קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים
May 29th, 2019
אנו מתארים כאן שיטות לקוונפיקציה רגיש ומדויק של נגעים 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-דאדו) ו-1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) ב-DNA. השיטות הוחלו על הערכת ההשפעות של חומר מקיף חלקיקי הסביבה (PM2.5) ברקמות (ריאות, כבד וכליות) של עכברים חשופים A/J.
השיטות המוצגות כאן מאפשרות כימות נגעי DNA הנגרמים על ידי סטרס חמצוני, ותורמים להבנת מנגנונים פתופיזיולוגיים שעשויים להיות יעד למניעה וטיפול במחלות. סלקטיביות ורגישות הם היתרונות העיקריים. סלקטיביות היא יתרון חיוני בעת עבודה עם דגימות ביולוגיות מורכבות.
HPLC יחד עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית התפתחו כתקן הזהב לסוג זה של כימות עם מטריסות ביולוגיות. סטרס חמצוני הוא אירוע נפוץ לתהליכים פתופיזיולוגיים שונים. רמות גבוהות של אדיאדוקט אתנו זוהו ברקמות או בשתן של חולים עם מחלות דלקתיות.
נגעי הדנ"א מספקים גם מידע על אירועים אנדוגניים המופעלים על ידי חשיפה למזהמים. אם נגעי ה- DNA גדלים, החשיפה עשויה להיות ברמה המגדילה את הסיכון להתפתחות סרטן, למשל. הנגעים ניתן לכמת ב- DNA מכל מערכת הסלולר ולחילופין בשתן, פלזמה, מדיום תרבות רוק עם התאמות בהכנת מדגם.
כדי להתחיל, להשתמש צלחת תרבות להציב על הקרח כבסיס לחתוך חתיכת רקמה עם אזמל. לשקול גרם אחד של הרקמה בכל צינור כתרים 50 מיליליטר לשימוש מיידי. שמור את הרקמה הנותרת על קרח יבש לפני אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס.
לכל צינור, להוסיף 10 מיליליטר של פתרון תריס התא המסחרי המכיל 0.5 מילימולר deferoxamine, ולשמור על קרח. הגדר את הומוגניזר הרקמה למהירות נמוכה, סביב 60 עד 90 סל"ד. הומוגניזציה של הרקמות על הקרח במשך כמה דקות עד הפתרון הוא ללא שברי רקמות.
לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של פתרון proteinase K לכל מדגם הומוגני. לנער את הצינורות על ידי היפוך, ולשמור אותם בטמפרטורת החדר לילה. בבוקר, להוסיף 40 microliters של ריבונוקלאז פתרון, לנער על ידי היפוך, ולשמור את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
הוסיפו חמישה מיליליטר של תוסף משקעים מסחריים לחלבון, מערבולת במרץ וצנטריפוגה במהירות של 2,000 פעמים גרם, ארבע מעלות צלזיוס, למשך 10 דקות. מעבירים את העל-טבעיים לצינורות מכוסים 50 מיליליטר המכילים 10 מיליליטר של isopropanol קר. היפוך הצינורות בעדינות מספר פעמים עד להתבוננות בדנ"א מזרז.
השתמש פיפטה פסטר סגור בסוף כדי לאסוף את ה-DNA זירז. העבר את הדנ"א שנאסף לצינורות המכילים ארבעה מיליליטר של חיץ טריס 10 מילימולאר ודפרוקסאמין מילימולר אחד ב- pH שבע כדי להתמוסס. לאחר הדנ"א מומס לחלוטין בצינורות, להוסיף ארבעה מיליליטר של פתרון כלורופורם המכיל 4% אלכוהול isoamyl לכל צינור.
להפוך את הצינורות 10 פעמים עבור הומוגניזציה, צנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g, ארבע מעלות צלזיוס, במשך 10 דקות, ולהעביר את השלבים העליונים צינורות חדשים. חזור על שטיפה של השלב העליון עם פתרון כלורופורם פעמיים נוספות. לאחר מכן, להוסיף שמונה מיליליטר של אתנול מוחלט ו 0.4 מיליליטר של פתרון נתרן כלורי חמש טוחן כדי לזרז את ה-DNA.
שוב, לאסוף את ה-DNA זירז, ולהעביר אותו לשלושה מיליליטר של 70% אתנול. חזור על הכביסה עם 70% אתנול עוד פעם אחת. להשליך את פתרון האתנול בזהירות, ולהפוך את הצינורות המכילים את ה-DNA זירז על נייר סופג כדי להסיר פתרון עודף.
לאחר הכנת דגימות הידרוליזה DNA עם תקן isotopic 15N5 של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine ו 15N5 תקן isotopic של 1, N2-אתנו-deoxyguanosine על פי כתב היד, להעביר 10 microliters של כל דגימה לתוך צינורות לכימות של deoxynucleosides נורמלי על ידי HPLC-UV. נושא נפח שיורית מיצוי בשלב מוצק. כדי לבצע HPLC, יש לסולק תחילה עמודת C18 המחוברת למחסנית C18 SecurityGuard עם שיפוע של 0.1% עבור חומצה מתנול.
הגדר את התוכנית שיפוע לרוץ מאפס ל 25 דקות עם אפס עד 18% מתנול, מ 25 עד 27 דקות עם 18 עד 0% מתנול, אז מ 27 עד 37 דקות עם 0% מתנול בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה ו 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להזריק נפח בין שניים לשישה microliters עבור כל מדגם שמורות לכמית deoxynucleosides נורמלי. הגדר את גלאי אבא ב 260 ננומטר לשילוב של פסגות deoxyguanosine ו deoxyadenosine.
כדי לבצע מיצוי בשלב מוצק עבור ניתוחים של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine, תחילה לטעון את המחסניות עם סדרה של פתרונות בנפח של מיליליטר אחד. הוסיפו 100% מתנול, מים שעברו דה-מיונז, דגימת דנ"א שעבר הידרוליז, מים שעברו דה-מיונז, 10% מתנול, 15% מתנול, ולאחרונה 100% מתנול לאיסוף. לאחר מכן, המשך בהתאם לכתב היד.
לאחר הכנת דגימות הידרוליזה DNA 15N5 תקן isotopic של 8-oxo-deoxyguanosine, להעביר 80 microliters של כל מדגם לתוך בקבוקונים לניתוח במערכת HPLC-ESI-MS/MS. שמור את 20 המיקרוליטרים הנותרים לכימות של deoxyguanosine ב- HPLC-UV, כפי שנעשה בעבר. לניתוח של 8-oxo-deoxyguanosine על HPLC-ESI-MS/MS, ללטף את עמודת C18 A יחד עם מחסנית C18 SecurityGuard עם שיפוע של ממס A ו- B בקצב זרימה של 150 microliters לדקה ו 25 מעלות צלזיוס.
הפעל את המשאבה הבינארית עם אפס עד 15% של ממס B במהלך 25 הדקות הראשונות, 15 עד 80% של ממס B מ 25 עד 28 דקות, 80% של ממס B מ 28 עד 31 דקות, 80 עד 0% של ממס B מ 31 עד 33 דקות, ו 0% של ממס B מ 33 עד 46 דקות. כוון את 16 הדקות הראשונות של עמוד A אלבנט לבזבוז. טור מצב B על ידי משאבה isocratic עם פתרון של 15% מתנול במים המכילים 0.1% חומצה פורמית בקצב זרימה של 150 microliters לדקה.
לאחר שש דקות, לבדוק את הכרומטוגרמה כדי להבטיח את 8-oxo-deoxyguanosine תקן elutes מעמודה A.במהלך מרווח 16-32 דקות, לעבור את השסתום למצב המאפשר חיבור בין עמודה A ועמודה B.סגור את השסתום ב 32 דקות כדי לחמק 8-oxo-deoxyguanosine מהעמודה השנייה ולקבל שיא כרומטוגרפי חד. לניתוח של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine, elute עמוד C18 יחד עם מחסנית C18 SecurityGuard עם שיפוע של ממס A ו- B בקצב זרימה של 130 microliters לדקה ו 25 מעלות צלזיוס. הפעל את המשאבה הבינארית עם 0% ממס B במשך 10 הדקות הראשונות, אפס עד 20% מהממס B למשך 10 עד 39 דקות, 20 עד 75% מהממס B מ-39 עד 41 דקות, 75% מהממס ב' מ-41 עד 46 דקות, 75 עד 0% מהממס ב' מ-46 עד 47 דקות ו-0% ממס ב' מ-47 עד 60 דקות.
השתמש שסתום מיתוג כדי לכוון את 35 הדקות הראשונות של eluent לפסולת ואת שבר 35 עד 42 דקות למקור ESI. ודא שתקני המודעות חמקו מהעמודה במרווח הזמן שנקבע. לשלב את הפסגות של 8-oxo-deoxyguanosine 15N5 תקן isotopic של 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-אתנו-deoxyadenosine, 15N5 תקן isotopic של 1, N6-אתנו-deoxyadenosine, 1, N2-אתנו-deoxyguanosine, ו 15N5 תקן isotopic של 1, N2-אתנו-deoxyguanosine מ HPLC-ESI-MS/ MSS
חשב את יחסי השטח עבור עקומות הכיול והדגימות. להקים את עקומות הכיול, ולחשב את כמויות הנגעים בכל מדגם מוזרק. שלב את הפסגות של deoxyguanosine ו deoxyadenosine מניתוח HPLC-UV.
השתמש באזורים כדי להקים את עקומות הכיול, ולחשב את כמויות deoxyguanosine ו deoxyadenosine בבעלי חיים בכל מדגם מוזרק. לחשב את שברי טוחנות עבור 8-oxo-deoxyguanosine מעל deoxyguanosine, 1, N6-אתנו-deoxyadenosine מעל deoxyadenosine, ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine מעל deoxyguanosine, אשר נותנים את מספר נגעים לכל מיליון deoxyguanosine נורמלי או deyaoxdenosine. כרומטוגרמה מייצגת של הדנ"א המטוהר המתקבל על ידי HPLC-UV מראה את נוכחותם של ארבעת deoxynucleosides נורמלי, ללא ריבונוקלוזידים RNA, המדגים את טוהר ה- DNA.
כרומטוגרמות מייצגות מ- HPLC-ESI-MS/MS של 8-oxo-deoxyguanosine, 1, N6-אתנו-deoxyadenosine, ו 1, N2-אתנו-deoxyguanosine בדגימות DNA רקמת עכברים מוצגים. הכרומטוגרמה המתקבלת עם זיהוי UV מראה את ארבעת deoxynucleosides נורמלי eluting מהטור הראשון עד כ 10 דקות, עם הפרדה טובה מ 8-oxo-deoxyguanosine, ביטול הפרעות לא רצויות. דבר חשוב לזכור עבור כימות מדויק הוא תמיד את אותן כמויות של סטנדרטים פנימיים בנפח ההזרקה עקומות כיול ודגימות.
השיטות המוצגות כאן עשויות להיות מותאמות לכמות של deoxynucleosides שונה אחרים. הרחבת הרצועה של deoxynucleosides שונה מאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים. אנו יכולים לחקור את תפקידו של נזק חמצוני במצבים שונים כגון חשיפה לשנאת קסנוביוטיקה, סוכרת וטרנספורמציה ממאירית של התא, ולכן לסייע בפיתוח אסטרטגיות מניעה וטיפול.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג שיטות לכימות רגיש ומדויק של נגעי DNA הנגרמים על ידי לחץ חמצוני, באופן ספציפי 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine ואדונטים אתנו. הטכניקות יושמו להערכת ההשפעה של חומר פינקטי מזהם סביבתי (PM 2.5) על רקמות שונות בעכברים מסוג A/J.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- ביוכימיה
- טוקסיקולוגיה
רקע
- לחץ חמצוני קשור לתהליכים פתופיזיולוגיים שונים.
- 8-oxodGuo ואדונטים אתנו הם נגעי DNA משמעותיים.
- HPLC המחובר לספקטרומטריית מסה טנדם הוא סטנדרט זהב לכימות.
- רמות גבוהות של אדונטים אתנו נמצאו בחולים עם מחלות דלקתיות.
מטרת המחקר
- כימות נגעי DNA הנגרמים על ידי לחץ חמצוני.
- הבנת ההשפעות של PM 2.5 על שלמות ה-DNA.
- תרומה למניעה וטיפול במחלות הקשורות ללחץ חמצוני.
שיטות ששימשו
- HPLC המחובר לספקטרומטריית מסה טנדם לצורך כימות.
- ניתוח של נגעי DNA ברקמות ריאות, כבד וכליות.
- יישום של שיטות למטריצות ביולוגיות.
- הערכת סמני לחץ חמצוני בעכברים שנחשפו.
תוצאות עיקריות
- הפגינו סלקטיביות ורגישות גבוהות בכימות נגעי DNA.
- זיהו רמות משמעותיות של נזק חמצוני ל-DNA ברקמות.
- סיפקו תובנות להשפעה של מזהמים סביבתיים על שלמות ה-DNA.
- תמכו בקשר בין לחץ חמצוני למנגנוני מחלה.
מסקנות
- השיטות יעילות לחקר נגעי DNA בדגימות ביולוגיות מורכבות.
- הממצאים מדגישים את החשיבות של ניטור לחץ חמצוני במחקר בריאות.
- נדרש מחקר נוסף כדי לחקור מטרות טיפוליות לנזק חמצוני.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantification of DNA lesions such as 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine and etheno adducts provides a mechanistic biomarker for oxidative stress and electrophilic damage, supporting target validation in toxicology and disease mechanism research. The HPLC-ESI-MS/MS method enables sensitive, selective detection in complex biological matrices, facilitating preclinical assessment of environmental exposures like ambient PM2.5. This approach aids in de-risking therapeutic hypotheses by linking DNA damage to pathophysiological pathways in inflammation, carcinogenesis, and neurodegenerative disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oxidative stress and lipid peroxidation pathways as mechanistic drivers of DNA damage in disease models.
- Operational Value: Provides quantitative lesion levels per million normal nucleosides, supporting biomarker qualification for target engagement.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in DNA repair, oxidative stress response, and electrophile detoxification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers selective and sensitive quantification of specific DNA lesions, reducing false positives in complex tissue extracts.
- Operational Value: Uses isotopically labeled internal standards to correct for losses during hydrolysis and enrichment, ensuring reproducible measurements across sample batches.
- Assay Readiness: Generates chromatographic peak area ratios that enable comparison across treatment groups and time points in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures lesion accumulation in lung, liver, and kidney DNA, offering tissue-specific insight into PM2.5-induced genotoxic stress.
- Translational Continuity: Links environmental exposure to molecular initiating events, supporting extrapolation from animal models to human risk assessment.
- Risk Assessment: Elevated lesion levels correlate with increased cancer risk, informing go/no-go decisions in preclinical safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early toxicology to mechanistic de-risking in lead optimization, particularly for compounds targeting oxidative stress pathways.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by quantifying DNA lesions as functional readouts of oxidative and electrophilic stress in cellular systems.
- Screening: Enables standardized, reproducible measurement of DNA damage in tissue-derived DNA, facilitating compound effect comparison.
- Analytics: Provides molar fraction outputs (lesions per million normal nucleosides) that allow quantitative comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects PM2.5 exposure to DNA damage in mammalian tissues, supporting biomarker relevance in preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: The HPLC-ESI-MS/MS platform can be adapted for other modified nucleosides, creating a reusable capability for genotoxicity assessment across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanistic links between exposure and DNA damage.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through internal normalization and consistent sample preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early biomarker evidence of genotoxic risk, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on DNA lesion profiles in relevant tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DNA isolation, hydrolysis, and HPLC-ESI-MS/MS operation for nucleoside analysis.
- Depends on access to tandem mass spectrometry systems with ESI source and chromatographic switching capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, internal standard use, and data analysis protocols.
- Must account for tissue-specific DNA yield and lesion stability when adapting to different model systems.
- Practical limitation: Method sensitivity depends on efficient DNA purification and absence of co-eluting interferences in complex matrices.
