שיטת הלימוד הסטנדרטית והמדמדית למחקר בלבלוב אנגיוגנטית בתלת-ממד של התאים הנגזרים מתוך מבחנה

זה assay במבחנה מדגים ניצנים אנגיוגניים בתפוקה גבוהה פלטפורמה מדרגית. זה יכול לשמש כדי למצוא מטרות חדשות באנגיוגנזה. בדיקה זו של אנגיוגנזה משלבת סביבות מיקרו תאיות מורכבות הכוללות מעברי צבע וזלוק עם פלטפורמה התואמת להקרנת תפוקה גבוהה.

אנגיוגנזה ממלאת תפקיד חשוב הן בבריאות והן במחלות. הבנת המנגנונים המתרחשים במהלך אנגיוגנזה יכולה לעזור לנו להבין כיצד סרטן לגדול וכיצד רקמות לתקן. שיטה זו יכולה לתת תובנה במנגנונים במהלך מחלות לב וכלי דם והתחדשות רקמות.

בשניהם, אנגיוגנזה ממלאת תפקיד חשוב. לשימוש הראשון של פלטפורמה microfluidic זה, אתה צריך להיות מודע לחוק של כרכים וכיצד pipette. אתה יכול לאשר את השלבים על ידי הסתכלות תחת מיקרוסקופ או היפוך הלוח במהופך.

כמה צעדים קשה לקבל תחושה כאשר רק לקרוא את השיטה, למשל כמה קטנים הערוצים microfluidic או איך להחזיק את הצלחת. מדגימה את ההליכים האלה תהיה וונדי סתאם, טכנאית מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, להעביר את צלחת microfludic 384 היטב למכסה המנוע לזרום למינאר סטרילי.

הסר את המכסה והוסף 50 מיקרוליטרים של מים או פוספט אגף מלוחים לכל אחת מ -40 בארות התצפית באמצעות פיפטה רב ערוצית. לאחר מכן הוסיפו 1.5 מיקרוליטרים של ארבעה מיליגרם למיליליטר קולגן פתרון אחד להיכנס לג'ל של כל יחידה מיקרופלואידית. ודא טיפת ג'ל ממוקם באמצע כל באר על מנת ג'ל להיכנס לערוץ.

לאחר מילוי חמש יחידות microfluidic, להפוך את הצלחת במהופך כדי לבדוק חזותית מילוי נכון של תעלות ג'ל. מניחים את הצלחת המיקרופלודית באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 10 דקות כדי להפוך קולגן אחד לפולימרי. לאחר מכן מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומעבירים למכסה המנוע של לזרימה סטרילית.

הוסף 50 microliters של 10 מיקרוגרם לכל פתרון קידוד fibronectin מיליליטר לשקע היטב של ערוץ מושלם העליון של כל יחידה microfluidic. לחץ על קצה פיפטה בצד של באר למילוי נכון של באר מבלי ללכוד בועות אוויר. הערוץ מתמלא והמחבתות הנוזליות בשקע מבלי למלא היטב את השקע.

לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור לפחות יומיים. עכשיו, במהירות להפשיר את IPSC-ECs הקפואים במשך פחות מדקה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להעביר את התאים לצינור 15 מיליליטר לאט להוסיף 10 מיליליטר של מדיום בסיסי לדלל.

צייר 10 מיקרוליטרים של הפתרון וספיר את התאים על מונה תאים. צנטריפוגה הצינור ב 100 פעמים g במשך חמש דקות. שאף את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור התא ולחץ מחדש במדיום הבסיסי כדי להניב ריכוז של פי 2 10 לתאים השביעיים למיליליטר.

לאחר מכן, מעבירים את צלחת ה-384 באר המיקרופלואידית מהאינקובטור למכסה המנוע הסטרילי של זרימת למינאר. שאפו את תספורת הקידוד פיברונאטין משקע הזליף והוסיפו 25 מיקרוליטרים של מדיום בסיס בארות השקע. הוסף טיפת מיקרוליטר אחת של השעיית תא לכל מפרץ תפוקה עליון היטב.

טיפה משתטחת בכמה שניות. בדוק תחת מיקרוסקופ אם הזריעה הומוגנית בערוץ אחד ובין ערוצים. הדגירה את צלחת באר microfluidic במשך שעה עד 1.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן, בדוק את התאים כדי לוודא שהם דבקו. מוציאים את המדיום הבסיסי מ הבאר העליונה של שקע הזלבול. הוסף מדיום תרבות כלי חם בתוך תדלוק העליון ושקע.

מניחים את הצלחת על פלטפורמת נדנדה אשר מוגדר על זווית שבע מעלות ושמונה דקות מרווח נדנדה באינקובטור. ביום הראשון ושניים לאחר הזריעה, תדמיין את הצלחת באמצעות מיקרוסקופ של ברייטפילד עם שלב אוטומטי כדי לאשר את כדאיות התא. לאחר יומיים, מונוליאר קונפלנטי נוצר נגד פיגום קולגן אחד.

ראשית, להכין 4.5 מיליליטר של מדיום נבט אנגיוגניים על ידי השלמת 4.5 מיליליטר של מדיום בסיס עם 4.5 microliters של מלאי VEGF, 4.5 microliters של מלאי PMA, ו 2.25 microliters של מלאי S1P. הכן 8.5 מיליליטר של מדיום צמיחת כלי על ידי השלמת מדיום בסיס עם 5.1 microliters של VEGF ו 3.4 microliters של BFGF. שאפו מדיום מה בארות והוסיפו 50 מיקרוליטרים של מדיום תרבות כלי טרי ב מפריצת התדלוק העליונה וב בארות שקע ושקע ג'ל אינלט בארות שקע.

לאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטרים של תערובת נבטים אנגיוגנית לכל אחד מפריצת ערוץ הזייה התחתונה ובירות שקע. מניחים את הצלחת בחזרה לתוך החממה על פלטפורמת הנדנדה על מנת ליצור שיפוע של גורמי גדילה אנגיוגניים. יום ויומיים לאחר הוספת גורמי הגדילה האגיוגניים, השתמש במיקרוסקופ של Brightfield כדי לדמיין את הבארות על במה אוטומטית.

כדי ללמוד anastomosis וייצוב נבטים, להוסיף מיקרוליטר אחד של 0.5 מיליגרם למיליליטר פלואורסצנטי שכותרתו אלבומין לתוך החיסון העליון. ואז לערבב את הפתרון עם פיפיטר 50 מיקרוליטר. מעבירים את הצלחת למיקרוסקופ פלואורסצנטי עם במה אוטומטית וחממה ב-37 מעלות צלזיוס.

הגדר את המיקרוסקופ למטרה 10X ותקן את הגדרות החשיפה. להשיג תמונות timelapse כל דקה במשך 10 דקות. מוציאים את הצלחת מהמיקרוסקופ ומעבירים את הצלחת למכסה המנוע של זרימה למינארית סטרילית.

מוציאים את כל המדיום מה בארות ומחליפים הן את מדיום תרבות כלי הדם והן את מדיום ההבטה האנגיוגני בארות המתאימות. מניחים את הצלחת המיקרופלואידית בחזרה לתוך החממה כדי להמשיך נבטים אנגיוגניים. ביום השישי, חזור על ההדמיה כדי לחקור את ההתחלחלות.

כדי לתקן את תרבות התאים, שאף את כל המדיה התרבותית מה בארות. הוסיפו 25 מיקרוליטרים של 4%PFA ב-PBS לכל מפרצות התדלוק והשקעים. לאחר מכן מניחים צד אחד של הצלחת המיקרופלואידית על המכסה בזווית קלה של חמש מעלות כדי לגרום לזרימה.

דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאף את PFA מה בארות. לשטוף את כל מפרצות נזיפה ושקעים פעמיים עם 50 microliters של HBSS.

ואז לספירה HBSS מה בארות. Paraformaldehyde הוא כימיקל מסוכן אשר צריך להיות מטופל לובש כפפות רק נפתח ברדס אדים. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של 0.2% חומרים פעילי שטח לא יוניים לכל מפרצי החלחלה והשקעים כדי לחלחל בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולה מניחים את הלוחית המיקרופלואידית על המכסה בזווית קלה של חמש מעלות.

שאפו את חומר הגלישה הלא יוני מה בארות ושטפו פעמיים את תעלות התדלוק על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של HBSS לכל מפרצות התדלוק ובירות השקע. שאף את HBSS מה בארות. הכן Hoechst 1, 000 כדי 2, 000 עבור הכתמת הגרעינים ולהכין פאלודין 100 כדי 200 ב HBSS עבור הכתמת F-actin.

שלב שישה מיליליטר של HBSS, 30 מיקרוליטרים של F-actin, ושלושה microliters של Hoechst בצינור פלקון. לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים לכל מפריצת נזיפה ושקע היטב. מניחים את הצלחת תחת זווית קלה ודגירה בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות.

יש לשטוף פעמיים עם 50 מיקרוליטרים של HBSS בכל מפרצות התדלוק והשקעים. ואז ישירות תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם שלב אוטומטי או לאחסן את הצלחת מוגנת מפני אור בארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. בפרוטוקול זה, כלי המיקרו היו מנוורים ברציפות ונחשפו לשיפוע של גורמי גדילה אנגיוגניים.

זריעת IPSC-ECs באמצעות שיטת שאיבה פסיבית הביאה צפיפות זריעה הומוגנית. timelapse של טיפה כי הוא ממוקם על גבי הכניסה של הערוץ microfluidic מראה את טיפה מיד לאחר תוספת, טיפה על גבי תא המטען של הכניסה לאחר תוספת, עד מניסקוס טיפה הוצמד על ידי הכניסה אשר הביא זרימה לכיוון השקע. חשיפה לשיפוע של גורמים אנגיוגניים הביאה להפקעת אנגיוגנית כיוונית של כלי המיקרו בתוך ג'ל קולגן אחד בדוגמת.

היווצרות תאי קצה ברורים וחדירה לתוך הקולגן ג'ל אחד נראה 24 שעות לאחר הוספת שיפוע אנגיוגניים בעוד תאי מלאי כולל היווצרות לומן היו גלויים לאחר 48 שעות. לאחר קיבעון וכתמים זוהו הצורה והאורך של נבטים אלה. עם זאת, ללא תוספת של גורמי גדילה, לא נצפתה פלישה לתוך הקולגן ג'ל אחד.

עם הדמיה קונפוקל, קוטר הנבט נקבע ואת היווצרות לומן אושרה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לסנן מעכבי אנגיוגניים חדשים. זה יכול לעזור למצוא טיפולים חדשים נגד רטינופתיה סוכרתית, דלקת מפרקים שגרונית וסרטן.

אנו בוחנים כעת כיצד אנו יכולים ליצור תרבויות שיתוף כולל מודל של מחסום הדם - מוח ואברנואידים וסקולריים.