Name: דור של אלפא-סינונוקלאומין מראש בנוי ממונמרים והשימוש ב Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: למד לייצר סיבי α-synuclein ממונמרים ולהשתמש בהם במודלים חיים לחקר מחלת פרקינסון וסינוקלאומינופתיות. הפרוטוקול כולל בקרת איכות והזרקה נוירוכירורגית מדויקת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים הקרן מייקל ג'יי פוקס, המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (NS099416) ואת מכון המוח ווסטון.

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li>
<li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li>
<li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129(2018).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Over+Quantity%3A+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621(2018).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li>
<li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+disorders+%3A+official+journal+of+the+Movement+Disorder+Society%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li>
<li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12(2017).</li>
<li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson%27s+Disease+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li>
<li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li>
<li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein%2C+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788(2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li>
<li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li>
<li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li>
</ol>

ג'וזף פטרסון, קלווין לוק, ו Caryl Sortwell בכן מעורבים כיום בהסדרים חוזיים עם קרן מייקל ג'יי פוקס לבקרת איכות α-חומר syn שנוצר על ידי פרוטנוס, Inc. Coauthor חבר ניקול פולינסקי, הוא עובד של מייקל ג'יי פוקס קרן, אשר נדבק פרוטאוס, Inc. כדי לייצר α-syn מונומר. כותבי מייגן דאפי, לורה וולפיטלי-דיילי, וניקולס קנאן אין להם מה לגלות.

הפקה של α-פפס syn מסוגל לזריעה נוירונים והמוביל הגוף ההכללות כמו לולי הוא תלוי בגורמים מרובים ומדרגות. גורם קריטי הוא כי ונומרים המשמש ליצירת סיבים צריך להיות מגובש במיוחד עבור fibriliטיזציה4,9,14,15. אם ונומרים אינם מנוסחים עבור fibrilization, סיבים לא יכול להיווצר או סיבים שעושים טופס לא יכול לייצר α-syn פתולוגיה. כמו כן, המאגר שהמונומרים משפיעים גם על הפיבריזציה. ככזה, עבור התוצאות הטובות ביותר, ריכוז המלח צריך להיות כ 100 מ"מ ו-pH בין 7.0 ו 7.3. השלב ההתחלתי המציג את השונות היא השיטה שבה נקבעת תוכן החלבון ההתחלתי, עם המדידה ב-A280, העשויה להפיק תוצאות מדויקות יותר ולכן היא השיטה המועדפת. הפער בריכוז חלבונים יכול להקטין את היעילות של תהליך fibrilization, כמו גם לשנות את הריכוז PFF הניח בשימוש ניסויים. שניהם יכולים לגרום ירידה בזריעת יעילות והשתנות האצווה בין ניסויים.
שלבי בקרת איכות התחלתיים יאשרו תכונות קריטיות של PFFs, במיוחד כי יש להם conbrillary (המיקרוסקופיה אלקטרונים), מכילים מבני עמילואיד (thioflavin T שיטת), ו-הם הפלטטבלה (שיקוע שיטת). חשוב לציין כי התוצאות של שיטת thioflavin T להשתנות עם הזמן הם לא מדד ישיר של כמות מבני עמילואיד להציג, במקום, את התשובה thioflavin צריך לשמש רק כאינדיקטור של נוכחות מבני עמילואיד בתוך הדגימה. Thioflavin T הוא בדרך כלל בשימוש בתוך מבחנה מחוץ לספר, כמו הדבר האמור לעיל להראות את סיבים מכילים מבני עמילואיד. לחילופין, thioflavin S משמש ברקמה כדי לזהות מבני עמילואיד, כפי שמוצג באיור 7. בנוגע לבחינת השאיפה, התוצאות מראות רק כי PFFs נמצאים בעיקר בשבריר שולחן. כמו הדגימות מופעל בתנאים המבודדים, להקה בולטת אחת של כ 14 kDa, הגודל של α-monomers syn, נמצא על ג'לים. הדבר אינו דומה ללהקות המרובות הקיימות במשקולות מולקולריות גבוהות יותר, שצפויות בשימוש ב-PFFs אם נעשה שימוש בג'ל מקורי או בלתי מבוקר. לבסוף, העברת מוצלח של כל הצעדים הראשוניים הללו בקרת איכות אינה מבטיחה α-הכללת הכללה syn פעילות. מסיבה זו, יש להשתמש בניסויים בתרבות התא או בקבוצה קטנה של חיות מוזרקים בניתוח כדי לבדוק את יעילותם של PFFs לפני השימוש בניסויים גדולים יותר.
Sonication הוא צעד מכריע בתהליך ופרמטרים יהיה שונה בהתאם למודל של sonicator בשימוש. יש להחיל את הפרמטרים Sonication ולוודא שקטעים קצרים של PFF הופקו. גודל fibril ריל יש הנושאת על הזריעה, עם סיבים קצר זריעה יותר ביעילות. למרות זרעי סיבים קצר יותר ביעילות רבה יותר, אפקט זה ברמות ואת אורך pff אופטימלית הוא כ 50 ננומטר4,18. חשוב גם לא לsonicate מחדש את הדגימות ולחשוף את PFFs לחום מוגזם, כי זה עלול להפחית את היעילות לזריעה. Sonicated PFFs אלה צריך להיבדק עבור יעילות בתרבות התא קטן או בניסויים vivo לפני השימוש בניסויים בקנה מידה גדול יותר. כמו הפעלות sonication שונות יש את הפוטנציאל להציג את השונות, קבוצות הטיפול הניסיוני צריך להיות מתוכנן בהתאם.
בעת אספקת pffs ב vivo, לוקליזציה של אתר ההזרקה (s) ואת pffs הסכום הכולל שימוש יכול להשפיע על מספר הנוירונים שיפתחו הכללות, כמו גם את היקף ניוון נוירואני7,14. הקואורדינטות בפרוטוקול לספק מקום להתחיל, אבל יש לבדוק בתוך המעבדה כדי להבטיח את אזור היעד הרצוי מפתחת α-syn פתולוגיה לפני שימוש בניסויים בקנה מידה גדול. במקרה הצורך, ניתן להשתמש בחרוזי צבע מעקב או בצבעי פלורסנט כדרך לבדיקת המיקוד האזורי לפני השימוש ב-PFFs. כמות pffs המשמש ב-vivo משתנה בין קבוצות, עם רוב הקבוצות באמצעות סך של 5 עד 20 μg של pffs אחד או מחולק בין שני אתרי הזרקה1,2,3,4,5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , 14. כמספר אתרי הזרקה, מיקום אתרי הזרקה, וכמות pffs מוזרק יכול להשפיע על תוצאות והתקדמות של synucleinopathy, את תוצאות הזרם של הפרמטרים המשמשים צריך להיות מאופיין לפני באמצעות המודל כדי ל בדוק התערבויות פוטנציאליות או בחינת תכונות הזמני של המודל.
בעת בחירת מודל לשימוש עבור בדיקות therapeutics או לימוד התקדמות המחלה, המודל המשמש יש לבחור כדי לענות במידה הטובה ביותר את השאלה שנשאלה. לא כל הדגמים יהיו בעלי תכונות מחלות מסוימות של PD, או להציע את פרק הזמן הדרוש כדי לבדוק התערבויות פוטנציאליות. מודל PFF מסכם את תכונות המפתח של PD, כגון α-syn פתולוגיה וניוון שולי, והוא יכול להוביל ליקויים מוטוריים צנוע. המודל מציע קורס זמן צפוי וממושך, שבו הכללות הטופס חודשים לפני ניוון שונות. זה מאפשר לחוקרים לבחון ולנצל את השלבים השונים במהלך ההתקדמות הממושכת של הסיננופתיה. השימוש הנוכחי והעתידי של המודל הכולל צפוי להיות מועיל במחקר של התקדמות המחלה ופיתוח של טיפולים חדשניים.

מחלת פרקינסון (PD) מאופיינת בעיקר לאחר המוות על ידי שני מאפיינים פתולוגיים עיקריים: אלפא-סינוקלינים נפוצים ומתקדמים (α-syn) פתולוגיה, והתנוונות שונות. בעקבות ההזרקה לתוך עכברים ומסוג ובחולדות, α-syn סיבים מראש (pffs) לגרום הצטברות מתקדמת של מהלך פתולוגי-syn, אשר יכול לגרום ניוון ממושך של compacta הכושי pars (snpc) דופמין נוירונים במהלך הרבה חודשים, כמו גם sensorimotor,1,2,3,4,5,6. נוירונים חשופים α-syn fibrils, או באמצעות הזרקה ישירה גרם או הוסיף התקשורת של נוירונים מתורבתים. כאשר ה-pffs נלקחים אל הנוירונים, מפעל ה-pffs כדי "זרע" היווצרות הכללות באמצעות בתבנית, והצטברות של אנדוגני α-syn לתוך הכללות זרחניים1,7,8, . בסדר, תשע הכללות לחלוק מאפיינים דומים לגופי הלוי: המכיל α-syn זרחני ב סרין 129 (pSyn), אוביקווילין, ו p62; בעל מבנים בעלי עמילואיד כמוצג עם הצביעת thioflavin חיובית; והינם עמידים בפני העיכול הפרוטאינאז1,3,5,7,8,9,10,11, . שתיים עשרה חשיפה pff מוביל α-syn הכללה היווצרות בראשי וכמה מונצח נוירונים בתרבות, כמו גם עכברים, חולדות, ופרימטים לא אנושיים ב vivo1,2,3,4, . חמש,שש,שבע,שמונה,תשע,13 חשוב לציין כי PFFs לא יוביל α-הכללה צין היווצרות במודלים כל תרבות התא ומספר נוירונים תרבותיים יהיה זרע טוב יותר מאחרים.
תכונה חשובה נוספת של מודל PFF vivo α-syn הוא השלבים הפתולוגיים ברורים שצצים במשך מספר חודשים. ב מכרסמים, בעקבות הזרקת הפנימי, α-הכללה syn היווצרות בדרך כלל פסגות בתוך SNpc ואזורים קורטיקליים רבים בתוך 1-2 חודשים. שיא זה לאחר מצבור של nigrostriאטאטאל ניוון ≈ 2-4 חודשים מאוחר יותר1,3,5. אלה שלבים פתולוגיים שונים לספק לחוקרים את הפלטפורמה שבה ללמוד ולפתח אסטרטגיות כי 1) ירידה α-מצבור syn, 2) ברור כבר הקימו-הכללות syn, ו/או 3) למנוע ניוון שלאחר מכן. מודל PFF מציע יתרונות וחסרונות ברורים לעומת הנוירוטוקסיונים, הטרנסגניים, ויראלי וקטורי מתווכת α-ביטוי מודלים syn כפי שנבדקו קודם לכן6. הבחירה של איזה מודל או גישה לקחת צריך להיקבע על ידי איזה מודל המתאים ביותר לשאלה שהחוקרים שואלים.
למרות המודל pff כבר מנוצל בהצלחה על ידי מעבדות רבות, יש עדיין קבוצות שחוו חוסר עקביות עם הפקת סיבים והפקה עקבית α-syn פתולוגיה14. דוגמאות של חוסר עקביות נע בין pffs כי לייצר מעט או ללא α-syn פתולוגיה, אצווה כדי זריעה האצווה, ואף הכישלון של סיבים לטופס. כך, את הסטנדרטיזציה של α-syn PFF הדור וביישום vivo הוא קריטי על מנת לאפשר פרשנויות מדויקות לגבי ההשפעה של התערבויות הספר הטיפולית. הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הנדרשים עבור דור PFFs מ-α-מונומרים syn, בקרת איכות מחוץ גופית של PFFs נוצר פעם, sonication ומדידה של PFFs לפני השימוש, והצעות כדי להקל בהזרקה vivo של PFFs לתוך חולדות או עכברים.

<table><tbody><tr><td>1x דולבקו s פוספט חוצץ</td> מלח <td>תרמו פישר (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-אלפא-סינוקלאין (זרחן בסרין 129)</td><td>Abcam</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-אלפא-סינוקלאין</td><td>Abcam</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ביסינצ'ונית</td><td>תרמו פישר (פירס)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>צינורות כיווץ רפואי שקוף (קוטר פנימי של 0.036 אינץ')</td><td>נורדסון רפואי</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>צינורות כיווץ רפואיים שקופים (קוטר פנימי של 0.044 אינץ')</td> <td>נורדסון רפואי</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>נחושת גופרתית</td><td>תרמו פישר (פירס)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoTop מכסה מחומם</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/מצופה פחמן רשתות מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>צינור נימי זכוכית (קוטר חיצוני 0.53 מ"מ; קוטר פנימי 0.09 מ"מ; אורך 54 מ"מ)</td><td>Drummond</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מחט זכוכית</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון</td><td>המילטון</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>מונומר אלפא-סינוקלאין אנושי ליצירת סיבים</td> <td>מוכנים מראשProteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>מונומר אלפא-סינוקלאין עכבר ליצירת סיבים מוכנים מראש</td><td>Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>צינורות כיווץ רפואי כתום (קוטר פנימי של 0.021 אינץ')</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>קצה Qsonica 3.2 מ"מ</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Q125 סוניקטור</td><td></td><td>Qsonica Q125</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>EMD Millipore</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit</td><td>Genscript</td><td>L00350C</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

דור של אלפא-סינונוקלאומין מראש בנוי ממונמרים והשימוש ב vivo

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

השימוש ב-vivo alpha-syנוקלאוניקיים מראש fibril ריל (α-syn PFF) מודל של syנוקלאונופתיה הוא צובר פופולריות בקרב החוקרים במטרה לדגמן מחלת פרקינסון הניוון והתנוונות. הסטנדרטיזציה של α-syn PFF הדור וביישום vivo הוא קריטי על מנת להבטיח עקבית, בעלי α-syn פתולוגיה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדור של סיבים מ-monomeric α-syn, לאחר fibriliטיזציה בקרת איכות שלבים, ופרמטרים הציע הזרקת נוירוכירורגית מוצלחת של α-לאחר pffs syn לחולדות או עכברים. החל ב-monomeric α-syn, fibrilization מתרחשת על תקופת דגירה של 7 ימים תוך כדי טלטול על תנאי מאגר אופטימלי, ריכוז, וטמפרטורה. לאחר fibrilization בקרת איכות מוערך על ידי הנוכחות של שולחן סיבים באמצעות שיקוע, היווצרות של מערך עמילואיד ב-סיבים עם מבנה T thioflavin, ו הדמיה אלקטרונים מיקרוסקופיים של סיבים. בעוד אימות מוצלח באמצעות בחני אלה הוא הכרחי להצלחה, הם לא מספיקים כדי להבטיח pffs יהיה זרע α-הכללות syn בנוירונים, כמו פעילות צבירה כגון של כל אצווה pffs צריך להיבדק בתרבות התאים או כנופיית בעלי חיים טייס. לפני השימוש, PFFs חייב להיות sonicated תחת תנאים סטנדרטיים בדיוק, ואחריו בדיקה באמצעות אלקטרון מיקרוסקופ או פיזור אור דינמי כדי לאשר אורכי בריל הם בטווח גודל אופטימלי, עם אורך ממוצע של 50 ננומטר. לאחר מכן ניתן להוסיף PFFs למדיית התרבות של התאים או לשימוש בבעלי חיים. מחלות הזיהוי על-ידי כתמים חיסוני זרחן-syn (psyn; סרין 129) הוא לכאורה ימים או שבועות מאוחר יותר בתרבות התא מודלים מכרסמים, בהתאמה.

דור של סיבים מ α-מונמרים syn מתחיל בקביעת ריכוז של המונמרים. ניתן להשתמש הן בשיטת BCA והן במדידה של ספיגת ב280 ננומטר (A280) כדי למדוד את תוכן החלבון; עם זאת, תוצאות המתודה של BCA הציעו ריכוז גבוה יותר מהשיטה A280. PFFs נגזר העכבר α-מונומר syn היה ערך BCA של 14.05 ± 0.22 ו A280 של 8.05 ± 0.03 μg/μL (איור 1). כמו כן, PFFs נגזר האדם α-מונומר syn גם נראה להיות בריכוז גבוה יותר, עם ערך BCA של 12.95 ± 0.38 ו A280 של 7.83 ± 0.05 μg/μL (איור 1). מדידות A280 הם ספציפיים α-syn מבוסס על הכללת מקדמי הכחדה ואת התוצאות הללו שימשו כדי לדלל את המונמרים לפני הדגירה 7 ימים.
לפני דגירה, הנוזל המכיל את המונמרים הסינטטיים היה ברור, אבל צריך להופיע לאחר היווצרות fibril ריל. בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרוני שידור אישר נוכחות של fibrils ארוכים, מדידת 10-20 ננומטר רחב (איור 4). בהשוואה, α-המונמרים הסינטטיים היו בקושי גלויים ללא צורה ניכרת לעין (איור 4). עם אישור חזותי של מבנים fibrillar, היווצרות עמילואיד של סיבים היא התכונה הבאה של pffs כי יש אישור באמצעות thioflavin T שיטת. Thioflavin ' T מציג פלואורסצנטית משופרת כאשר קשירה ל עמילואיד; כך, אות פלורסנט מוגברת מן הדגימות מעיד על נוכחות של עמילואיד. לדוגמה, thioflavin ב dPBS הפיק אות של 3,287 ± 580 יחידות פלורסנט יחסית (RFU), עכבר α-מונומר syn הפיק אות של 4,174 ± 158 RFU, ו PFFs העכבר הפיק אות של 59,754 ± 6,224 RFU (איור 5). לעומת זאת, האדם α-מונומר syn הפיק אות דומה של 4,158 ± 105 rfu לעכבר מונומר, ו pffs האדם הפיק אות גבוה יותר של 1,235,967 ± 113,747 rfu לעומת pffs העכבר (איור 5). כדי להעריך את הנוכחות של הפלשולחן fibrils, בוצע שיקוע. . פיבריס יגלולה עם צנטריפוגה בשני העכברים ודגימות PFF אנושי, שבר supernatant צריך יותר חלבון בגלולה מאשר supernatant (איור 6). לעומת זאת, רוב החלבון מהעכבר והמונמרים האנושיים נכחו בסופרנטאנט, עם מתנה קטנה בתוך הגלולה (איור 6). כאשר ה-PFFs נוכח באופן בלתי-מידי אלקטרון מיקרוסקופ, מבני עמילואיד בהווה, ו-pbrils שולחן, העברת הכול בשלבי בקרת איכות חוץ גופית.
שני העכברים והעכבר האנושיים הsonicated לייצר פפס באורכים מתאימים לזריעת הכללות-syn4,18. PFFs היו מדולל לריכוז הרצוי של 4 μg/μL ו sonicated. באופן מיידי לפני הניתוח, 25 ברילס מייצגים שנוצרו על ידי אלקטרון מיקרוסקופ ונמדד למקום לבדוק את גודל fiבריל. PFFs sonicated העכבר נמדד 48.8 ± 3.1 nm, ואילו PFFs האדם נמדד 52.1 ± 4.4 ננומטר באורך; PFFs של שני המינים היו אפוא האורך המתאים (50 ננומטר או פחות) כדי לגרום לזריעה פעילות. בדיקה מקיפה יותר של כ 500 סיבים חשף את אורך התפלגות האורך הממוצע של סיבים העכבר הsonicated. האורך הממוצע היה 44.4 ± 0.6 nm, עם 86.6% של PFFs מדידה 60 ננומטר או פחות (איור 4). לעומת זאת, PFFs האדם בממוצע 55.9 ± 1.1 nm עם 69.6% של PFFs מדידה 60 nm או פחות (איור 4).
בעקבות הזרקה של sonicated עכבר pffs לתוך חולדות כפי שתוארה בעבר3,5, סדרה של מקטעי רקמות עובדו ב 2 חודשים לאחר ניתוח, כאשר מספר הכללה המכילה נוירונים ידוע לשיא ב ה-SNpc, לקבלת אישור של הכללות זאילות-syn5. הכללת נושא הנוירונים, כפי שמצוין על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיה עבור pSyn (נוגדן בטבלה של חומרים) נמצאים בתוך Snpc (איור 7), כמו גם אזורים אחרים ברחבי המוח אשר innervate הסטריאטום (קדמי גרעין הריח, מנוע, cingulate, פיריפורם, פרלימלי, סוחושי, אנורהיאל, ומבודדים קורמיתיים, אמיגדלה, סטריאטום,1,3,4,5,19. הכללות אלה חולקים מאפיינים דומים עם גופי לולי, כגון מחייב thioflavin S, והתנגדות של סך α-צין כדי פרוטאינאז K (איור 7), כפי שמוצג על ידי מכתים אימונוהיסטוכימיה (נוגדן פרוטטינואז k בטבלה של חומרים) . אישור של זריעה בתוך המוח מצביע על בקרת איכות vivo כבר עבר, ו-ali, ts של PFFs הוקפאו בעבר ונשמר מאותה אצווה יכול להיות sonicated תחת פרמטרים זהים, עם אורך מאומת, בניסויים גדולים יותר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> איור 1 . שיטות לדור של α-הפיבריס. מתאר את הצעדים הדרושים להפקת סיבים מ α-מונומרים syn. Monomers הם centrifuged עבור 10 דקות (15,000 x g, ב 4 ° c). הסופרנטאנט מועבר לצינור נקי וריכוז החלבון נקבע על ידי הספיגה ב-280 ננומטר, או שיטת BCA. גרף מראה ריכוזים של. עמודות מציינות את המשמעות של הקבוצה, קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של ± 1 של הממוצע. לאחר ריכוז החלבון נקבע, α-ונומרים syn מדולל, לזמן קצר ומלא מופרית ו מודבטים עבור 37 ° c עבור 7 ימים, תוך כדי טלטול על מערבל מסלולית להגדיר ב 1,000 RPM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> איור 2 . צביעת שיטות עבור שידור אלקטרון מיקרוסקופ. דיאגרמת כתמים שליליים למיקרוסקופיה אלקטרונית. A) תמונות המתארות את רשתות הדגימה של המיקרוסקופיה אלקטרונים. לרשת יש צד עמום או בהיר ומבריק או אפל. הצד המבריק/אפל מצופה בסרט התומך formvar/פחמן. ב) איור של הליך כתמים. הרשת היא צפה מבריק/צד כהה על הטיפה הראשונה של ddH2O עבור 1 דקות ואת עודף הוא מרושע משם עם נייר סינון. התהליך חוזר על עצמו עם הטיפה השנייה של ddH2O, pffs מדולל או monomers, שתי טיפות של אצטט uranyl, ושתי טיפות נוספות של ddh2o. רשתות עשוי להיות מאוחסן בתיבת רשת עד ליצירת תמונה. סרגל בקנה מידה = 3 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> איור 3 . הרכבה של מזרקים מותאמים אישית זכוכית מחטים. תרשים של הצעדים הנדרשים להרכיב מחט זכוכית מוצמד מזרקים. צינורות הזכוכית הניסטריזציה משכו וחותכים באמצע כדי לייצר מחטי זכוכית. מכווץ לעטוף אבובים משמש להכנת מחט מתכת טופס חותם פנימי כאשר מחט זכוכית מחליקה על מחט מתכת. שתי שכבות נוספות של הכיווץ לעטוף אבובים החופפים את הבסיס של מחט זכוכית המחט מתכת הוסיף ברציפות וחום מוחל כדי לאבטח את המחט זכוכית טופס חותם הדוק מים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> איור 4 . ויזואליזציה של α-מונמרים סינטטיים והα-syn סיבים באמצעות שידור אלקטרון מיקרוסקופ. מיקרוגרפים מייצגים של α-מונמרים סינטטיים ופיברינים. לוחות העליון: העכבר והאדם α-מונומר syn. לוחות הביניים: עכבר באורך מלא ו-האדם α-שצין. לוחות התחתון: העכבר והאדם α-לאחר sonication. הגרף התחתון: הפצת העכבר sonicated ו-האדם α-syn PFF אורכי. סרגל קנה מידה = 500 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> איור 5 . אישור של מבני עמילואיד על ידי שיטת thioflavin. מדידה של אות פלורסנט מעכבר ו-האדם α-מונומר syn ו PFF דגימות. שמאל: תוצאות מהעכבר-מונומרים סינטטיים ו-α-הפפס syn. מימין: תוצאות של מונמרים מבוססי-האדם-syn והα. שליטה שלילית של dPBS מוצגת בכל גרף. כל המדידות מבוטנות כיחידות פלורסנט יחסיות (RFU). עמודות מציינות את המשמעות של הקבוצה, קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של ± 1 של הממוצע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> איור 6 . משקעי שאיפה לפלטלשולחן α-syn. תמונות מ-coomassie ג'לים ויטראז '. להקות המוצגות הן בערך 14 kDa בהתבסס על סולם החלבון. משמאל: עכבר מונומר ו PFFs. מימין: מונמרים ומבני אדם. עבור כל דגימות מונומר ו PFF, את הגלולה מושעה (P) ו supernatant (S) מוצגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> איור 7 . תכונות של הכללות במודל חולדה מאשרת α-syn פתולוגיה. מיקרוגרפים מייצגים של החומר. בתוך 2 חודשים לאחר ההזרקה שמאל: נוירונים המכילים pSyn ומוכתם נגד cresyl סגול. באמצע: הנוירונים החיוביים של Thioflavin. מימין: α-syn-המכיל הכללות עמידים פרוטאינאז K. סרגל סרגל = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

המטרה של מאמר זה היא לתאר את השלבים הדרושים עבור הדור של סיבים אלפא-synuclein, בקרת איכות הבאים, והשימוש של סיבים מראש בvivo.

דור של אלפא-סינונוקלאומין מראש בנוי ממונמרים והשימוש ב Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

מודל פיבריל פרפורמציה אלפא-Synuclein נמצא בשימוש על ידי מעבדות ברחבי העולם כדי ללמוד סינוקלינופתיות. למרות המודל שימש בהצלחה על ידי מעבדות רבות, קבוצות מסוימות חוו חוסר עקביות יצירת fibrils והפקת פתולוגיה אלפא-סינוקלין עקבי. אנו מקווים כי פרוטוקול זה, אשר מפרט את הדור של fibrils מן מונומרים אלפא-סינוקליין ושימוש fibrils מעוצב מראש ב vivo, יכול לענות על שאלות שיש לחוקרים על השימוש במודל.מודל פיבריל בעל מבנה מקדים אלפא-סינוקליין מסכם תכונות מפתח של מחלת פרקינסון, כגון פתולוגיה אלפא-סינוקליין ונוירוזנרציה. וזה הוכח להוביל לליקויים מוטוריים צנועים בכמה דגמים של בעלי חיים. היווצרות של תכלילים המכילים זרחן אלפא-synuclein ומסלול זמן ממושך לקראת ניוון עצבי מציע לחוקרים שלבים שונים לאורך כל התקדמות הסינוצלינופתיה, כדי ללמוד ולמקד התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.מדגים את הכנת מחטי זכוכית מותאמות אישית, הוא טכנאי המעבדה שלנו, כריסטופר קמפ. כדי להתחיל בהליך זה, להפשיר מונומרים אלפא-סינוקליין על קרח. התפיחה מחדש את המונומרים המופשרים על ידי החלקה עדין על הצינור.וצנטריפוגה ב 15, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, להעביר את supernatant לצינור נקי 1.5 מ"ל מיקרו צנטריפוגה ולתרשם את הסכום שהועבר. לדלל את מונומרים עם 1x dPBS לריכוז סופי של 5 מ"ג לכל מ"ל.בקצרה מערבולת לערבב, בקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינור. לאחר מכן, השתמש בסרט דבק כדי לאבטח את מכסה צינור המיקרו צנטריפוגה סגור. מניחים את הצינור לתוך מערבל תרמו מסלולית עם מכסה במשך שבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול ב 1, 000 סל"ד.בתום שבעה ימים, תכולת הצינור אמורה להיראות קשה. ראשית, לא כל ציוד מגן אישי הכרחי כולל כפפות, חלוק מעבדה, ומגן פנים. לאחר מכן, במכסה המנוע של תאים, חבר בדיקה בקוטר 3.2 מ"מ לממיר.הגדר את משרעת sonicators ל 30% ואת הדופק לשנייה אחת על ושנייה אחת את הזמן לדקה אחת. להפשיר את fibrils בטמפרטורת החדר, ובעוד עדיין במכסה המנוע התרבותי, לדלל את fibrils עם dPBS סטרילי. לאחר מכן, לעמעם רקמת מעבדה עם 70% אתנול ולהשתמש בזה כדי לנגב את הבדיקה של sonicator כדי לנקות אותו.תטביע את קצה הגשוש במים כפולים ופעימות 10 פעמים כדי לנקות את הגשוש עוד יותר. לאחר מכן, לנגב את החללית יבש עם רקמת מעבדה. מניחים את קצה החללית ניקה לתוך הצינור של fibrils מדולל ולמקם את הקצה בתחתית הצינור.Sonicate את fibrils מדולל באמצעות הפרמטרים שנקבעו בעבר תוך הזזת החללית למעלה ולמטה במהלך כל פעימה כדי להבטיח כי כל fibrils בנוזל הם sonicated. לאחר sonication, לזמן קצר צנטריפוגה לשנייה אחת ב 2, 000 גרם כדי לאסוף את כל הנוזלים מצדי הצינור. להטביע את קצה החללית ב 1%SDS ודופק 10 פעמים כדי לנקות את החללית.לאחר מכן, להסיר את הקצה מן SDS, ולהטביע אותו במים מזוקקים כפולים, ואת הדופק 10 פעמים. לנגב את החללית עם רקמת מעבדה מעומעמת עם 70% אתנול ולנגב אותו יבש עם רקמת מעבדה יבשה. נתק את הגשוש מהממיר ואחסן אותו.לאחר מכן, לנגב את כל המשטחים במכסה המנוע עם 1%SDS ואחריו 70% אתנול. כדי להתחיל, מניחים צינור נימי זכוכית סיליקון לתוך מושך מחט זכוכית. הפעל את גוף החימום, ולאפשר משקולות מחובר למתוח את צינור נימי זכוכית מחומם.לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את צינור נימי זכוכית משך בנקודה הדקה ביותר באמצע ולהסיר את מחט הזכוכית מן מושך מחט זכוכית. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך אורך של צינורות לעטוף כיווץ כ 40 מ"מ. החלק את העטיפה להתכווץ מעל מחט המתכת של מזרק משופע 10 מיקרוליטר.השתמש להבה פתוחה כדי לחמם לדבוק לעטוף את הפסיכולוג על המחט, תוך הקפדה לסובב את המחט כדי להחיל חום באופן שווה. החלק את הקצה הגדול יותר של מחט הזכוכית שנמשכה בזהירות מעל מחט המתכת של המזרק. לאחר מכן, לחתוך אורך של צינורות לעטוף להתכווץ כ 40 מ"מ בזהירות להחליק אותו על מחט הזכוכית כדי לחפוף את הבסיס של מחט הזכוכית ואת מחט המתכת של המזרק.השתמש בלהבה פתוחה כדי לחמם את לעטוף להתכווץ כדי לאבטח את מחט הזכוכית למחט המתכת. כדי לאבטח עוד יותר את המחט ולמנוע דליפות פוטנציאליות, לחתוך אורך נוסף של צינורות לעטוף כיווץ כ 40 מ"מ, בזהירות להחליק אותו על מחט הזכוכית כדי לחפוף את הבסיס של מחט הזכוכית ואת מחט המתכת של המזרק. השתמש בלהבה פתוחה כדי לחמם את לעטוף להתכווץ כדי לאבטח את מחט הזכוכית למחט המתכת.לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לקצץ את מחט הזכוכית, כך הקצה הוא כ 8 מ"מ אורך. כדי לבדוק את המחט, למלא מזרק 1 מ"ל עם מחט 26 מד מחובר עם מים מזוקקים. הסר את בוכנה מתכת ממזרק מחט זכוכית מותאם אישית ולהכניס את המחט של מזרק מלא מים לתוך הבסיס של המזרק המותאם אישית.בדוק את הממשק של מחט הזכוכית ומחט המתכת לדליפות ולאשר זרימה קבועה של מים. לאחר מכן, מלאו צינור מיקרו צנטריפוגה במים מזוקקים. השתמש במזרק מחט זכוכית מותאם אישית כדי לצייר במים מזוקקים.בדוק את המחט כדי לאשר נוזל נלקח לתוך המזרק, כי אין בועות. אם יש בועות, או אם המים לא נמשכים לתוך המחט, גיזום המחט יכול לעזור להקל על הלחץ. לאחר מכן, אחסן בזהירות את המזרק עם מחטי הזכוכית המחוברות, בקופסאות המזרק עד לצורך ניתוחים.בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור מאשר את נוכחותם של fibrils ארוך. לשם השוואה, מונומרים אלפא-סינוקלין הם שעורה גלויים ואין להם צורה ניכרת. אישור אנאליואיד של fibrils הוא אישר לאחר מכן באמצעות Thioflavin T Assay.מבחן מייצג מראה את dPBS מונומרים העכבר לייצר אות נמוך יותר ביחידות קמח יחסית לעומת העכבר PFFs. מונומר אלפא-סינוקליין אנושי מייצר אות דומה מונומר העכבר. בעוד PFFs האנושי כמו כן לייצר אות גבוה יותר מונומרים.כדי לתחת את נוכחותם של יתולים pelitible, בדיקת מעים מבוצעת. הן בדגימות העכבר והן בדגימות PFF האנושיות, העבירה הסופר-טבעית צריכה להיות יותר חלבון גלולה מאשר supernatant. לעומת זאת, רוב החלבון מהעכבר ומונומרים אנושיים קיים על-טבעי עם מעט נוכחים גלולה.הן עכבר והן PFFs אנושיים הם sonicated כדי לייצר PFFs באורכים מתאימים עבור זריעת תכלילים אלפא סינוקליין. בדיקה מקיפה של כ 500 fibrils מגלה כי האורך הממוצע של fibrils העכבר הוא כ 44 ננומטר. עם 86.6% של PFFs מדידת 60 ננומטר או פחות.PFFs אנושי, לעומת זאת, יש אורך ממוצע של כ 55.9 ננומטר עם 69.6% של PFFs מדידת 60 ננומטר או פחות. בבדיקת vivo של יעילות PFF מאושר באמצעות אימונוהיסטוכימיה. תכלילים שנוצרו בסובסטנציה ניגרה, חולקים תכונות דומות לגופי לוי כתוצאה מכך שהם מכילים זרחן אלפא סינוקליין, מכילים מבנים aminloyed, וכתם עם thioflavin S, והם עמידים לעיכול Proteinase K.Sonication יכול לחשוף את sonicating הפרט פיברילים מעוצבים מראש תרסיס. ככזה, יש ללבוש את הלבוש הבטיחותי הנכון ואת sonication שבוצעו ברדס כדי למזער את הסיכון לחשיפה.

generation-alpha-synuclein-preformed-fibrils-from-monomers-use

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים הזרקה של סיבי אלפא-סינוקלאין לעכבר כדי לגרום לדלקת עצבית. הסיבים מוזרקים תוך צפקית לעכבר מהונדס המבטא חלבוני אלפא-סינוקלאין שעברו מוטציה. עם הגעתם למערכת העצבים המרכזית, הסיבים נכנסים לנוירונים וגורמים לצבירה של החלבונים שעברו מוטציה. הצברים התפשטו לתאי עצב שכנים, מיקרוגליה ואסטרוציטים. זיהוי הצברים מעורר תאי מיקרוגליה לגרום לדלקת עצבית, ולפגוע בנוירונים.

השראת דלקת עצבית בעכברים באמצעות הזרקת סיבי אלפא-סינוקלאין

סרטון זה מדגים את תהליך כימות הצטברות אלפא-סינוקלאין בנוירונים עובריים של עכברי דופמין שטופלו מראש בסיבי אלפא-סינוקלאין שנוצרו מראש. הוא מתאר את השלבים לתיקון, צביעה וכימות של נוירוני הדופמין המכילים אגרגטים אלפא-סינוקלאין באמצעות immunofluorescence.

חקר הצטברות אלפא-סינוקלאין בתאי עצב דופמין עובריים ראשוניים

חלבונים יכולים לאמץ מבנה מקורי או להתקפל בצורה לא נכונה לעמילואיד בלתי מסיס. תנאים המעדיפים את מסלול הקיפול הלא נכון מובילים להיווצרות סוגים שונים של סיבי עמילואיד. השיטות המתוארות כאן מאפשרות המרה מהירה של חלבונים מקומיים לעמילואיד במבחנה.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

מתואר ELISA המציע גישה כמותית חדשנית. הוא מגלה באופן ספציפי α-סינקליין הקשור למחלה (αSD) במודל עכבר מהונדס (M83) של סינקלינופתיה באמצעות מספר נוגדנים נגד צורת ה-αS המפוספסת ב-Ser129 או החלק ה-C-סופי של החלבון.

איתור של α-סינוקלאין קשורים למחלות על ידי ELISA משופר במוח של עכברים הטרנסגניים ביתר A53T אדם מוטצית α-סינוקלאין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של אלפא-סינוקלאין (α-syn) שהופך ליותר ויותר בלתי מסיס/מצטבר מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. באמצעות ניצול חוצצים עם חוזק חומר ניקוי הולך וגובר וטכניקות אולטרה-צנטריפוגה במהירות גבוהה, ניתן לבחון את המאפיינים המשתנים של צבירת α-syn ברקמות חולה ולא חולות.

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

הזרקה היקפית של סיבים-synuclein אלפא לתוך הצפק או הלשון של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים, המבטאים אלפא-synuclein אדם עם מוטצית A53T משפחתית בלוציפראז גחלילית, יכול לגרום בנוירופתולוגיה, כולל neuroinflammation , במערכת העצבים המרכזית שלהם.

הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-Synuclein סיבים

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מערכת מבוססת תא משכפל היווצרות של אלפא-synuclein אגרגטים ויוו. תכלילים תאיים אלפא-synuclein הם זרועה בנוירונים הראשי על-ידי הפנמת האמונה, הפצת אקסוגני מנוהל אגרגטים מקורי microsomes-הקשורים אלפא-synuclein מבודד מן העכברים הטרנסגניים חולה אלפא-synuclein.

הממשל אקסוגני של אלפא-synuclein Microsomes-הקשורים אגרגטים כדי נוירונים העיקרי כמודל תא עוצמה היווצרות הסיבים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ללמוד על הצטברות עצבי-מערכת בהצטברות נוירונים לעכבר הראשי דופמין. מערכת זרחזת-מצרפים לאגרגטים בנוירונים מושרה במבנה טרום-ביצוע. הדמיה אוטומטית של תאים אימונוofluor, וניתוח תמונה משוחדת להפוך את הפרוטוקול הזה חזק מתאים הקרנת תפוקה בינונית עד גבוהה של תרופות המעזות α-הצטברות.

לימוד טרום בנוי Fibril ריל המושרה α-Synuclein הצטברות בעכבר עובריים העיקרי מיילדופאמין דופמין המוח

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למתן תוך-אפי של צברי α-סינוקלאין. שיטה זו מספקת תובנות לגבי התפשטות α-סינוקלאין מרירית חוש הריח לפקעת הריח במחלת פרקינסון.

טכניקה למתן תוך אפי של אגרגטים α-סינוקלאין

למד לייצר סיבי α-synuclein ממונמרים ולהשתמש בהם במודלים חיים לחקר מחלת פרקינסון וסינוקלאומינופתיות. הפרוטוקול כולל בקרת איכות והזרקה נוירוכירורגית מדויקת.

דור של אלפא-סינונוקלאומין מראש בנוי ממונמרים והשימוש ב Vivo

גלה סרטונים נוספים