחץ על לחיות בתוכנת ההדמיה ולהתאים את כוח הלייזר להגדרה המתאימה לעוצמת הפלואורסצנטיות בהתאם לכל כוח לייזר מיקרוסקופ.

התחל לדמיין את העובר באמצעות כוח לייזר של 1% והגדלת 800, והגדל את כוח הלייזר לאט במרווחים של 1% עד שניתן יהיה לראות פיקסלים רוויים. כאשר פיקסלים רוויים נצפו להקטין את כוח הלייזר מעט עד פיקסלים רוויים לא ניתן לדמיין. תמונה העובר כל שלוש עד חמש דקות כדי לבדוק את הנדידה של תאים בודדים על פני נקודות זמן שונות באמצעות חמש מיקרומטר Z-ערימות של האזור האלקטרופלסטי כולו עם קצת מקום נוסף לכיוון החלק התחתון של מחסנית Z במקרה העובר שוקע לתוך המיטה התעוררה במהלך הפגישה הדמיה.

כדי לבחון כמה מהר התאים נעים לבדוק את נקודות הזמן הראשונות של הסרט הראשון. אם התאים נעים בקצב מהיר, שקול להרחיב את גודל התצוגה של אזור התמונה או להדמיית אזור אחר. כאשר כל האזור האלקטרופלסטי של העובר כבר בתמונה, תמונה באזור לא נבחר של אותו עובר כדי לקבוע את רמות שפעת אוטומטית.

כדי לקבוע כמה זמן mRNA מפוסל יכול להיות מתורגם חלבונים פלואורסצנטיים לאחר אישור אלקטרופולציה של הגן של עניין על מיקרוסקופ סטריאו, מניחים את העובר על שלב שחומם מראש של מיקרוסקופ קונפוקל הפוך ולהשתמש לייזר 405 ננומטר עם כוח לייזר 70%, 100 איטרציות, ומהירות סריקה של ארבעה כדי photobleach רוב הפלואורסצנטיות התאית מן הגן electroplated במגוון נקודות זמן. המשך להחגירה העוברים על הבמה ב 36 מעלות צלזיוס לאחר הלבנת תמונה, דואג לשים לב לתאים המפרידים באופן פעיל בתוך האזור photobleached כי הם בדרך כלל רק לראות עוברים בריאים ובכך עולה כי אלקטרופוריה לא לפגוע בתאים העובריים. רכוש תמונות לאחר אקונומיקה Z-מחסנית של האזור electroplated למשך הזמן הרצוי במרווחי זמן קבועים שלוש עד חמש דקות.

כדי להבטיח שתנאי ההדמיה לא ישפיעו באופן מחק על הישרדות העובר במקביל, דגירה של עוברים אלקטרופלסטיים שלא פוטובלצ'ים ישמשו כבקרה על ההדמיה. כדי לכמת את תוצאות photobleaching עבור ריקבון mRNA לאחר אלקטרופולציה להשתמש ImageJ כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של עיגול 7.5 מיקרומטר במרכז האזור electroplated של כל תא כדי לעקוב אחר פלואורסצנטיות התא על פני כל מרווח של שלוש עד חמש דקות. כאשר נמדדו כל התאים באזור הפוטובלצ'ים שאינם עוברים מיטוזה וצילום מלא, עלו על עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן לאחר אקונומיקה בכל אחת מנקודות הזמן שהעובר נוהם.

למרות אלקטרופורציה DNA מוביל פלואורסצנטיות בהירה יותר בתאים מסוימים electroplated, היעילות של אלקטרופורציה DNA הוא נמוך יותר בעליל בהשוואה לחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים mRNA. כאשר משווים דנ"א ואלקטרופוזיה שותף mRNA בתוך אותו עובר, ה-DNA המבטא יעילות חלבון פלואורסצנטי הוא גם משמעותי ועקבי פחות יעיל מזה של mRNA המבטא חלבון פלואורסצנטי. כימות של כל העוברים electroplated עם mRNA בלבד, DNA או שילוב של השניים, מגלה כי mRNA משנה כ 75% מהתאים באזור נתון, בעוד DNA רק חוצה כ 25% מהתאים.

mRNA מנוקט צריך להוביל לייצור חלבון מהיר יותר לעומת DNA מנוקט מאז mRNA יכול להיות מזוהה מיד על ידי מכונות תרגום cytosolic. למרות אלקטרופוזיה שותף של DNAs מרובים הוכח בעבר להיות יעיל יחסית, אלקטרופוזיה שותף של ארבעה mRNAs בניסוי זה הביא יעילות transfection 87% של כל ארבעת mRNAs בתוך כל האזורים electroplated. למרות photobleaching בתחילה מפחית את עוצמת הפלואורסצנטיות בתאים photobleached על ידי כ 95% תאים מסוימים נשארים לשחזר את יכולתם לחלק ולהביע חלבונים פלואורסצנטיים זמן קצר לאחר אלקטרופורציה.

יכולת זו פוחתת על פני חמש שעות לאחר אלקטרופולציה עם זאת. קח את הזמן שלך אופטימיזציה של תנאי ההדמיה הטובים ביותר ולהמשיך להתעסק גם לאחר תחילת הסרט להיות מוכן לבצע את כל ההתאמות במידת הצורך.