Name: משופרת Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) שיטה לזיהוי יעיל של רנ א חלבון מאוגד ב העכבר בתוך הראש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: חקור את שיטת eCLIP המשופרת לזיהוי יעדים של חלבונים מקשרי RNA בעכבר. הפרוטוקול מאפשר מיפוי אינטראקציות RNA-RBP בתוך האשך לחקר רגולציה לאחר תמסורתית בתהליך הספרמטוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאריק ל ואן נוסטרנד ולג ' יו על הנחיות מועילות עם הפרוטוקול המקורי. K.Z. היה נתמך על ידי תוכנית מפתח לאומי R & D של סין (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31771653). L.Y. נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81471502, 31871503) ותוכנית חדשנית ויזמית של מחוז ג'יאנגסו.

<ol><li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li>
<li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+sex+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li>
<li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li>
<li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li>
<li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+right+RNA%3A+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Acadamy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li>
<li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li>
<li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+%28piRNA%29+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Acadamy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li>
<li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+Is+a+5%27+to+3%27+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3%27+UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li>
<li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li>
<li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li>
<li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941(2012).</li>
<li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li>
<li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li>
<li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li>
<li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).</li>
<li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54(2017).</li>
<li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038(2012).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li>
<li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitored+eCLIP%3A+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li>
<li>Huppertz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP%3A+protein-RNA+interactions+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">iCLIP: protein-RNA interactions at nucleotide resolution.</a> Methods. 65 (3), 274-287 (2014).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142(2018).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24(2011).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li>
<li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+is+an+RNA-binding+protein%2C+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li>
<li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+%28CLIP-Seq%29+for+mouse+Piwi+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

עם ההבנה הגוברת של התפקיד האוניברסלי של rbps תחת שני ההקשרים ביולוגיים ופתולוגיים, שיטות הקליפ נוצל רבות כדי לחשוף את הפונקציה המולקולרית של rbps20,32,33, 34,35. הפרוטוקול המתואר כאן מייצג יישום מותאם של שיטת eCLIP לתוך החשבון של העכבר.
אתגר אחד בביצוע eCLIP ב בדיקת שמירה על יכולת הקיום והיושרה של תאי האשכים טריים, אשר גם חשוב עבור...

התמיינות של מיונקים מייצגים מודל התפתחותי מעולה שבו תוכנית בידול התא מסובכים מפעילה מחזוריות להניב מספר רב של זרע. ערך ייחודי של מודל זה טמון הופעתה של הפעלה החוצה בשלבים מסוימים של הזרע, בדרך כלל כאשר כרומוזום הסקס meiotic הפעלה (msci) מתרחש1,2 וכאשר מסתובבים spermatogenesis קיצוני מדחס גרעיני במהלך spermiogenesis3. האירועים הללו ברציפות מחייבים את התקנה לאחר ההמרה של הגנים, שבו ה-RNA-כריכת חלבונים (RBPs) לשחק תפקיד מכריע, עיצוב הטרנססקריפט ושמירה על פוריות הגבר.
כדי לזהות את מטרות ה-RNA בתום בודד של rbp הפרט ב-vivo, השיטה מרובי קישור immunoprecipitation (קליפ) פותחה4,5, על בסיס אבל מעבר RNA רגיל immunoprecipitation (RIP)6,7 , על ידי שילוב של שלבים מרכזיים כולל אולטרה סגול (UV) הקישור, לשטוף מחמירים ולהעביר ג'ל כדי לשפר את האות ספציפיות. היישום המתקדם של ה-CLIP בשילוב עם רצף תפוקה גבוהה עורר עניין רב ביצירת פרופיל של אינטראקציה חלבון-RNA ברמותהגנום-שמונה. בנוסף למחקרים גנטיים על הפונקציה RBP, כגון שיטות ביוכימיים המזהות את הגומלין הישיר של חלבון אנדוסוגני ו-RNA היו הכרחי כדי להבהיר במדויק את תפקידי הרגולציה של ה-RNA של Rbp. לדוגמה, MOV10L1 הוא הליקאז RNA הספציפי ביותר הנדרש עבור פוריות הגברי ו-Piwi-אינטראקציה RNA (piRNA) biogenesis9. Paralogue MOV10 שלה הוא ידוע בתור אוביקוויל rna הליקאז ו משולבות עם תפקידים בהיבטים רבים של ביולוגיה rna10,11,12,13,14 , מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , 18. על ידי העסקת קליפ קונבנציונאלי-seq, מצאנו כי MOV10L1 נקשר ומסדיר pirna הראשונית מראש כדי ליזום עיבוד pirna מוקדם19,20, וכי MOV10 נקשר mrna 3 ' utrs ו כמו גם שאינם קידוד RNA מינים בתאי נבט האשכים (נתונים לא מוצגים).
עם זאת, CLIP הוא במקור הליך מפרך ורדיואקטיבי ואחריו הכנה לספריות ברצף עם אובדן מרשים של תגי CLIP. ב-CLIP המקובל, ספריית cDNA מוכנה באמצעות מתאמים משני הקצוות של RNA. לאחר עיכול החלבון, polypeptides קצרים קצר להישאר מקושרים שברי RNA. מארק זה מקשר באופן חלקי בלוקים לאחור טרנססקריפט (התקדמות) במהלך סינתזה cdna, וכתוצאה מכך cdnas המייצגים כ 80% של ספריית cdna21,22. כך, רק שברי cDNA הנובע RTase בורסה עוקף את האתר המקשר (קריאה-דרך) הם ברצף. לאחרונה, מספר הגישות השונות של CLIP, כגון PAR-קליפ, iCLIP, eCLIP ועובדה, מועסקים כדי לזהות אתרים מרובי קישורים של RBPs בתאי החיים. PAR-CLIP כולל את היישום של 365 ננומטר קרינת UV ו-photoהפעלות מקבילים והוא ולכן בלעדית לתאי החיים בתוך-culturing, והתאגדות של האנלוגיות של נוקלאוטיד לתוך תעתיקים מסונתז החדש נוטה לייצר הטיה כאשר RNA אינטראקציה פיזית עם חלבון23,24. ב-iCLIP, רק מתאם יחיד מחובר ל -3 הגפיים של קטעי RNA מקושרים. לאחר תמלול הפוכה (RT), שניהם מעוגלים ולקרוא על-ידי cdnas מתקבלים על ידי מעגליות ולינריזציה מחדש ואחריו תגובת שרשרת פולימראז (PCR) הגברה25,26. עם זאת, היעילות של מעגליות מולקולארית היא נמוכה יחסית. למרות שפרוטוקולי קליפ ישנים יותר זקוקים לתיוג של RNA מקושר עם רדיואיזוטופ, אולטרה-סגול מקשר וטיהור אהדה (למחוא כף), עם תהליך של טיהור דו-מושביים מחמירים, אינו מסתמך על רדיואקטיביות27. אף על פי כן, עובדה מוגבלת לתאים מתורבתים שחייבים להיות מצוידים עם וקטור הביטוי נושאת 3x דגל-HBH תג עבור טיהור האהדה הדו.
ב eCLIP, המתאמים היו ליגלו הראשון ב 3 ' הגפיים של RNA ואחריו RT, ובהמשך ב 3 ' הגפיים של cDNAs במצב הבין-מולקולרי. מכאן, eCLIP מסוגל ללכוד את כל מעוגלים ולקרוא ב-cDNA28. גם, זה לא מוגבל תיוג רדיואקטיבי, וגם לא באמצעות קווי התאים המבוססים על העיקרון שלה, תוך שמירה על הרזולוציה יחיד-נוקלאוטיד.
כאן, אנו מספקים תיאור צעד אחר צעד של פרוטוקול eCLIP המותאם לגבי בעלי העכבר. בקצרה, זה הפרוטוקול eCLIP מתחיל עם מרובי UV המקשר של tubules האשכים, ואחריו העיכול חלקית RNase ו immunoprecipitation באמצעות נוגדן ספציפי חלבון. לאחר מכן, ה-RNA המאוגד לחלבון הוא בדיזאט, והמתאם מוגבל לקצה של שלושת האחרים. לאחר אלקטרופורזה ג'ל חלבונים ו ג'ל ל-ממברנה העברה, RNA מבודד על ידי חיתוך אזור הקרום של טווח בגודל צפוי. לאחר RT, מתאם DNA הוא ליגאל הקצה 3 ' של cDNA ואחריו הגברה PCR. הקרנה של תת-שיבוטים לפני רצף התפוקה הגבוהה נלקח כבקרת איכות בספרייה. פרוטוקול זה יעיל בזיהוי מינים עיקריים של רנ א חלבון מאוגד של RBPs, לידי ביטוי על ידי שתי הטיות ביטוי RNA האליסים MOV10L1 ו MOV10.

<table><tbody><tr><td><נוגדנים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר MOV10&nbsp; נוגדן</td><td>Proteintech, סין</td><td>10370-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכבר MOV10L1</td><td>Zheng et al.20109</td><td>polyclonal antisera UP2175</td><td>מסופק על ידי מעבדת P. Jeremy Wang, אוניברסיטת פנסילבניה</td></tr><tr><td>HRP עזים נגד ארנב IgG&nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>ארנב IgG</td><td>Beyotime, סין</td><td>A7016</td><td></td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף, המבורג, גרמניה</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>סוניפייר דיגיטלי</td><td>ברנסון, ארה"ב</td><td>BBV12081048A</td><td>450 וואט; 50/60 הרץ</td></tr><tr><td>DynaMag-2 מגנט</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>מיני מודול כתם</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>מיני ג'ל טנק</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>חממת טלטול</td><td>אפנדורף, המבורג, גרמניה</td><td>Thermomixer נוחות&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מטחנת רקמות, Dounce</td><td>PYREX, ארה"ב</td><td>1234F35</td><td>בלבד&nbsp; העלי "הרופף" משמש בפרוטוקול זה</td></tr><tr><td>תקן פרופסיוני 96 שיפוע</td><td>ביומטרה, גרמניה</td><td>מספר סידורי: 2604323</td><td></td></tr><tr><td>אקדח צינור&nbsp;</td><td>קריסטל, ארה"ב</td><td>מס' סידורי: 3406051</td><td></td></tr><tr><td>UV-LIGHT CROSS-LINKER</td><td>UVP, USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-טיפול בתרבית צלחות</td><td>קורנינג, ארה"ב</td><td>430167</td><td>100 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות</td><td>קורנינג, ארה"ב</td><td>430791</td><td>צינורות מיקרו-צינורות 15 מ"ל</td></tr><tr><td></td><td>AXYGEN, USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td><ריאגנטים חזקים> </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פנול חומצי/כלורופורם/אלכוהול איזואמיל&nbsp;</td><td>Solarbio, סין</td><td>P1011</td><td>25:24:01</td></tr><tr><td>AffinityScript Enzyme</td><td>Agilent, ארה"ב</td><td>600107</td><td></td></tr><tr><td>נוגד חמצון</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>DH5 &alpha; חיידקים מוכשרים</td><td>Thermo Scientific, ארה"ב</td><td>18265017</td><td>התאים החסכוניים הללו מניבים >1 x 106 transformants/&micro; g בקרת DNA לכל 50 ומיקרו; תגובת L.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, ארה"ב</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>10416014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, ארה"ב</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads חלבון A&nbsp;</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>מגיב ECL</td><td>Vazyme, סין</td><td>E411-04</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>קוקטייל</td> מעכב פרוטאז ללא EDTA AM9260G <td></td></tr><tr><td></td><td>רוש, ארה"ב</td><td>04693132001</td><td>להוסיף</td></tr><tr><td>Exo-SAP-IT</td><td>Affymetrix טרי, ארה"ב</td><td>78201</td><td>PCR ריאגנט לניקוי מוצר&nbsp;</td></tr><tr><td>אנזים FastAP</td><td>Thermo Scientific, ארה"ב</td><td>EF0652</td><td></td></tr><tr><td>LDS מאגר מדגם</td><td>Thermo Scientific, ארה"ב</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose&nbsp;</td><td>לונזה, שוויץ</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>מיצוי ג'ל MiniElute</td><td>QIAGEN, גרמניה</td><td>28604</td><td>חנות עמודות ב -4 ?; מאגר QG = מאגר המסת ג'ל; מאגר PE = מאגר כביסה (לשלב 14)</td></tr> <tr><td>חרוזי סילאן MyONE</td><td>Thermo Scientific, ארה"ב</td><td>37002D</td><td>מיצוי חומצות גרעין חרוזים מגנטיים</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen,ארה"ב</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, ארה"ב</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris ג'ל חלבון</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td></td><td>NP0336BOX 4%&ndash; 12%, 1.5 מ"מ, ערכת</td></tr><tr><td>חיץ NuPAGE MOPS SDS 15 בארות&nbsp;</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>NP0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, ארה"ב</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>צינור כבד ג'ל נעול פאזה (PLG)&nbsp; &nbsp;</td><td>טיאנגן, סין</td><td>WM5-2302831</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems, ארה"ב</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB, ניו אינגלנד&nbsp;</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 PCR מאסטר מיקס&nbsp;</td><td>NEB, ניו אינגלנד&nbsp;</td><td>מאגר M0492L</td><td></td></tr><tr><td>RLT</td><td>QIAGEN, גרמניה</td><td>79216</td><td>מאגר ליזה לטיהור RNA&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA נקי & רכז-5 טורים&nbsp;</td><td>ZYMO RESEARCH, ארה"ב</td><td>עמודות טיהור וריכוז RNA</td><td>R1016</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase</td><td>Promega, ארה"ב</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNase</td><td>Promega, ארה"ב</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>חומר להפחתת דגימה</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>SDS Solution</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td></td><td>15553027 10%</td></tr> <tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>30970</td><td>להגן מפני </td></tr><tr><td>אנזים T4 PNK</td> קל <td>NEB, ניו אינגלנד&nbsp;</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligase 1 גבוה קונק</td><td>NEB, ניו אינגלנד&nbsp;</td><td>M0437M</td><td></td></tr><tr><td>TA / Blunt-Zero תערובת שיבוט</td><td>Vazyme, סין</td><td>C601-01</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI Buffer</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech, סין</td><td>A600198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, סין</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>סרטי רנטגן</td><td>Caresteam, קנדה</td><td>6535876</td><td></td></tr></tbody></table>

משופרת crosslinking immunoprecipitation (eclip) שיטה לזיהוי יעיל של רנ א חלבון מאוגד ב העכבר בתוך הראש

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

הזרע מגדיר תהליך מאוד מסודר של הבחנה של תא נבט זכר ביונקים. בתוך הראש, התמלול והתרגום אינם מצמידים, מפנים את החשיבות של בקרת הגנים שלאחר ההמרה של הביטוי הגנטי שאורגן על ידי RBPs. כדי להבהיר תפקידים מכניסטיים של RBP, מתודולוגיית immunoprecipitation מקשרת (CLIP) ניתן להשתמש כדי ללכוד מטרות ה-RNA הישיר שלה ולהגדיר את אתרי האינטראקציה בפועל. ה-CLIP המשופר (eCLIP) הוא שיטה שפותחה לאחרונה ומציעה מספר יתרונות על פני הקליפים הקונבנציונליים. עם זאת, השימוש ב-eCLIP הוגבל עד כה לקווי תאים, הקורא ליישומים מורחבים. כאן, העסקנו eCLIP ללמוד MOV10 ו MOV10L1, שני ידוע האליסים מחייב RNA, בתוך ביקורות העכבר. כצפוי, אנו מוצאים כי MOV10 בעיקר נקשר ל 3 ' אזורים בלתי מתורגמים (UTRs) של mRNA ו MOV10L1 בררנית נקשר Piwi-אינטראקציה RNA (piRNA) התעתיקים הקודמי. שיטת ה-eCLIP שלנו מאפשרת הגדרה מהירה של מינים מרכזיים של RNA המאוגדים על ידי RBPs שונים באמצעות רצף בקנה מידה קטן של תת-שיבוטים ובכך זמינות של ספריות מאושרות, כצו להליך ברצף עמוק. מחקר זה מבסס את הבסיס הרלוונטי ל-eCLIP בתוך בנות היונקים.

הליך eclip והתוצאות מומחשים באיור 1, איור 2, איור 3, איור 4. עכברים מורדמים עם דו תחמוצת הפחמן וחתך קטן נעשה בבטן התחתונה באמצעות מספריים כירורגיים (איור 2A,B). האשכים לעכבר הוסרו, detunicated ואז UV-crosslinked קושרים לאחר ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול eCLIP כדי לקבוע מטרות של RNA הגדולות של מועמדים RBP בתוך בנות.

משופרת Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) שיטה לזיהוי יעיל של רנ א חלבון מאוגד ב העכבר בתוך הראש

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

חלבונים מחייבי RNA חיוניים לפיזיולוגיה תאית. חשוב לציין, RBP באים לידי ביטוי מאוד ברחבי spermatogenesis ותועדו היטב כמו רגולטורים חיוניים שלאחר שעתוק בכל השלבים של תאי נבט. זיהוי יעדי איגוד הוא קריטי כדי להבהר את התפקידים המקניסטיים של RBP.פרוטוקול זה מייצג יישום מותאם של שיטת eCLIP ללכידת מטרות RNA ישיר אנדוגני ומבסס בסיס ישים עבור eCLIP באדיס יונקים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא אינה רדיואקטיבית, פחות עתירת זמן, ומספקת יחס אות לרעש חזק יותר מכיוון שהקלט התואם לגודל ישמש רקע מתאים ליעדים אותנטיים. לבסוף, אנו חושבים כי רצף בקנה מידה קטן של subclones שימושיים בעקבות רצף עמוק.הדגמת ההליך תהיה שו צ'ישי, עמיתי. כדי להתחיל בהליך זה, לקצור כ -100 מיליגרם של אשכים מעכברים בגיל המתאים לכל ניסוי immunoprecipitation. מניחים את הרקמות ב-PBS קר כקרח.בעזרת זוג פינצטה עדינה, הסירו בעדינות את הטוניקה אלבגינאה. הוסיפו שלושה מיליליטר של PBS קר כקרח למטחנה רקמות, ולהשתמש עלה זכוכית רופף כדי triturate הרקמה על ידי כוח מכני מתון. לאחר מכן, להעביר את ההשעיה רקמה לצלחת תרבות התא, ולהוסיף PBS קר כקרח עד שישה מיליליטר.לנער את הצלחת במהירות, כך נוזל מכסה את החלק התחתון של המנה באופן שווה. לחצות את ההשעיה על קרח שלוש פעמים עם 400 מילי-ג'אול לס"מ בריבוע ב 254 ננומטר. הקפד לערבב את ההשעיה בין כל הקרנה.לאחר מכן, לאסוף את ההשעיה בצינור חרוט 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 1, 200 פעמים g וב ארבע מעלות במשך חמש דקות. הסר את supernatant, ולתלות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, להעביר את ההשעיה לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות, ולהשליך את העל טבעי. ראשית, מוסיפים 125 מיקרוליטרים של חלבון חרוזים מגנטיים לכל מדגם לצינור צנטריפוגה טרי. מניחים את הצינור על המגנט כדי להפריד את חרוזים מהפתרון.לאחר 10 שניות, להסיר את העל טבעי, ולשטוף את חרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ תיזה קר כקרח. תן שימוש חוזר את חרוזים ב 100 microliters של חיץ תיזה קרה עם 10 מיקרוגרם של נוגדן eCLIP. לסובב את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות.לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ תיזה קר כקרח. כדי להתחיל, תן שימוש חוזר כדורי הרקמה במיליליטר אחד של חיץ תזה קרה המכיל 22 microliters של 50x EDTA ללא קוקטייל מעכבי חלבון ו 11 microliters של מעכבי RNase. שמור lysing הדגימות על קרח במשך 15 דקות.Sonicate כל מדגם כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של DNase לכל צינור ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות תוך טלטול ב 1, 200 סל"ד.לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של RNase מדולל ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות תוך רעידות ב 1, 200 סל"ד. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 15, 000 פעמים g וב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לנקות את ליאזט.בזהירות לאסוף את supernatant, ולשמור דגימות קלט עבור דגימות RWB ו- RRI. ראשית, מוסיפים מיליליטר אחד של הליסאט לתרוזים המוכנים, ומסובבים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים או לילה. לאחר מכן, לאסוף את חרוזים עם מעמד מגנטי, ולהשליך את העל טבעי.לשטוף את חרוזים פעמיים עם 900 microliters של חיץ מלח גבוה, ולאחר מכן לשטוף את חרוזים פעמיים עם 900 microliters של חיץ לשטוף. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעם אחת עם 500 microliters של חיץ dephosphorylation 1x. ראשית, להשליך את העל טבעי, ולהשתמש טיפים פיפטה בסדר כדי להסיר כל נוזל שיורית.הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תערובת ראשית של שלוש רצועות עיקריות לכל דגימה, ובדקו בזהירות את פיגט לערבב. הוסף 2.5 מיקרוליטרים של מתאם RNA X1A ו- 2.5 מיקרוליטרים של מתאם RNA X1B לכל דגימה. מערבבים היטב על ידי צינורות או הבהוב.דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך 75 דקות, הקפדה על להעיף את הצינור לערבב כל 10 דקות. לשטוף את חרוזים פעם אחת עם 500 microliters של חיץ לשטוף קר. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעם אחת עם 500 microliters של חיץ מלח גבוה קר ולאחר מכן עם 500 microliters של חיץ לשטוף קר.חזור על שתי שטיפות אלה פעם נוספת. מפרידים מגנטית את חרוזים, ולהשתמש טיפים פיפטה בסדר כדי להסיר כל נוזל שיורית. תוכלו להשתמש מחדש ב-100 מיקרוליטרים של חיץ כביסה קרה, ולעבור 20 מיקרוליטרים לצינורות חדשים כדגימות RWB.הוסף 7.5 microliters של מאגר מדגם LDS 4x ושלושה microliters של סוכן הפחתת מדגם 10x לדגימות הנותרות. דגירה ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות תוך טלטול ב 1, 200 סל"ד. לאחר מכן, לקרר את הדגימות על קרח במשך דקה אחת, צנטריפוגה ב 1, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת.עבור ג'ל RWB, מניחים צינורות על מגנט, וחלבון נפרד eluate מן חרוזים. לטעון 15 microliters של מדגם לתוך כל באר. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של נוגדי חמצון כדי 500 מיליליטר של חיץ ריצה 1x SDS.הפעל את הג'ל ב 200 וולט, 1x SDS פועל חיץ במשך 50 דקות או עד חזית הצבע הוא בתחתית. מעבירים את קומפלקס החלבון-RNA מהג'ל לממברנה ניטרוסלולוס ב-10 וולט למשך 70 דקות במאגר העברה של 1x עם 10% מתנול. חסום את קרום ה-RWB ב-5% חלב ב-TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה.יש לשטוף את הממברנה ב-TBST, ולהידגר בנוגדן ראשוני ב-TBST למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף פעמיים עם TBST, עם כל לשטוף נמשך חמש דקות. דגירה עם נוגדן משני ב- TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה.לאחר מכן, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBST. לאחר מכן, מערבבים נפחים שווים של מאגר ECL A ומאגר B.מוסיפים תערובת זו לממברנה, וגוררים במשך דקה אחת. מכסים את הממברנה בניילון נצמד, וחושפים אותה לסרט רנטגן בטמפרטורת החדר במשך שתיים עד שלוש דקות לפני פיתוח הסרט.במחקר זה, MOV10 eCLIP אשכים מעכברים מסוג בר למבוגרים עם RNase אני מטפל lysate crosslinked, חלבון היעד, שהוא כ 114 קילודלטונים, מועשר בהצלחה. תוצאות qPCR של cDNA מדולל אחד עד 10 מדגימות שונות מגלה כי דגימות שאינן מקושרות להראות התאוששות RNA ירד. הוא ציין כי ערכי Ct של הקבוצה שאינה מקושרת הוא בדרך כלל חמש פעמים יותר מאשר UV-crosslinked קבוצה.תוצאות מייצגות עבור הגברה PCR ובחירת גודל באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז מוצגים כאן. מוצר פריימר-דימר מופיע בכ-140 זוגות בסיסים. תצוגת דפדפן הגנום של UCSC של שני רצפי subclone מייצגים מראה כי תגי eCLIP מאוגדים MOV10 נמצאים ממוקמים בתוך UTR שלוש ראשי של הגן Fto.הקצב המשוער של יעדי UTR תלת-ראשיים מהווה 75%עולה בקנה אחד עם רוב יעדי MOV10 בתאי HEK293 ובבדיקה. לעומת זאת, תגי eCLIP מאוגדים MOV10L1 נמצאים ממוקמים בתוך אשכול piRNA, המציין MOV10L1 מטרות מבשרי piRNA. השיעור המשוער של יעדי מבשר piRNA מהווה 42% המשקפים מגמה ממחקרים קודמים.MOV10L1 eCLIP עם עיכול RNase I של 40 יחידות למיליליטר מניב רצפים גדולים יחסית עם פחות מ-20 זוגות בסיסים. פרוטוקול זה המתואר כאן מייצג תעסוקה של שיטת eCLIP ברבייה, אזור שבו הידע על אינטראקציית RNA-RBP אינו מספיק.

enhanced-crosslinking-immunoprecipitation-eclip-method-for-efficient

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הסידור המרחבי של חלבונים RNA מחייב על תעתיק הוא הקובע המפתח של תקנה שלאחר תעתיק. לכן, פיתחנו הפרט נוקלאוטיד UV ברזולוציה crosslinking ו immunoprecipitation (iCLIP) המאפשר מיפוי מדויק גנום רחב של אתרי הקישור של חלבון-RNA מחייב.

iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

צעד אחר צעד לפרוטוקול בידוד וזיהוי RNA מתחמים הקשורים באמצעות RIP שבב.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

סרטון וידאו זה מדגים את שיטת המשקעים החיסוניים המקושרים המשופרת (eCLIP) לזיהוי חלבונים קושרי RNA באשכים עכבריים. eCLIP מאפשר זיהוי מדויק של אתרי קישור שבהם חלבונים קושרי RNA (RBPs) מתקשרים עם רנ"א המטרה שלהם.

שיטת Crosslinking Immunoprecipitation משופרת לזיהוי יעיל של RNA הקשור לחלבון באשכי עכברים

כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר את אתרי ה-RNA האנדוגניים או "עקבות" של RNA: מכלולי חלבון (RNP) מתאי יונקים. גישה זו כוללת שני immunoprecipitations של RNP תת יחידות, ולכן המכונה RNA immunoprecipitation בטנדם (RIPiT).

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון.

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי ניתן לאימות חלבונים המקיימים אינטראקציה ישירה עם LncRNA: מתאים מתורבתים לאשך עכבר

חקור את שיטת eCLIP המשופרת לזיהוי יעדים של חלבונים מקשרי RNA בעכבר. הפרוטוקול מאפשר מיפוי אינטראקציות RNA-RBP בתוך האשך לחקר רגולציה לאחר תמסורתית בתהליך הספרמטוגנזה.

משופרת Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) שיטה לזיהוי יעיל של רנ א חלבון מאוגד ב העכבר בתוך הראש

גלה סרטונים נוספים