דור של אלפא-סינונוקלאומין מראש בנוי ממונמרים והשימוש ב Vivo

מודל פיבריל פרפורמציה אלפא-Synuclein נמצא בשימוש על ידי מעבדות ברחבי העולם כדי ללמוד סינוקלינופתיות. למרות המודל שימש בהצלחה על ידי מעבדות רבות, קבוצות מסוימות חוו חוסר עקביות יצירת fibrils והפקת פתולוגיה אלפא-סינוקלין עקבי. אנו מקווים כי פרוטוקול זה, אשר מפרט את הדור של fibrils מן מונומרים אלפא-סינוקליין ושימוש fibrils מעוצב מראש ב vivo, יכול לענות על שאלות שיש לחוקרים על השימוש במודל.

מודל פיבריל בעל מבנה מקדים אלפא-סינוקליין מסכם תכונות מפתח של מחלת פרקינסון, כגון פתולוגיה אלפא-סינוקליין ונוירוזנרציה. וזה הוכח להוביל לליקויים מוטוריים צנועים בכמה דגמים של בעלי חיים. היווצרות של תכלילים המכילים זרחן אלפא-synuclein ומסלול זמן ממושך לקראת ניוון עצבי מציע לחוקרים שלבים שונים לאורך כל התקדמות הסינוצלינופתיה, כדי ללמוד ולמקד התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

מדגים את הכנת מחטי זכוכית מותאמות אישית, הוא טכנאי המעבדה שלנו, כריסטופר קמפ. כדי להתחיל בהליך זה, להפשיר מונומרים אלפא-סינוקליין על קרח. התפיחה מחדש את המונומרים המופשרים על ידי החלקה עדין על הצינור.

וצנטריפוגה ב 15, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, להעביר את supernatant לצינור נקי 1.5 מ"ל מיקרו צנטריפוגה ולתרשם את הסכום שהועבר. לדלל את מונומרים עם 1x dPBS לריכוז סופי של 5 מ"ג לכל מ"ל.

בקצרה מערבולת לערבב, בקצרה צנטריפוגה כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינור. לאחר מכן, השתמש בסרט דבק כדי לאבטח את מכסה צינור המיקרו צנטריפוגה סגור. מניחים את הצינור לתוך מערבל תרמו מסלולית עם מכסה במשך שבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול ב 1, 000 סל"ד.

בתום שבעה ימים, תכולת הצינור אמורה להיראות קשה. ראשית, לא כל ציוד מגן אישי הכרחי כולל כפפות, חלוק מעבדה, ומגן פנים. לאחר מכן, במכסה המנוע של תאים, חבר בדיקה בקוטר 3.2 מ"מ לממיר.

הגדר את משרעת sonicators ל 30% ואת הדופק לשנייה אחת על ושנייה אחת את הזמן לדקה אחת. להפשיר את fibrils בטמפרטורת החדר, ובעוד עדיין במכסה המנוע התרבותי, לדלל את fibrils עם dPBS סטרילי. לאחר מכן, לעמעם רקמת מעבדה עם 70% אתנול ולהשתמש בזה כדי לנגב את הבדיקה של sonicator כדי לנקות אותו.

תטביע את קצה הגשוש במים כפולים ופעימות 10 פעמים כדי לנקות את הגשוש עוד יותר. לאחר מכן, לנגב את החללית יבש עם רקמת מעבדה. מניחים את קצה החללית ניקה לתוך הצינור של fibrils מדולל ולמקם את הקצה בתחתית הצינור.

Sonicate את fibrils מדולל באמצעות הפרמטרים שנקבעו בעבר תוך הזזת החללית למעלה ולמטה במהלך כל פעימה כדי להבטיח כי כל fibrils בנוזל הם sonicated. לאחר sonication, לזמן קצר צנטריפוגה לשנייה אחת ב 2, 000 גרם כדי לאסוף את כל הנוזלים מצדי הצינור. להטביע את קצה החללית ב 1%SDS ודופק 10 פעמים כדי לנקות את החללית.

לאחר מכן, להסיר את הקצה מן SDS, ולהטביע אותו במים מזוקקים כפולים, ואת הדופק 10 פעמים. לנגב את החללית עם רקמת מעבדה מעומעמת עם 70% אתנול ולנגב אותו יבש עם רקמת מעבדה יבשה. נתק את הגשוש מהממיר ואחסן אותו.

לאחר מכן, לנגב את כל המשטחים במכסה המנוע עם 1%SDS ואחריו 70% אתנול. כדי להתחיל, מניחים צינור נימי זכוכית סיליקון לתוך מושך מחט זכוכית. הפעל את גוף החימום, ולאפשר משקולות מחובר למתוח את צינור נימי זכוכית מחומם.

לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את צינור נימי זכוכית משך בנקודה הדקה ביותר באמצע ולהסיר את מחט הזכוכית מן מושך מחט זכוכית. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך אורך של צינורות לעטוף כיווץ כ 40 מ"מ. החלק את העטיפה להתכווץ מעל מחט המתכת של מזרק משופע 10 מיקרוליטר.

השתמש להבה פתוחה כדי לחמם לדבוק לעטוף את הפסיכולוג על המחט, תוך הקפדה לסובב את המחט כדי להחיל חום באופן שווה. החלק את הקצה הגדול יותר של מחט הזכוכית שנמשכה בזהירות מעל מחט המתכת של המזרק. לאחר מכן, לחתוך אורך של צינורות לעטוף להתכווץ כ 40 מ"מ בזהירות להחליק אותו על מחט הזכוכית כדי לחפוף את הבסיס של מחט הזכוכית ואת מחט המתכת של המזרק.

השתמש בלהבה פתוחה כדי לחמם את לעטוף להתכווץ כדי לאבטח את מחט הזכוכית למחט המתכת. כדי לאבטח עוד יותר את המחט ולמנוע דליפות פוטנציאליות, לחתוך אורך נוסף של צינורות לעטוף כיווץ כ 40 מ"מ, בזהירות להחליק אותו על מחט הזכוכית כדי לחפוף את הבסיס של מחט הזכוכית ואת מחט המתכת של המזרק. השתמש בלהבה פתוחה כדי לחמם את לעטוף להתכווץ כדי לאבטח את מחט הזכוכית למחט המתכת.

לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לקצץ את מחט הזכוכית, כך הקצה הוא כ 8 מ"מ אורך. כדי לבדוק את המחט, למלא מזרק 1 מ"ל עם מחט 26 מד מחובר עם מים מזוקקים. הסר את בוכנה מתכת ממזרק מחט זכוכית מותאם אישית ולהכניס את המחט של מזרק מלא מים לתוך הבסיס של המזרק המותאם אישית.

בדוק את הממשק של מחט הזכוכית ומחט המתכת לדליפות ולאשר זרימה קבועה של מים. לאחר מכן, מלאו צינור מיקרו צנטריפוגה במים מזוקקים. השתמש במזרק מחט זכוכית מותאם אישית כדי לצייר במים מזוקקים.

בדוק את המחט כדי לאשר נוזל נלקח לתוך המזרק, כי אין בועות. אם יש בועות, או אם המים לא נמשכים לתוך המחט, גיזום המחט יכול לעזור להקל על הלחץ. לאחר מכן, אחסן בזהירות את המזרק עם מחטי הזכוכית המחוברות, בקופסאות המזרק עד לצורך ניתוחים.

בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור מאשר את נוכחותם של fibrils ארוך. לשם השוואה, מונומרים אלפא-סינוקלין הם שעורה גלויים ואין להם צורה ניכרת. אישור אנאליואיד של fibrils הוא אישר לאחר מכן באמצעות Thioflavin T Assay.

מבחן מייצג מראה את dPBS מונומרים העכבר לייצר אות נמוך יותר ביחידות קמח יחסית לעומת העכבר PFFs. מונומר אלפא-סינוקליין אנושי מייצר אות דומה מונומר העכבר. בעוד PFFs האנושי כמו כן לייצר אות גבוה יותר מונומרים.

כדי לתחת את נוכחותם של יתולים pelitible, בדיקת מעים מבוצעת. הן בדגימות העכבר והן בדגימות PFF האנושיות, העבירה הסופר-טבעית צריכה להיות יותר חלבון גלולה מאשר supernatant. לעומת זאת, רוב החלבון מהעכבר ומונומרים אנושיים קיים על-טבעי עם מעט נוכחים גלולה.

הן עכבר והן PFFs אנושיים הם sonicated כדי לייצר PFFs באורכים מתאימים עבור זריעת תכלילים אלפא סינוקליין. בדיקה מקיפה של כ 500 fibrils מגלה כי האורך הממוצע של fibrils העכבר הוא כ 44 ננומטר. עם 86.6% של PFFs מדידת 60 ננומטר או פחות.

PFFs אנושי, לעומת זאת, יש אורך ממוצע של כ 55.9 ננומטר עם 69.6% של PFFs מדידת 60 ננומטר או פחות. בבדיקת vivo של יעילות PFF מאושר באמצעות אימונוהיסטוכימיה. תכלילים שנוצרו בסובסטנציה ניגרה, חולקים תכונות דומות לגופי לוי כתוצאה מכך שהם מכילים זרחן אלפא סינוקליין, מכילים מבנים aminloyed, וכתם עם thioflavin S, והם עמידים לעיכול Proteinase K.

Sonication יכול לחשוף את sonicating הפרט פיברילים מעוצבים מראש תרסיס. ככזה, יש ללבוש את הלבוש הבטיחותי הנכון ואת sonication שבוצעו ברדס כדי למזער את הסיכון לחשיפה.