Name: מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: למדו להפעיל מעיכה אחידה על קולטני פני שטח של טסיות דם אנושיות באמצעות ויסקומטריית חרוט-לוח. שיטה זו מאפשרת בקרה מדויקת על משך העיכה ועוצמתה לחקר תגובות תאיות לגירויים מכניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה הרלוונטית למחקר זה נתמכת בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות, ריאות ומכון הדם מענקים HL082808, HL123984 (ר), F31HL134241 (M.E.Q.). מימון שסופק גם על ידי NIH המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית גרנט T32GM008367 (M.E.Q.); והטייס מענק כספים משירותי הבריאות של הילדים של אטלנטה ואוניברסיטת אמורי הזרמת ילדים ליבה. המחברים רוצים להודות ד ר הנס מורן על שיתוף הנוגדן 6B4, ואת הילדים אמורי המרכז לחקר הילד זרימת Cy, ליבת ליבה לתמיכה טכנית.

כל השיטות באמצעות טסיות האדם הנגזר התורם המתואר בזאת אושרו על ידי הלוח סקירה מוסדית של אוניברסיטת אמורי/הבריאות של הילדים של אטלנטה.
1. בידוד דם וטסיות
<ol><li>לצייר דם אנושי מתוך ההסכמה תורמים מבוגרים בריאים באמצעות הניקוב ביום הניסוי לתוך 3.8% trisodium ציטראט. אחד 4.5 mL של דם הוא מספיק כדי להניב מספיק פלזמה עשיר טסיות (PRP) עבור 20-25 תנאים בתורמים אשר ספירות טסיות קרובים ל250 x 103 לכל μl. הערה: הימנע מציור דם באמצעות מחטי מד צר (קטן מ -21 G).</li>
	<li>הכן PRP באמצעות צנטריפוגה ב 22 ° צ' ו 140 x g עבור 12 דקות עם בלם ארוך. זה יגרום שתי שכבות נפרדות, עם כדוריות הדם האדומות בתחתית האור PRP בצבע בראש.</li>
	<li>לבודד את העליון, מעונן, צהוב שכבה של PRP באמצעות ליטוף בזהירות דרך הפיפטה טיפ לחתוך בזווית 45 ° ולקבל את ספירת טסיות באמצעות ספירת דם מלאה (ספירת הדם).</li>
	<li>במידת הצורך, לשטוף את טסיות בתוך מלוחים צינורות (150 מ"מ, 20 מ"מ צינורות) בנוכחות של פרוסטגלנדין E1 (PGE1) ו להשעות מחדש במאגר של tyrode (134 mm הנאקל, 0.34 mm Na2hpo4, 2.9 mm kcl, 1 מ"מ mgcl2, 5 מ"מ גלוקוז, 12 mm נחקו 3, 20 מ"מ Hepes, pH 7.35) עם גלוקוז 5 מ"מ, אחרת, המשך לשלב 1.5. הצעדים הבאים מתארים את הכביסה בקצרה.<ol>
<li>כוונן את נפח PRP ל 10 mL עם מלוחים צינורות באגירה ולהוסיף 0.6 μM PGE1.</li>
		<li>צנטריפוגה עבור 8 דקות ב 1,900 x g, ואז למחוק supernatant ולתת את הגלולה הטסיות לשבת 400 Μl של tyrode של התמיסה ואת הגלוקוז עבור 5 דקות.</li>
		<li>ושמור אותו ללא הפרעה. במשך 30 דקות</li>
	</ol>
</li>
	<li>להתאים את ספירת טסיות כדי ~ 250 x 103 טסיות לכל μl עם ממאגר האדם המסכן טסיות-פלזמה (PPP) ולשמור על ההשעיה ב 22 ° c מופרעת או בסיבוב עדין.</li>
</ol>2. ליגניים ומדים להטות את הטיפול
הערה: כל השלבים בסעיף 2 הדורשים ליטוף צריך להתבצע באיטיות, כדי לא להציג כל הטיה.
<ol><li>הוסף את הנוגדן הרצוי או ליגנד כדי prp או שטף טסיות ולערבב בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה או זע עם טיפ פיפטה. השאירו אותו ללא הפרעה בטמפרטורת החדר עבור 5-10 דקות. הוסף אמצעי אחסון שווה ערך של המאגר של PPP או של Tyrode לפקד שלילי.</li>
	<li>הפעל את לוחית האצטרובל, הגדר את טמפרטורת הצלחת ל -22 ° c ואפשר לזמן לתת לצלחת להגיע לטמפרטורה זו.</li>
	<li>פיפטה התייחס PRP או שטף טסיות על מבוקרת טמפרטורה חרוט הלוחית הזיקוק ישירות במרכז הצלחת. ודא כי כל המדגם מופקד בין החרוט והצלחת בנקודת המגע, ולא על החלק החיצוני של שפת החרוט.</li>
	<li>הטיה בקצב ובמשך המתאים.<ol>
<li>חשב את ההטיה כפי שמצוין במדריך ההדרכה, או כפי שהוצג בעבר15,16.</li>
		<li>קביעת קצב ההטיה מצמיגות ומהמתח הרצוי של ההטיה באמצעות חוק הצמיגות של ניוטון; <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59704/59704eq1.jpg">; צמיגות של פלזמה הוא 1.5-1.6 מצלסיוס (cP)17. לדוגמה, טווח הטיה רגיל עבור זרימת האדם הוא 5-30 דינמיקה/cm2 והטיה צריך להיות מוחל על הזמן ספרה אחת דקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להרים את החרוט של הצלחת slighlty (~ 2 מ"מ) כך את המדגם נשאר במגע עם הצלחת וגם חרוט, ולהשתמש ג'ל טעינת או מיתר הצינורות הארוך כדי לאסוף 5-10 μL מהמרכז של נפח המדגם.</li>
	<li>מודחלת את דגימות המאכלת עם הסמנים הרצויים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. עבור סמנים של זרחן, β-גלקטוז, ו P-selectin להשתמש בחשיפה לקטחסיד בתחום C2 (LactC2) ב 0.08 μM18, אריקה קריסטאלי לקטין (ecl) ב 6.25 μg/ml, ו-Anti-P-בלטין נוגדן (20 μg/ml), בהתאמה.</li>
	<li>לתקן דגימות 2% פאראפורמלדהיד עבור 20 דקות בשעה RT לפני דילול או אחסון קר, ולהמשיך לשלב 3.1 או לאחסן דגימות ב 4 ° c עבור לא יותר מ 12 h.</li>
</ol>3. זיהוי סמנים פני השטח והקישור דרך הזרימה cy, לנסות
<ol><li>לנתח את המדגם באמצעות הזרמת cy, איסוף לפחות 20,000 אירועים עבור כל תנאי.</li>
	<li>עוצמת האות של קוונטייט של סמני הפלורסנט באמצעות ערך הגובה של העוצמה של כל fluorophore או את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית הגיאומטרית (MFI).</li>
	<li>אם במטרה לזהות מרובי טסיות הקישור בעקבות הטיה הטיפול, לנתח את המדגם על הדמיה-מסוגל זרימה cytometer ו כימות הקשר על ידי אזור הפרמטרים יחס הגובה.<ol>
<li>מתווה היסטוגרמה של אזור ו/או יחס גובה-רוחב.</li>
		<li>השתמש בפקד שלילי עם אלבומין סרום בקר (bsa) או הרכב כדי לצייר שער ללא האירועים מעגלי באופן מלא (שער זה מצויר בדרך כלל ביחס גובה-רוחב ~ 0.819,20) ו ככמת את אחוז האירועים בתוך השער הזה. אירועים בעלי יחס רוחב-גובה נמוך יותר נוטים יותר להיות מקושרים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sullivan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-voltage-gated+Ca2%2B+influx+through+mechanosensitive+ion+channels+in+aortic+baroreceptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons.</a> Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).</li>
<li>Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+stretch-activated+ion+channels+in+vascular+endothelial+cells+as+mechanotransducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers.</a> Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).</li>
<li>Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+Cell+Transduction%2C+Tuning%2C+and+Synaptic+Transmission+in+the+Mammalian+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea.</a> Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).</li>
<li>Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gentle+touch+receptors+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The gentle touch receptors of mammalian skin.</a> Science. 346 (6212), 950-954 (2014).</li>
<li>Nelson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).</li>
<li>Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li>
<li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear-dependent+NO-cGMP-cGKI+cascade+in+platelets+acts+as+an+auto-regulatory+brake+of+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis.</a> Nature Communications. 9 (1), 4301(2018).</li>
<li>Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+side+view+flow+chamber+reveals+tether-to-sling+transition+in+rolling+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils.</a> Scientific Reports. 6, 28870(2016).</li>
<li>Brockman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+3D+orientation+of+piconewton+integrin+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces.</a> Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 21584(2016).</li>
<li>Quach, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-independent+immune+thrombocytopenia+via+mechanomolecular+signaling+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets.</a> Blood. 131 (7), 787-796 (2018).</li>
<li>Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factor+VIII+accelerates+proteolytic+cleavage+of+von+Willebrand+factor+by+ADAMTS13%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).</li>
<li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li>
<li>Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+two+domains+of+human+von+Willebrand+factor+that+interact+with+fibrillar+collagen+types+I+and+III%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+clearance+via+shear-induced+unfolding+of+a+membrane+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor.</a> Nature Communications. 7, 12863(2016).</li>
<li>Ikeda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+von+Willebrand+factor+and+fibrinogen+in+platelet+aggregation+under+varying+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress.</a> Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).</li>
<li>Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterhof%2C+N+%22Snapshots+of+hemodynamics%3A+an+aid+for+clinical+research+and+graduate+education%22">Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education</a>. , Springer Science, Business Media. (2010).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+ectodomain+shedding+of+glycoprotein+Ibalpha+by+targeting+its+juxtamembrane+shedding+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).</li>
<li>Samsel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+for+morphologic+and+phenotypic+characterization+of+rare+circulating+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).</li>
<li>Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+image+analysis+and+imaging+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular image analysis and imaging by flow cytometry.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).</li>
<li>Quach, M. E., Chen, W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+platelet+clearance+and+translation+to+improve+platelet+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage.</a> Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר הערכה מהירה ומגוונת של ההשפעה של הטיית למינאר על טסיות דם וקולטני משטח התא. תוצאות הנציג הספציפיות המוצגות כאן מדגישים כיצד ההשפעות של מולטימאריק או ביונטי ליגנדס יכולות להיות מושפעות מזרימת הטיה. בנוסף ליישום זה, שיטת גזירה אחידה כוללת יישומים רחבים בהתבוננות באפקטים התלויים בהטיה. בהעדר זוג מוכר של ליגולי-קולטן, מערכת ההטיה של מדים יכולה גם לזהות את ההשפעות של הטיה על גורמים כגון הצורה והאיתות של התאים, במיוחד כאשר הם משויכים לניתוחי זרימה. מרמזת בחלקו על-ידי איור ...

מכניטורים הם חלבונים המגיבים לגירויים מכניים, כגון לחץ או עיוות מכני/דפורמציה. עבור חלק מהמכבשים, חישת הרטבאליות המכני הללו מפורשת לתפקוד סוגי התאים בהם הם מבוטאים. לקחת, למשל, קולטני למתוח ב baroreceptor נוירונים; אלה תעלות יון מכניתיים רגישות להסדיר לחץ דם על ידי חישת כלי דם "מתיחה"1,2. באוזן הפנימית, ערוצי יון על תאי השיער לזהות דפורמציות מכניות הנגרמת על ידי גלי קול3, ו מכני הסף נמוך המכונה מכונות (ltmrs) להקל על העברת מידע מישוש4. במקרים אחרים מספקים מכניקנים מידע חשוב לתא להקמת הדבקה או התפתחות. תאים יכולים לחוש קשיחות של הסביבה המקומית שלהם, והוא יכול להסתמך על כוחות הקונאקטאליה דרך שלד ציטוטין ואינטגרציה להכתיב צמיחה או התפשטות5,6.
כאשר לומדים קולטן-ליגונים ואינטראקציות בתא או רקמות מבוססי מודלים, שכיחות משותף קיים אשר יכול במהירות ובדייקנות לדווח את ההשפעות של שינוי טמפרטורה, pH, ליג, ריכוז, טונגניות, פוטנציאל הממברנה, ופרמטרים רבים אחרים שיכול להשתנות בvivo. עם זאת, אלה מספר שאומר עלול ליפול קצר כשמדובר לזהות את התרומה של כוח מכני כדי הפעלת הקולטן. אם התאים מחישה את הסביבה המיקרוקומבית שלהם, מזהה גלי קול או מגיבים למתיחה, דבר אחד שמשותף למכונה הזאת הוא שהם משתתפים באינטראקציות שבהן הליקטור, הקולטן או שניהם, מעוגנים ל שטח. Assays שפותחה כדי לבדוק את ההשפעות של כוחות מכניים על אינטראקציות הקולטן לעתים קרובות משקפים פרדיגמה זו. מיקרופלואידיקה ותאי הזרימה משמשים לחקר ההשפעות של הטיית זרימה על תאים וקולטנים7,8. סוגים אלה של ניסויים יש את היתרון של המאפשר כוונון עדין של שיעורי הטיה באמצעות מהירויות זרימה הוקמה. טכניקות אחרות להעסיק בדיקה מולקולרית פלורסנט כדי לזהות כוחות החלים על ידי תאים על משטחים ligand-עשיר, מניב בדיקה מדויקת של סדר הגודל והכיוונים של כוחות המעורבים באינטראקציה9,10.
בנוסף לתחושה המכונה היכן אחד או שניהם מעוגנים על פני השטח, הטיה לחץ עשוי להשפיע על חלבונים ותאים בתמיסה. זה נצפה לעתים קרובות בתאי הדם/חלבונים אשר כל הזמן במחזור, ועשוי להתבטא באמצעות הפעלה של מכונות מכונות כי הם בדרך כלל מעוגן משטח11, או באמצעות חשיפה של רצפי היעד אשר יהיה לחסימה תחת תנאים סטטיים12. עם זאת, טכניקות מעטות יחסית מאפשרות את ההשפעות של כוח ההטיה על חלקיקים בתמיסה. כמה גישות ב-פתרון להציג את ההטיה באמצעות תאים vortexing בהשעיה נוזל עם מהירויות שונות ומשכים, למרות גישות אלה לא יאפשר קביעה מדויקת מאוד של לחץ ההטיה שנוצר. מדידת צמיגות ברוטציה מדידה על ידי החלת כוח מסוים בהטיה לנוזלים. כאן אנו מתארים שיטה מיושמת לקביעת ההשפעה של שיעורי הטיה ספציפיים בתאים או שברי תאים בתמיסה.
אחד החלבונים המבוזרים ביותר על משטח הטסיות הוא מתחם גליקופרוטאין (GP) ליברות-IX. GPIb-IX הוא הקולטן העיקרי עבור חלבון הפלזמה פון Willebrand פקטור (VWF). יחד, זה קולטן-ליגניים וזוג כבר מוכר כבסיס של תגובת טסיות כדי להטות את הלחץ13. במקרה של נזק כלי דם, VWF נקשר קולגן חשוף במטריקס sub-אנדותל14, ובכך לגייס טסיות לאתר של פציעה באמצעות אינטראקציה Vwf-GPIb-IX. VWF מחויבות לאתר הכריכה שלה ביחידת המשנה GPIbα אם GPIb-IX תחת הלחץ הפיזיולוגי הטיה גורם התגלגלות של התחום המכונה המאובחושי הממברנה (MSD) אשר בתורו מפעיל GPIb-IX15. במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי נוגדנים נגד GPIbα, כמו אלה שנוצרו תרומבוציטופניה חיסונית רבים (ITP) חולים, הם גם מסוגלים לגרימת איתות טסיות באמצעות MSD התגלגלות תחת לחץ הטיה11. עם זאת, בניגוד VWF, אשר מקלה על גזירה המושרה GPIb-IX הפעלה על ידי ששתק את הקומפלקס תחת מחזור רגיל, הנוגדנים הדו בעלי היכולת להצליב טסיות באמצעות GPIb-IX ולהתפתח MSD במחזור הדם. בדרך זו, מתקן המופעל בדרך כלל על ידי הטיית פני השטח תחת הטיה ניתן להפעיל בתמיסה. בדוח הנוכחי, ניתן להדגים כיצד מבוסס על מדים מבוססי ומוח להטות את שיטת העבודה היה ממונפת כדי לזהות את ההשפעות של רמות ספציפיות של מתח הטיה על הפעלת הקולטן בפתרון.

<table><tbody><tr><td>APC אנטי אנושי CD62P (P-Selectin)</td> <td>BioLegend</td><td>304910</td><td></td></tr><tr><td>Brookfield Cap 2000+ Viscometer</td><td></td> <td>Brookfield-FITC</td><td></td></tr> <tr><td>מצומד Erythrina cristagalli לקטין (ECL)</td> <td>Vector Labs</td><td>FL-1141</td><td></td></tr><tr><td>Pooled Normal Human Plasma</td><td>Precision Biologic</td><td>CCN-10</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer צינור איסוף דם כחול בהיר (נתרן ציטראט)</td> סט איסוף דם <td>BD</td><td>369714</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer, 21G x &frac34; " מחט</td><td>BD</td><td>367287</td><td></td></tr></tbody></table>

מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

תאים ביולוגיים רבים לחוש את התכונות המכאניות של הסביבה המקומית שלהם באמצעות מכנינים, חלבונים שיכולים להגיב לכוחות כמו לחץ או רטבאליות מכני. מכניקנים מזהים את הגירויים שלהם ומעבירים אותות באמצעות מגוון גדול של מנגנונים. חלק מן התפקידים השכיחים ביותר עבור מכניטורים הם בתגובות נוירואליות, כמו מגע וכאב, או תאי שיער הפועלים בשיווי משקל ושמיעה. המכונה גם חשובה עבור סוגי תאים אשר נחשפים באופן קבוע למתח הטיה כגון תאים אנדותל, אשר קו כלי דם, או תאי דם אשר חווים את ההטיה במחזור הרגיל. ויסברוטרס הם מכשירים המזהים את צמיגות הנוזלים. בנוסף, ניתן להשתמש בגומדי הסיבוב להחלת כוח הטיה ידוע על נוזלים. היכולת של מכשירים אלה כדי להחדיר הטיה אחיד לנוזלים נוצל ללמוד נוזלים ביולוגיים רבים, כולל דם פלזמה. בנוסף, ניתן להשתמש ב-ויסבנסה להחלת הטיה על התאים בפתרון, ולבדיקת השפעות ההטיה בזוגות מסוימים של ליגטיים ולקולטן. כאן, אנו מנצלים חרוט-צלחת ומנסה לבחון את ההשפעות של רמות אנדודוגני של לחץ הטיה על טסיות שטופלו עם נוגדנים נגד טסיות הדם מכונאי קולטן המכונה GPIb-IX.

איור 1 מתאר כיצד מודל ההדק של הפעלת GPIb-IX, בתחילה הציג כדי להסביר הפעלת הקולטן התלוי הטיה כאשר מעוגן לקיר כלי, יכול גם לתמוך הפעלה של טסיות המקושרות על ידי ליגנטי רב. איור 2 מציג את הקריאות של הפעלת טסיות הדם האנושית שטופלו על ידי שני נוגדנים מיקוד התחום N-מסוף של GPIb-IX (6B4 ו-11A8), ונוגדן שליטה אחד (נורמלי igg) תחת תנאים סטטיים והוא. באיור 3, טסיות טופלו עם 6B4 ונוגדן עם כוח בלתי מחייב נמוך מדי כדי להפעיל את ההפעלה GPIb-IX, AK...

אנו מתארים שיטה בפתרון כדי להחיל להטות אחיד כדי קולטני משטח טסיות באמצעות קונוס-צלחת ויסבנסה. ניתן להשתמש בשיטה זו גם באופן כללי יותר כדי להחיל הטיה על סוגי תאים אחרים ושברי תאים, ואין צורך לייעד זוג מסוים של ליגולי-קולטן.

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לענות על מגוון שאלות על האופן שבו ההגיה פועלת על תאים בפתרון ומספק שליטה משמעותית על משך ההגיה ועוצמתה. שלא כמו טכניקות אחרות, אשר לזהות את ההשפעה של גזירה על תאים משותקים, טכניקה זו מאפשרת לנו להחיל גזירה על תאים בתסרון ומשאיל את עצמו לספקטרום של שיטות זיהוי אותות במורד הזרם. לאחר קבלת דם היקפי מתורם מבוגר מסכים ובריא בצינור 4.5 מיליליטר של 3.8% טריסודיום ציטראט, צנטריפוגה הדם כדי להשיג פלזמה עשירה טסיות דם, ולהשתמש טיפ פיפטה לחתוך בזווית של 45 מעלות כדי להסיר בזהירות את החלק העליון, מעונן, שכבת פלזמה צהובה עשירה טסיות.להשיג את ספירת טסיות הדם באמצעות ספירת דם מלאה, ולהתאים את ספירת טסיות הדם כ 2.5 פעמים 10 כדי טסיות הדם החמישית למיקרוליטר עם טסיות אנושיות בריכה פלזמה עניים. לאחר מכן, מניחים את ההשעיה על 22 מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין. לטיפול ליגנד, לאט להוסיף את הנוגדן או ligand של עניין פלזמה עשיר טסיות, ומערבבים את טסיות הדם בעדינות.במהלך הדגירה, הפעל את מד הקרביים של לוחית הקונוס, והגדר את טמפרטורת הלוח ל -22 מעלות צלזיוס. לאחר חמש עד 10 דקות, מעבירים את הפלזמה העשירה בטסיות דם מטופלות אל מד הקרביים של צלחת הקונוסים הנשלטת בטמפרטורה ישירות במרכז הצלחת, תוך טיפול כך שכל הדגימה מופקדת בין הקונוס לצלחת בנקודת המגע. כדי להחיל גזלה על המדגם, לחשב את ההלקיה על פי מדריך viscometer, ולהחיל גזלה על המדגם בקצב ובמשך המתאים.בסוף היישום, להרים את הקונוס על שני מילימטרים מהצלחת, כך המדגם נשאר במגע עם הלוח והן את הקונוס, ולהשתמש קצה צינור טעינת ג'ל כדי לאסוף חמישה עד 10 microliters ממרכז נפח המדגם. לאחר מכן להדגיר את המדגם גזירה עם נוגדנים נגד סמני פני השטח של עניין במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולתקן את הדגימות ב 2% paraformaldehyde במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לנתח את הדגימות לפי ציטומטריית זרימה, לאסוף לפחות 20,000 אירועים עבור כל מצב, ולכומת את עוצמת האות של כל סמן פלואורסצנטי, באמצעות ערך הגובה עבור עוצמת כל פלואורופור.לאחר מכן השתמש בשליטה שלילית עם אלבומין סרום בקר או רכב כדי לצייר שער, למעט אירועי פלואורסצנט רקע שליליים, ולכומת את אחוז האירועים בתוך השער עבור כל תנאי הניסוי. ביטוי סמן הפעלת טסיות דם בתגובה ליישום כוח ההטיה אינו מוסדר באופן תלוי זמן. כאן, קריאה ייצוגית של הפעלת טסיות דם אנושיות בנוכחות שני נוגדנים המכוונים לתחום N-terminal של גליקופרוטאין 1b-IX ונוגדן בקרה אחד בתנאים גזירה וסטטיים מוצגים.הביטוי של כל שלושת סמני ההפעלה הוגדל באופן משמעותי בנוכחות כוחות גזיר ונוגדנים ממוקדים, בהשוואה לתנאים סטטיים או בנוכחות נוגדני בקרה. יש לציין, טיפול בנוגדן עם כוח לא מחייב נמוך מדי כדי להפעיל הפעלת גליקופרוטאין 1b-IX אינו מפעיל סמן הפעלת טסיות דם upregulation תחת תנאים כוח סטטי או גזה. כמו כן, פלזמה מחולי תרומבוציטופניה חיסונית המכילה נוגדנים נגד גליקופרוטאין 1b-IX מפעילה תגובות תלויות גזה בניגוד לפלזמה מחולים ללא גליקופרוטאין 1b-IX מיקוד נוגדנים.בנוסף לניתוחים flowcytometric, תאים שנחשפו גימה יכול גם להיות lysed עבור כתם מערבי, ELISA, וניתוח מפרט מסה כדי לקבוע את כל השינויים ברמת החלבון. כמו תמיד, בעת שימוש בדם או דגימות אנושיות, הקפד ללבוש ציוד מגן תקין ופעל בהתאם לבטיחות המעבדה והנחיות פתוגן שנולדו בדם של המוסד שלך.

a-uniform-shear-assay-for-human-platelet-cell-surface-receptors-via

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מפל הידבקות טסיות מתקיים בנוכחות זרימה גזירה, גורם לא היוו ב קונבנציונאלי (סטטי) היטב הצלחת מבחני. מאמר זה מדווח על assay טסיות צבירה תוך שימוש בתבנית microfluidic צלחת היטב לחקות פיסיולוגי תנאי הזרימה גזירה.

הדבקה צבירת טסיות דם תחת זרימה באמצעות תאים תזרים Microfluidic

סרטון זה מדגים את השיטה להעריך את ההשפעה של לחץ גזירה על טסיות הדם. טיפול בנוגדנים גורם לדיסוציאציה ולשינויים קונפורמטיביים בקומפלקסים מכניים, מפעיל את טסיות הדם ומבטא סמנים על פני השטח. סמנים אלה נצפים באמצעות immunostaining ו cytometry זרימה.

ההשפעות של לחץ גזירה על טסיות שטופלו בנוגדנים נגד קולטנים מכנו-סנסוריים

אנו מתארים שיטה פשוטה עבור בידוד של טסיות נשטף מן הדם האנושי ואחריו מדידות צימות טסיות דם הנגרמת אגוניסט ידי turbidimetry. כדוגמא אנחנו מיישמים שיטה זו לחקר התגובה אגרגציה של טסיות אדם קולגן לאחר דגירה מראש עם מעכב ערוץ Pannexin1 בריליאנט בלו FCF.

Turbidimetry על אדם שנשטף טסיות: השפעת מעכבי Pannexin1 FCF הכחול המבריק על צבירה מושרת קולגן

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

פרוטוקול זה מתאר את כימות התכונות המכניות של קווי תאים סרטניים ולא סרטניים במבחנה. הבדלים שמורים במכניקה של תאים סרטניים ונורמליים יכולים לשמש כסמן ביולוגי שעשוי להיות בעל השלכות על הפרוגנוזה והאבחנה.

פרוטוקול בדיקת גזירה לקביעת תכונות חומר חד-תאי

היווצרות טסיות דם מעודדות נקשרה עם סיכון מוגבר לפקקת. מוצג כאן פרוטוקול מדויק לבידוד טסיות דם שטופות מדם אדם, שנועד לכמת את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית, שהם מאפיינים ייחודיים של טסיות מעודדות.

אפיון טסיות מעודדות קרישה על ידי מדידת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מטסיות אדם מטוהרות

ניתן להעריך את תפקוד טסיות הדם תחת זרימה ולדמות החייאה המוסטטית באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, שיש לו יישומים ברפואת טראומה ועירוי.

מיקרופלואידיקה בהערכת תפקוד טסיות הדם

חילוף החומרים של טסיות הדם מעניין, במיוחד בכל הנוגע לתפקיד של היפראקטיביות והיפראקטיביות של טסיות דם בדימום והפרעות פקקת. בידוד טסיות הדם מפלזמה הכרחי לכמה בדיקות מטבוליות; מוצגת כאן שיטה לבידוד מטבוליטים תוך-תאיים מטסיות דם שטופות.

הכנת טסיות דם אנושיות שטופות למחקרי שטף מטבולי כמותי

ציטומטריית זרימה רב-צבעונית עבור טסיות יכולה לזהות תת-סוגים חדשים של טסיות דם בתוך תת-אוכלוסיות טסיות קלאסיות, כגון טסיות מנוחה, אגרגטוריות, פרוקו-קרישה ואפופטוטיות. זה מאפשר השוואה של דפוסי תת-אוכלוסייה שונים המושרים על ידי אגוניסטים שונים של טסיות דם. כאן מתואר בפירוט הליך להקמת פאנל ציטומטריית זרימה רב צבעוני.

ניתוח תת-אוכלוסיות טסיות על ידי ציטומטריית זרימה רב-צבעונית

הפרוטוקול הנוכחי מספק מערך מקיף של נהלים הדרושים לניתוח טסיות דם פרו-קרישיות, המציגות תכונות חופפות של נמק, אפופטוזיס והפעלת טסיות דם.

ניתוח מקיף של טסיות דם מקרישות המציגות מאפיינים של נמק, אפופטוזיס והפעלת טסיות דם

למדו להפעיל מעיכה אחידה על קולטני פני שטח של טסיות דם אנושיות באמצעות ויסקומטריית חרוט-לוח. שיטה זו מאפשרת בקרה מדויקת על משך העיכה ועוצמתה לחקר תגובות תאיות לגירויים מכניים.

מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח

גלה סרטונים נוספים