מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

מסכי נשירה עם מסך CRISPR מספקים לחוקרים שיטה פשוטה, יעילה וזולה לחקור את תפקוד השרשרת ברמה הגנום כולה. היתרון של CRISPR הוא האחריות שלו לערוך כל גן פשוט על ידי שינוי רצף המדריך. ספריות מדריכי CRISPR מאפשרות לחוקרים לחקור את כל הגנום של כל אורגניזם בניסוי אחד בצורה שיטתית ובלתי משוחדת.

כיום, מסכי CRISPR משמשים לזיהוי גנים חיוניים על פני מאות סוגי סרטן אנושיים ולמפות אינטראקציות גנטיות. מסכים יכולים גם פרופיל מקיף תרופות כדי לחשוף מנגנוני סמים של פעולה. ספריות CRISPR המתוארות כאן מתמקדות בתאים אנושיים.

עם זאת, ספריות מדריך המכוונות למינים אחרים, כגון עכבר, זמינות ו ניתן לסנן אותן באופן דומה. ביצוע מסכים ברחבי הגנום בתאים אנושיים יכול להיות מרתיע בפועל, כפי שהוא כרוך בטיפול של עשרות מיליונים בתאים ודורש ניתוח של קבוצות גדולות של נתונים. לפני הפעלת מסך, ודא שקווי התא מאופיינים בקפידה.

זה כולל לדעת את הטוהר של קו התא שלך, הכפלת זמן, יעילות ההשתנה lentivirus, ורגישות לסוכני בחירת אנטיביוטיקה. הדגמה ויזואלית תספק תמונה של איך לטפל כמעט במיליוני התאים הנדרשים במסך ולעקוב אחר אלפי הפרעות באופן שיטתי. הדגימו את ההליך יהיו אנדראה חבסיד, כמאלדיפ אולך וראיין קלימי, כולם טכנאים מהמעבדה שלי.

התחל בהפיכת SgRNA CRISPR מוכן לתאים אלקטרו-כשירים וגידולם בהתאם לכיווני כתב היד. כאשר מוכן לקצור את המושבות, להוסיף שבעה מיליליטר של LB עם קרבניצילין לכל צלחת ולגרד את המושבות עם מפזר התא. השתמש פיפלט 10 מיליליטר כדי להעביר את התאים שרוט לתוך בקבוק חרוט סטרילי של ליטר אחד, ולשטוף את הצלחת עם חמישה מיליליטר של LB עם קרבניצילין.

שוב, להעביר את פתרון שטיפה לבקבוקון. צנטריפוגה התאים על פי הוראות כתב יד, ולאחר מכן, לקבוע את המשקל של גלולה רטובה. לטהר את ה-DNA פלסמיד באמצעות Maxi או מגה בקנה מידה פלסמיד טיהור ערכה.

הכינו תאים לתרגום על ידי זריעת 293 תאי T ודגירה שלהם בן לילה. למחרת, להכין את תערובת פלסמיד transfection שלוש עבור צלחות 15 ס"מ. לחשב את כמות פלסמיד הדרושה עבור transfection אחד ולעשות תערובת של פלסמידים עבור מספר צלחות, ועוד אחד, להיות מומרים.

לאחר מכן, הכינו ריג'נט transfection מבוסס שומנים עבור כל טרנספקט ומדיית סרום מופחתת aliquot לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר עבור מספר הלוחות להיות מנוכה. מוסיפים את רגנט ההטרדה, מערבבים בעדינות ומטוגים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים דנ"א לריג'נט ההטרמפציה ביחס של שלושה לאחד של רגנט טרנס-דביק למיקרוגרם של קומפלקס דנ"א.

מערבבים את הפתרון בעדינות ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. מוסיפים את תערובת ההטרנספיה לתאי האריזה ומדרגים אותם לפי הוראות כתב היד. ביום של קציר ויראלי, לבדוק את התאים עבור מורפולוגיה חריגה התמזגו כאינדיקציה של ייצור וירוס טוב, לקצור את lentivirus על ידי איסוף supernatant והעברתו צינור צנטריפוגה סטרילי.

התחל בבחירת כיסוי ספריית RNA של מדריך CRISPR שיש לשמור לאורך המסך. בהתבסס על כיסוי הספריה, לקבוע את מספר התאים הדרושים כדי לשמור אותו לכל מדריך RNA ואת מספר התאים הדרושים לזיהום ב MOI 0.3. לאחר מכן, לקבוע את מספר הלוחות הנדרשים כדי להגדיר את הזיהום ולאחר מכן, לקצור ולזרע את התאים לכל צלחת.

מוסיפים את הקסדימרין ברומיד לכל הצלחות ומוסיפים את נפח הנגיף הנדרש להקרנה ושליטה על שתי צלחות. אל תוסיף וירוס כדי לשלוט בווירוס. החלף אמצעי אחסון זה במדיה.

מערבבים את הצלחות ביסודיות על ידי הטיה ומ מניחים את הצלחות באינקובטור, מוודאים שהן ברמה. לקצור תאים נגועים על פי הוראות כתב היד ולאסוף שלושה שכפולים של כדורי תאים מהתאים המפולגים להפקת DNA גנומי. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות ולשטוף אותם עם PBS.

סמן את הצינורות ולהקפיא לייבש את כדורי התא במינוס 80 מעלות צלזיוס. פצל את מאגר התאים הנגועים לשלוש קבוצות שכפול, הקפד לשמור על כיסוי ספריה בתוך כל שכפול. זרע את התאים בצפיפות שבדרך כלל ישמשו בעת הרחבתם.

השתמש באותו מספר תאים עבור כל שכפול ואותו מספר תאים כולל בין שכפולים. המשך לעבור את התאים לקצור שלושה שכפולים של כדורי תאים מכל שכפול של תאים נגועים מאגר עד 15 עד 20 הכפלות תאים. בכל מעבר, לקצור את התאים מכל הלוחות בכל לשכפל אחד עם השני.

סמן כל גלולה עם הזמן ושכפל את הכינוי. הגדר PCR1 על פי הוראות כתב היד עם סך של 100 מיקרוגרם של DNA גנומי ב 3.5 מיקרוגרם של DNA גנומי לכל תגובה 50 מיקרוליטר ולהגדיר תגובות זהות 50 מיקרוליטר כדי להשיג כיסוי הרצוי. הגדר תגובת צינור PCR אחת בהתאם לכיווני כתב היד.

השתמש בחמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR1 המאגר כתבנית ולהשתמש בשילובי פריימר אינדקס ייחודיים עבור כל מדגם בודד כדי לאפשר צירוף של דגימות ספריית רצף. לאחר השלמת PCR, הפעל את מוצר צינור PCR על ג'ל 2%agarose במתח נמוך למשך שעה עד 1/2 שעות. דמיינו את המוצר על טרנסילומינטור עם אור כחול ובלו את רצועת זוג הבסיס 200.

מטהרים את הדנ"א ומודדים את כמותו ואיכותו הן עם ספקטרופוטומטר והן עם פלואורומטר. ספריית RNA מדריך אידיאלי צריך להיות כל RNA מדריך יחיד מיוצג בכמויות דומות. ניתן להשתמש ברצף הדור הבא כדי לאשר שלספריה יש הפצה הדוקה של RNAs מדריך.

ניתן להשתמש בניתוח אחזור מדויק כדי להעריך את ביצועי המסך. מסך בעל ביצועים גבוהים צריך לשחזר מספר רב של גנים חיוניים בגורם בסיס גדול משישה וקצב גילוי כוזב של פחות מ -5%עקומת האחזור המדויק צריכה להיות מרפק חד קו ישר לנקודת המסוף. גורם ביינס מייצג מדד ביטחון כי נוקאאוט הגן גורם פגם כושר.

ציונים גבוהים מצביעים על ביטחון מוגבר, בעוד ציונים נמוכים מצביעים על כך שהנוקאאוט של הגנים מספק יתרונות צמיחה. בריכות נוקאאוט ברחבי הגנום ניתן לתרבת בנוכחות סוכן סמים עודף לחפש גנים התנגדות מדכא. כדי לבצע מסך בחירה חיובי עבור מדכא של בלוק תימידין, ספירות קריאה מנורמלות עבור כל RNAs מדריך ב T0 הם התווה נגד ספירת קריאה מנורמלת ממוצעת עבור דגימות שטופלו תימידין.

פרט מפתח לביצוע מוצלח של מסכי CRISPR הוא שמירה על הפצה טובה של כל RNA מדריך, החל מ transfection של פלסמיד כדי ההעתקה של תאים. פעולה זו תמזער את הסיכוי לאפקטים אקראיים שיכולים להטות את ייצוג ה- RNA ולהוביל לתוצאות חיוביות או שליליות כוזבות. לאחר אימות מסך, יש לבצע ניסויים כדי לאשר כניסות מכיוון שהמסך הראשי מזהה רק כניסות פוטנציאליות.

בהתאם לביולוגיה של הלהיטים, ניתן להשתמש בשיטות שונות. עריכת CRISPR, בשילוב עם רצף הדור הבא, אפשרה אובדן בקנה מידה של גנום של מסכי פונקציה במערכות מודל אנושי מגוונות. בשל הפשטות של CRISPR, סוגים אלה של מסכים נגישים כעת באופן נרחב לכל החוקרים, ומאפשרים ליותר מדענים להשתמש בשיטות גנטיות תפקודיות כדי לחקור תהליכים ביולוגיים ומחלות.