Name: טיהור של טסיות מתוך דם העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: למד טיהור טסיות מדם עכבר באמצעות צנטריפוגה בגרדיאנט iohexol. שיטה זו מאפשרת ניתוח זרימה ומיקרוסקופיה לחקר תפקוד טסיות וחיוניותן במחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היתה נתמכת על ידי סטארט-up מימון של הקרן המחקר של סינסינטי לילדים ואוניברסיטת סינסינטי מענק הפיילוט Translational M.N. אנחנו רוצים להודות הילדים סינסינטי בבית החולים מחקר זרימה Cy, ליבה על השירותים שלהם.

אוסף דם העכבר צריך להתבצע עם טיפול בעלי חיים מוסדיים המתאים ולהשתמש אישור הוועדה.
הערה: פרוטוקול טיהור טסיות מתואר בדיאגרמת זרימה באיור 1.
1. אוסף דם
<ol><li>הוסף 25 μL של 3.2% נתרן ציטראט (pH 7.2) כאנטי מקריש ו 0.4 mM של הפרו-Pro-Arg-Pro (GPRP) בצינור פוליפרופילן.</li>
	<li>
לאסוף כ 200 μL של דם מ C57BL/6 העכבר באמצעות מסלולית רטרו. הערה: ניתן לאסוף דם מכל סוג של מאמץ העכבר ללא קשר לגיל או מין.<ol>
<li>השתמש 2 מ ל של isofלוריאן בכל סוג של תא לההרדמה העכבר. הערה: עומק ההרדמה נבדק על ידי סימנים של נשימה מוגברת וירידה בתנועה. העכבר לא צריך להגיב על התנועה של תא ההרדמה, או להיות מטופל. אם העכבר מגיב תנועה או טיפול, אז זה דורש יותר זמן לשמור בחדר ההרדמה.</li>
		<li>1.2.2 פתח את העפעף הימני או השמאלי של העכבר והכנס שפופרת קפילר 7.5 ס מ (בקוטר 0.12 ס מ) לתוך מקלעת כלי הדם של העין.</li>
		<li>סובבו את צינור הקפילר אחד לחצי להפוך תוך הפעלת לחץ על צינור נימי לשבור את כלי הדם וליזום זרימת דם. להחזיק את החיה הפוכה מעל בקבוקון האוסף להיות מלא על ידי פעולה קפילר.</li>
		<li>לאחר הנפח המתאים של דם נאסף, להסיר את צינור נימי ולסגור את העין על ידי החלת לחץ קל עבור 30 s על העפעף עם גזה. לאחר הפסקת דימום, להחזיר את העכבר לכלוב שלו לפקח על דימום.</li>
		<li>בדוק את העיניים של טראומה 1-2 ימים לאחר דימום מסלולית רטרו. להסיר את כל העכבר מן המחקר מראה סימנים של טראומה משמעותית לעין כתוצאה של ההליך המתת חסד. הערה: העכבר לא צריך לעבור כל סוג של טיפול אשר יכול לעכב טסיות לפחות שבועיים לפני איסוף הדם. דגימת הדם חייבת לשמש לטיהור טסיות בתוך שעה אחת של דימום העכבר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. טיהור דם
הערה: טיהור טסיות צריך להתבצע בטמפרטורת החדר כדי למנוע השפלה שלהם. ודא כי הטמפרטורה של הריאגנטים והמכשירים הם בין 18 ל -22 ° c. כדי למנוע השפלה טסיות, ליטוף מהיר וטלטול נמרץ יש להימנע במהלך ההליך.
<ol><li>הוסף 600 μL של בינוני מעבר הצבע iohexol (12% iohexol אבקה ב 0.85% נתרן כלוריד, 5 מ"מ Tricine, pH 7.2)11 לתוך שפופרת 1.5 mL.</li>
	<li>הוסף 200 μL של דגימת דם לאט במורד הצד של הצינור על גבי המדיום מעבר הצבע עם טיפ מנשא משעמם רחב כך דם ו iohexol בינוני לא לערבב (איור 2A).</li>
	<li>צנטריפוגה את המדגם המכיל צינור ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° צ' ברוטור דלי מנופף עם האצה איטית והאטה.</li>
	<li>לאסוף את רוב שכבת טסיות עשיר וחלק קטן של שכבת טסיות-העניים (סך 300 עד 400 μL) באמצעות טיפ מנשא משעמם רחב מבלי להטריד את שכבות RBC ו-WBC (איור 2B). העבר את דגימת הטסיות. לשפופרת חדשה הערה: אם ספירת טסיות היא פחות בדם או נפח קטן יותר של דם משמש, שכבה עשירה טסיות ושכבה הדלה טסיות ניתן לראות כשכבה אחת.</li>
	<li>הוסף 1 mL של PBS לדגימת טסיות, לערבב על ידי היפוך, ו צנטריפוגה ב 800 x g עבור 10 דקות ב 20 ° c ברוטור דלי מנופף. למחוק את הפתרון לחלוטין ולהוסיף 200 μL של PBS להשעות את טסיות עם ליטוף קל. הערה: שלב זה הוא אופציונלי, כפי שהוא מסיר את מעבר הצבע ואת החלבונים פלזמה ומגביר את הרגישות של טסיות לאגוניסטים כגון תרומבין. מאחר שבצנטריפוגות שונות יש תוכניות שונות, ניתן לקבוע את ההאצה האיטית/האטה על-ידי קריאת המדריך למשתמש של הצנטריפוגה.</li>
	<li>העברה 30 μL של מדגם זה לתוך צינור חדש כדי לספור טסיות. טסיות שנותרו ניתן להשתמש עבור ביוכימיים ופיסיולוגיים כגון הפעלה טסיות, צבירה, שחרור גרגר עושה וכו '.</li>
	<li>עבור החילוץ RNA או חלבון, צנטריפוגה את דגימת טסיות ב 800 x g עבור 10 דקות כדי הגלולה טסיות. להיפטר באופן מוחלט מבלי להפריע לגלולה. הוסף את הנפח הרצוי של מאגר ה-RNA או לפירוק החלבון כדי ליאוס את טסיות.</li>
</ol>3. ספירת טסיות
<ol><li>לספור את כל התאים דם ללא דילול טסיות מטוהרים (מדולל 2 כדי 5-קיפול עם PBS) באמצעות מנתח התא אוטומטי. השתמש בדוגמיות של 30 עד 50 μL לספירה.</li>
	<li>לחשב את המספר הכולל של טסיות באמצעות הכפלת על ידי הדגימה של המדגם.</li>
	<li>חשב את אחוז התשואה/שחזור של טסיות מטוהרים.</li>
	<li>הרוזן RBC ו WBC במדגם טסיות מטוהר (מדולל 50 כדי 100-קיפול עם PBS) עם הומוציטוטומטר ומיקרוסקופ.</li>
</ol>4. הפעלת טסיות דם
<ol><li>בצינור, להוסיף 1 כדי 2,000,000 טסיות מטוהרים בתוך עד 100 μL של מאגר כתמים (PBS עם 2% סרום שור עוברי, FBS).</li>
	<li>עבור מספר מרובים של דגימות, לעשות שילוב מאסטר של נוגדנים עם 1 μL (0.5 mg/mL) של הבאים: PE-Cy7 עכברוש נגד עכבר TER 119, PE עכברוש נגד עכבר CD45, עכבר FITC עכברוש נגד העכבר CD41, ועכבר APC anti-mouse/אדם CD62P (P-selectin) כדי לזהות RBC, WBC, טסיות, טסיות דם מופעלות, בהתאמה. הוסף את התמהיל הראשי לצינורות לצביעת התאים. אין להוסיף את התרומבין.</li>
	<li>בצינור אחר, להוסיף 1 עד 2,000,000 של טסיות מטוהרים בתוך עד 100 μL של מאגר הצביעת, ו 0.4 mM GPRP פפטיד. הוסף את התרומבין כדי להפעיל את טסיות ולהכתים את התאים הבאים צעד 4.2. הערה: יש להוסיף את GPRP למדגם לפני הוספת התרומבין כדי למנוע צבירה או מבנה קריש באמצעות הפעלת טסיות דם. ריכוז התרומבין צריך להיות מותאם כדי לקבל הפעלה טובה של טסיות. לאחר הפעלת טסיות דם, ספירות האירועים ירדו במהלך הרכישה של דגימות על ידי הזרמת cy, try.</li>
	<li>כפקד חיובי, להוסיף 1 μL של דם שלם עד 100 μL כתמים מאגר בצינור ו 0.4 mM GPRP פפטיד. הוסף את התרומבין להפעלת טסיות. כפקד שלילי, להוסיף 1 μL של דם שלם עד 100 μL של מאגר הצביעת. אין להוסיף את התרומבין בדגימת שליטה שלילית. הכתם את התאים לאחר שלב 4.2.</li>
	<li>עבור הזרמת cy, הפקד isotype, תווית 5 צינורות עם בלתי מוכתם, PE-Cy7, PE, FITC, ו APC. הוסף 100 μL של מאגר כתמים, 1 μL של דם, ו-1 μL של הנוגדן המתאים לצינורות המסומנים כדי להכתים את התאים.</li>
	<li>מודטה דגימות לכתם עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>שטוף את הדגימות על ידי הוספת 1 mL של מאגר הצביעת לכל צינור. צנטריפוגה ב 800 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את מאגר הצביעת בזהירות מבלי לבטל את לינה את הגלולה.</li>
	<li>הוסף 300 μL של צביעת מאגר לכל צינורית, ערבב במתינות והעברה לשפופרת של FACS. אחסן את הדגימות המוכתמות בחשכה עד שנותחו באמצעות ציטוטומטר זורם.</li>
</ol>5. הזרמת Cy, ניתוח של טסיות דם
<ol><li>
צור ניסוי חדש וליצור מגרשים לפנים פיזור לעומת היומן מתווה פיזור נקודה ולהקצות שערים עבור Ter119 PE-Cy7 (rbc), CD45 PE (wbc), CD41 fitc (טסיות), ו-CD62P APC (טסיות מופעל) אוכלוסיות על פי אסטרטגיית הפגישה שנבחרה ל התנסות בתוכנה הדיווה של FACS.
	<ol>
<li>פתח את הירארכיית האוכלוסיה על-ידי בחירה באפשרות הצג הירארכיית אוכלוסיה תחת הכרטיסיה אוכלוסיות . ערוך את הירארכיית האוכלוסיה על-ידי בדיקת אסטרטגיית הפעולה ושינוי הצורה כראוי לשערים.</li>
		<li>פתח את תצוגת הסטטיסטיקה על-ידי בחירה באפשרות ' צור תצוגת סטטיסטיקה '. עריכת תצוגת סטטיסטיקה בהתאם להעדפות המשתמש על-ידי לחיצה ימנית על תצוגת הסטטיסטיקה ובחירה באפשרות ' עריכת תצוגת סטטיסטיקה '.</li>
		<li>בחר צבע עבור כל שער המשפר את ההיבט החזותי של הפריסה על-ידי לחיצה כפולה על התיבה התואמת לאוכלוסיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחלון Cytometer לחץ על הכרטיסייה פרמטרים ולהתאים את המתח עבור פרמטרים כדי להמחיש את אוכלוסיית העניין על המגרשים.</li>
	<li>התאם מתח עבור כל אחד מהפרמטרים כך שניתן יהיה להבדיל בין האוכלוסיה השלילית לבין האוכלוסיה החיובית. לפני הקלטת הדגימות עבור פקד הפיצוי, בדוק שהפקדים החיוביים המוכתמים בודדים נמצאים בקנה מידה (ודא שהפסגות החיוביות גלויות ולא רחוק מימין). הערה: אם הפסגות החיוביות מחוץ לסולם, יש לכוונן את המתח כדי לראות את האוכלוסיות החיוביות.</li>
	<li>הקלט את התאים המוכתמים בצבע יחיד עבור פקדי פיצוי (בלתי מוכתם, PE-Cy7, PE, FITC ו-APC).</li>
	<li>אם שערי השליטה החיוביים אינם מוגדרים כראוי, התאימו אותם על-ידי שינוי מתח.</li>
	<li>עבור להתנסות &Gt; התקנת פיצוי &Gt; חישוב פיצוי. בחר באפשרות ' החל רק ' בחלון המתקבל.</li>
	<li>עבור לגליון העבודה הגלובלי על-ידי לחיצה על לחצן דו-מצבי בחלק העליון, משמאל לחלון גליון העבודה.</li>
	<li>טען את דגימת הבקרה החיובית ורכוש מספיק תאים כדי לכוונן את הפיצוי ואת השערים.</li>
	<li>לטעון את המדגם שוב ולבדוק כי כל העלילה מציגה את אוכלוסיית התא צפוי בהתבסס על הנוגדן fluorochrome מוכתם. לרכוש ולהקליט 100,000 אירועים עבור דגימות דם שלמות ו 10,000 אירועים עבור טסיות מטוהרים. טען את הדגימות בזה אחר זה עד להשלמת הרכישה.</li>
	<li>לנתח את cy, הזרמת נתונים עם התוכנה עם מגרשים ושערים מתאימים (איור 3)</li>
</ol>

<ol><li>de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+platelet-based+control+of+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Insights into platelet-based control of coagulation.</a> Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).</li>
<li>Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+developmental+dance+of+the+megakaryocyte%3A+a+review+of+the+cellular+and+molecular+processes+mediating+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).</li>
<li>Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%3A+signaling+cells+in+the+immune+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Platelets: signaling cells in the immune continuum.</a> Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).</li>
<li>Nami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+platelets+and+PBMC%3A+New+evidence+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing.</a> Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).</li>
<li>Mancuso, M. E., Santagostino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%3A+much+more+than+bricks+in+a+breached+wall%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Platelets: much more than bricks in a breached wall.</a> British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).</li>
<li>Hampton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets%27+Role+in+Adaptive+Immunity+May+Contribute+to+Sepsis+and+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock.</a> Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).</li>
<li>Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+blood+platelets+in+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of blood platelets in tumor angiogenesis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).</li>
<li>Menter, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+%26%2334%3Bfirst+responders%26%2334%3B+in+wound+response%2C+cancer%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Platelet &#34;first responders&#34; in wound response, cancer, and metastasis.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).</li>
<li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+platelet-specific+mRNA+by+real-time+PCR+after+laser-assisted+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).</li>
<li>Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-pure+platelet+isolation+from+canine+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood.</a> BioMed Central Veterinary Research. 9, 144(2013).</li>
<li>Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new%2C+rapid%2C+one-step+method+for+the+isolation+of+platelets+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood.</a> Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).</li>
<li>Noisakran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bone+marrow+cells+by+dengue+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematolology%22%5BJournal%5D)">Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo.</a> Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).</li>
<li>Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nycodenz%3A+a+new+nonionic+iodinated+gradient+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium.</a> Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).</li>
<li>Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+major+subcellular+organelles+from+mouse+liver+using+Nycodenz+gradients+without+the+use+of+an+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge.</a> Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).</li>
<li>Milligan, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lethal+model+of+disseminated+dengue+virus+type+1+infection+in+AG129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice.</a> Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+rescue+of+a+Bernard-Soulier+mouse+model+to+study+platelet+glycoprotein+Ibbeta+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).</li>
<li>Bergmeier, W., Boulaftali, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+method+to+study+platelet+function+in+mouse+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease.</a> Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).</li>
<li>Bakchoul, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+use+of+the+non-obese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficiency+mouse+model+in+autoimmune+and+drug-induced+thrombocytopenia%3A+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).</li>
<li>Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection%2C+platelet+isolation+and+measurement+of+platelet+count+and+size+in+mice-a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide.</a> Platelets. , 1-10 (2018).</li>
<li>Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+murine+platelet+structure%2C+function%2C+assays%2C+and+genetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).</li>
<li>Birschmann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+functional+highly+purified+human+platelets+for+the+identification+of+new+proteins+of+the+IPP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway.</a> Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

בדרך כלל, טסיות מבודדות על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה אשר מניב פלזמה עשיר טסיות המכיל מספר משמעותי של כדוריות הדם, הפסולת התאית, וחלבונים פלזמה אשר יכול להפריע הביוכימי והפיסיולוגיים והצרכים הפיזיולוגיים טיהור נוסף21. לכן, חשוב להשתמש בשיטה מהירה ופשוטה אשר יכולה להניב טסיות טהור ללא מזהמים גדולים. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את טיהור של טסיות מ דם העכבר באמצעות בינוני מעבר הצבע עם מהירות נמוכה צנטריפוגה. הפרמטרים המשמשים פרוטוקול זה למקסם את התשואה ולמזער את ההשפלה של טסיות. בינוני וחלבונים פלזמה נ...

טסיות הם רכיב של דם המתפקד כיוזם של קרישת דם בתגובה לנזק בכלי הדם. הם מתאספים באתר של פציעה. כדי לחבר את כלי הקיבול לקיר1 טסיות הם שברי אנוקלאט של ציטופלסמה הנגזר מהקרציטים של מח העצם תחת השפעת התרובטין ולהיכנס למחזור הדם2. הם נחשבים metabolically פעילים ומסוגלים לחוש הסביבה מסחטות על ידי הפעלת מפלי איתות תאיים כי התוצאה היא התפשטות טסיות, מצבור, ו הומוסטטית היווצרות תקע1,3. מלבד הומוסטזיס/פקקת וריפוי הפצע4, טסיות לשחק תפקיד חשוב בתגובות דלקתיות מארח, אנגיוגנזה, ו גרורות3,5,6,7, שמונה.
טסיות מטוהרים מדם ללמוד תכונות ביוכימיים ופיסיולוגיים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מרכיבי דם אחרים. מאז כדוריות הדם האדומות (rbc) וכדוריות הדם הלבנות (wbc) מכילים באופן משמעותי יותר RNA וחלבונים מאשר טסיות9,10, נוכחות של מספר קטן של תאים אלה יכול להפריע לניתוח הטרנססקריפט והפרוטאומית של RNA וחלבונים הנגזרים מטסיות הדם. מצאנו כי טסיות מטוהרים מופעל עם נוגדנים לאגד תרומבין כגון אנטי GPIIb/IIIa (ג'ון/A) ו אנטי-P-selectin ביעילות רבה יותר מאשר טסיות דם שלמות.
מאחר שטסיות הן שבירות, חשוב לטפל בדגימות במתינות ככל האפשר. אם טסיות מופעלות, הם משחררים את תוכן הגרריר שלהם ובסופו של דבר לבזות. לכן, כדי לשמור על המאפיינים הפונקציונליים של טסיות שלמות, חשוב לשמור על השקט טסיות בזמן הבידוד. פרוטוקולים מספר תיארו בידוד של טסיות מן האדם, כלב, עכברוש, והפרימטים לא אנושיים על ידי שיטות שונות1,10,11,12. חלק מהשיטות דורשות שלבים מרובים כגון אוסף של פלזמה עשיר טסיות ידי צנטריפוגה, סינון על ידי הפרדת הטור, מבחר שלילי של טסיות עם הנוגדן הספציפי RBC-ו-WBC-מצוייחים לחרוזים מגנטיים, וכן הלאה, אשר זמן רב ועלול לבזות את הטסיות ואת תוכנם.
פורד ועמיתיו תיאר לטיהור טסיות דם אנושי באמצעות iohexol בינוני11. שיטה זו משתמשת בכמות דומה של דגימת דם ובינונית במהלך הטיהור. מאז בני האדם להניב נפח גבוה יותר של דם, קל יחסית לטהר את טסיות.
Iohexol היא צפיפות אוניברסלית מעבר הדרגתי בינונית, כי הוא מסיסים באופן חופשי במים ומשמש השבר של חומצות גרעין, חלבונים, פוליסכרידים, ו נוקלאופרוטאינים13,14. יש לו אוסמאליות נמוכה והוא לא רעיל, ובכך הופך אותו למדיום אידיאלי לטיהור של תאים חיים שלמים11. זהו מדיום שאינו חלקיקי; לפיכך, ניתן לקבוע את התפלגות התאים במעבר צבע באמצעות הומוציטומטר, הזרמת cytom, או ספקטרוסקופיה. היא אינה מפריעה לרוב התגובה האנזימטית או הכימית של התאים או החלקים הסלולריים לאחר דילול.
העכבר משמש מודל חשוב בעלי חיים עבור מחלות אנושיות רבות15,16,17,18. יש כמה מאמרים שפורסמו שמתארים טיהור של טסיות העכבר19,20. עם זאת, העכבר מניב נפח קטן יחסית של דם, מה שמקשה על טיהור טסיות. אם נעשה שימוש באותו כמות קטנה של בינוני ודגימות דם, שכבת הטסיות לא יכולה להיות מופרדת בבירור משכבת ה-RBC-WBC לאחר צנטריפוגה. במאמר זה, תיארנו שיטה מהירה ופשוטה של טיהור העכבר טסיות עם שלושה קיפול מעבר מדרגה גבוהה יותר בינונית ביחס לנפח דגימת הדם ומהירות נמוכה צנטריפוגה. בנוסף, הפעלנו את טסיות הדם הטהורה עם התרומבין וחקרו את איכותם בעזרת cy, והמיקרוסקופיה.

<table><tbody><tr><td>APC חולדה נגד עכבר/אנושי CD62P (P-selectin)</td> <td>תרמו-מדעי</td><td>17-0626-82</td><td>סמן הפעלת טסיות דם</td></tr><tr><td>צינור אפנדורף</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-222-166</td><td>צינור לצנטיפוגה</td></tr><tr><td>תוכנת FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>פריט שאינו קטלוג</td><td>ניתוח טסיות דם</td></tr><tr><td>וצינור FACS</td> דם מלא צינורות <td>352008 פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>לזרימה ציטומטריה</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>מרכיב למאגר צביעה</td></tr><tr><td>FITC חולדה נגד עכבר CD41</td><td>BD Biosciences</td><td>553848</td><td>סמן טסיות</td></tr><tr><td>דם ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td>פריט שאינו קטלוג</td><td>ניתוח טסיות דם ודם מלא</td></tr><tr><td>תוכנת FlowJo</td><td>, Inc.</td><td>פריט שאינו קטלוג</td><td>ניתוח טסיות דם ודם מלא</td></tr><tr><td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td> <td>EMD Millipore</td><td>03-34-0001</td><td>מניעת היווצרות קרישי טסיות</td></tr> דם <tr><td>צינור נימי המטוקריט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-362566</td><td>צינור נימי לאיסוף דם</td></tr><tr><td>Hemavet</td><td>Drew Scientific</td><td>פריט שאינו קטלוג</td><td>מנתח תאי דם</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser </td><td>תא ספירת תאים</td>מדעי <td>3100</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>בקסטר</td><td>1001936040</td><td>שימוש להרדמת</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ עכבר (אולימפוס CKX41)</td><td>אולימפוס</td><td>פריט שאינו קטלוג</td><td>ניטור וספירת תאים</td></tr><tr><td>Nycodenz (Histodenz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td>שיפוע</td></tr><tr><td>בינוני PE חולדה נגד עכבר CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561087</td><td>סמן WBC</td></tr><tr><td>PE-Cy7 חולדה נגד עכבר TER 119</td><td>BD Biosciences</td><td>557853</td><td>סמן RBC</td></tr><tr><td>טיפים לפיפט 200 ומיקרו; L, ThermoFisher Scientific רחב קדח</td><td></td><td>21-236-1A</td><td>העברת דגימות דם וטסיות דם</td></tr><tr><td>קצות פיפט 1000 ומיקרו; L, ThermoFisher Scientific רחב קדח</td><td></td><td>21-236-2C</td><td>העברת דגימות דם וטסיות</td></tr> דם מי <tr><td>מלח פוספט (PBS)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>מאגר לשטיפה ודילול</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>תמיסת מלח פיזיולוגית</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-688-26</td><td>נוגד קרישה</td></tr><tr><td>מאגר מכתים</td><td>בתוך הבית</td><td>פריט שאינו קטלוג</td><td>מאגר שטיפה ודילול</td></tr><tr><td>מי סטייל</td> בתוך <td>הבית</td><td>פריט שאינו קטלוג</td><td>ממס</td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>דלי מתנדנד צנטריפוגת רוטור</td></tr><tr><td>תרומבין</td><td>מעבדת מחקר אנזימים</td><td>HT 1002a</td><td>אגוניסט להפעלת טסיות דם</td></tr><tr><td>טריקסין</td><td>מאגר Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td>עבור מדיום Nycodenz</td></tr></tbody></table>

טיהור של טסיות מתוך דם העכבר

Purification of Platelets from Mouse Blood

טסיות מטוהרים מדם שלם כדי ללמוד את המאפיינים הפונקציונליים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מתאי דם אדומים (RBC), כדוריות דם לבנות (WBC), וחלבונים פלזמה. אנו מתארים כאן טיהור של טסיות מתוך דם העכבר באמצעות שלושה מקפלים יותר מעבר מדרגה בינונית ביחס לנפח דגימת דם ו צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. ההתאוששות/תשואה של טסיות מטוהר היו 18.2-38.5%, ואת טסיות מטוהר היו במצב מנוחה, אשר לא מכילים כל מספר משמעותי של RBC ו-WBC. טסיות מטוהרים מטופלים עם תרומבין הגיע עד 93% הפעלה, המציין את הכדאיות שלהם. אנו מאשרים כי טסיות מטוהר הם טהורים מספיק באמצעות cytometric זרימה הערכה מיקרוסקופית. טסיות אלה ניתן להשתמש עבור ביטוי גנים, הפעלה, שחרור גרגר עושה מצבור, הדבקה assays. שיטה זו ניתן להשתמש לטיהור של טסיות מדם של מינים אחרים, כמו גם.

סיכום של טיהור טסיות מתואר בדיאגרמת זרימה (איור 1). השלבים כוללים אוסף של דם מהעכבר באמצעות מסלולית רטרו בנוכחות של נוגד קרישה, תוספת של דגימת דם על בינוני הדרגתי iohexol, צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. האיכות של טסיות מטוהר הוערך עם מיקרוסקופ וזרימה cy, לאחר להכתים עם נוגדנים לזהות כל התאים מזהם טסיות מופעל.
המדיום מעבר הדרגתי ודגימת הדם יצרה שתי שכבות נפרדות בצינור, אם הדם התווסף לאט למדיום (איור 2 א</st...

כאן, דמו של העכבר נאסף. בנוכחות אנטי-מקריש טסיות היו מטוהרים על ידי המדיום iohexol באמצעות מהירות נמוכה צנטריפוגה. טסיות הדם הופעלו עם תרומבין. כדי לחקור אם הם היו מעשי האיכות של טסיות מטוהר נותחו על ידי cy, מיקרוסקופ זרימה.

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

טסיות דם צריכות להיות חופשיות מתאים וחלבונים בחקר תכונותיהם הביוכימיות והפיזיולוגיות. לכן, פיתחנו פרוטוקול לטיהור טסיות דם מדם העכבר. טכניקה זו יכולה לטהר טסיות דם באמצעות iohexol הדרגתי בינוני ומהירות נמוכה צנטריפוגה, וכתוצאה מכך הפרדה ברורה של טסיות דם מרכיבי דם אחרים.כדי לטהר את טסיות הדם, השתמש בקצה פיפטה רחב נשא לשכבה 200 microliters של דם שלם שנקטף טרי לאט בצד של צינור 1.5 מיליליטר על 600 microliters של מדיום שיפוע iohexol ללא ערבוב. לאחר צנטריפוגה רוטור מתנדנד דלי כדי לבודד את טסיות הדם, להשתמש טיפ פיפטה רחב נשא חדש כדי לאסוף את רוב השכבה עשיר טסיות דם וחלק קטן של שכבת טסיות דם עניים מבלי לשאוף את תא הדם הלבן או שכבת תא הדם האדום. מוסיפים את דגימת טסיות הדם לצינור חדש, ומוסיפים מיליליטר אחד של PBS לטסיות הדם.מערבבים את טסיות הדם על ידי היפוך לפני ביצוע צנטריפוגה נוספת. ואז תן שימוש חוזר את גלולה ב 200 microliters של PBS עם צינורות קלים. להפעלת טסיות דם, להעביר אחד עד פעמיים 10 לשש טסיות דם לצינור חדש המכיל 100 microliters של חיץ כתמים.הוסף אחד עד פעמיים 10 לשש טסיות הדם לצינור אחר המכיל 100 מיקרוליטרים של חיץ כתמים בתוספת פפטיד GPRP 0.4 מילימולר. מוסיפים את הטרומבין לצינור עם הפפטיד GPRP כדי להפעיל את טסיות הדם, ומוסיפים את קוקטייל הנוגדנים המעניין את שני הצינורות. כשליטה חיובית, להוסיף microliter אחד של דם שלם עד 100 microliters של חיץ כתמים בצינור המכיל פפטיד GPRP 0.4 מילימולר, ולהוסיף טרומבין כדי להפעיל טסיות אלה.כבקרה שלילית, יש להוסיף מיקרוליטר אחד של דם שלם ב-100 מיקרוליטרים של חוצץ כתמים. ואז להכתים את שני צינורות הבקרה עם קוקטייל הנוגדנים. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, לשטוף את הדגימות עם מיליליטר אחד של חיץ כתמים טריים לכל צינור.תן שימוש חוזר לכדורים ב-300 מיקרוליטרים של חיץ כתמים טרי. ואז להעביר את דגימות התא לתוך צינורות ניתוח ציטומטריה זרימה בודדים מוגנים מפני אור. כדי לנתח את טסיות הדם לפי ציטומטריית זרימה, צור ניסוי חדש וצור פיזור קדמי לוגריתמי לעומת חלקות נקודה של פיזור צד לוגריתמי.לאחר התאמת המתחים לפי הצורך, רשום את התאים המוכתמים בצבע יחיד עבור פקדי הפיצוי. עכשיו להפעיל את מדגם השליטה החיובית כדי לרכוש מספיק תאים כדי להתאים את הפיצוי ואת השערים. לאחר מכן לרכוש ולהקליט 100, 000 אירועים עבור כל דגימת דם שלמה, ולנתח את נתוני cytometry זרימה באמצעות חלקות ושערים המתאימים.אם הדם מתווסף למדיום לאט, מדיום שיפוע iohexol ואת דגימת הדם יהיה ליצור שתי שכבות נפרדות בצינור. לאחר הצנטריפוגה, השכבה העליונה בצבע קש מכילה את הפלזמה אך ללא תאי דם שלמים. השכבה השנייה, לבנוויטית ועשירה בטסיות דם, מכילה את רוב טסיות הדם.השכבה השלישית השקופה היא שכבת טסיות הדם הירודה והיא נמצאת ישירות מעל תא הדם האדום וכדור תאי הדם הלבנים. דם שלם מציג אוכלוסיות שונות של תאי דם אדומים, תאי דם לבנים וטסיות דם על פיזור לוגריתמי קדימה לעומת חלקת נקודה של פיזור צד. טסיות דם מטוהרות, לעומת זאת, להפגין אוכלוסייה ברורה עם מספרים זניחים של תאי דם אדומים או לבנים.דגימות דם שלמות מכילות תאי דם אדומים חיוביים Ter119 ואוכלוסיות תאי דם לבנים חיוביים CD45 שכמעט נעדרים בדגימות טסיות מטוהרות. טסיות דם מטוהרות שלא טופלו אינן מבטאות כמעט סמני הפעלה המאשרים את מצב המנוחה שלהם, בעוד טסיות דם מטוהרות שטופלו בטרומבין מדגימות בדרך כלל ביטוי של 71%P-selectin. הערכה מיקרוסקופית של דגימות טסיות דם מטוהרות לא מטופלות אינה מגלה צבירת טסיות דם.לאחר ההפעלה עם טרומבין, עם זאת, טסיות הדם להפגין צבירה חזקה, עוד יותר המאשר את הכדאיות שלהם לאחר טיהור כפי שהוכח. שכבת דגימת הדם בזהירות על מדיום iohexol, וכאשר אוספים את טסיות הדם, הקפד שאפו בזהירות כדי לא לאסוף את תא הדם האדום ואת שכבות תאי הדם הלבנים לטיהור טסיות דם מוצלח. שיטה זו יכולה לשמש לטיהור טסיות דם ממינים אחרים גם כן.טסיות הדם המטוהרות יכולות לשמש להבעת גנים, הפעלה, צבירה, שחרור גרנולים ולימודי הידבקות.

purification-of-platelets-from-mouse-blood

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים טכניקה להבדלה של מגה-קריוציטים והיווצרות טסיות דם. תאי גזע המטופויטיים - שבודדו מדם טבורי אנושי - מתמיינים למגה-קריוציטים בוגרים בנוכחות טרומבופויטין. המגה-קריוציטים הבוגרים מייצרים שלוחות ציטופלזמיות הנקראות טסיות דם, אשר מעוררות טסיות בודדות.

שיטת מבחנה להבדלה של Megakaryocytes והיווצרות טסיות

בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול לטיהור טסיות דם מדם שלם מורין והפעלתן לאחר מכן עם טרומבין אגוניסט טסיות. כאשר מנתחים אותם באמצעות ציטומטריית זרימה, טסיות המנוחה המטוהרות מאופיינות על סמך הביטוי של סמן פני השטח של התא CD41, בעוד שטסיות מופעלות מטוהרות מבטאות יחד את סמני פני השטח CD41 ו- CD62P.

טיהור והפעלה של טסיות דם מדם שלם

בסרטון זה אנו מדגימים את הבידוד של נויטרופילים ציטוטוקסיים בצפיפות גבוהה ונויטרופילים בצפיפות נמוכה מדמו של עכבר נושא גידול על ידי צנטריפוגה הדרגתית לא רציפה של סוכרוז.

בידוד נויטרופילים ציטוטוקסיים מדם עכבר נושא גידול

כדוריות דם לבנות וטסיות דם יכולים לשמש כסמן לבריאות bioenergetic הכללי של אדם ולכן יש לו את הפוטנציאל לפקח על תהליכים פתולוגיים ואת ההשפעה של טיפולים. כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולמדוד את תפקוד המיטוכונדריה ופרץ חמצוני בתאים אלה.

Bioenergetics וחמצוני פרץ: הפרוטוקולים לבידוד ולהערכה של לויקוציטים אדם וטסיות הדם

אוכלוסיה מאוד טהור של megakaryocytes ניתן להשיג כבל דם-derived CD34+ תאים. שיטה CD34+ בידוד תאית התמיינות מגקריוציט מתואר כאן.

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

מוצג כאן פרוטוקול לציריפת פפטיד CD47 (pepCD47) סטנטים מתכת באמצעות כימיה פוליביספוספונט. פונקציונליזציה של סטנטים מתכת באמצעות pepCD47 מונע את ההחזקה וההפעלה של תאים דלקתיים ובכך לשפר את תאימות ביולוגית שלהם.

הקלת הדם נישא תא מצורף שתלים מתכת באמצעות CD47 נגזר פפטיד אימוביליזציה

שיטה זו מתארת את הטיהור על ידי ציטומטריית זרימה של MEP ו- MKP מעצמות הירך של העכברים, השוקה ועצמות האגן.

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את כל השלבים הכרוכים בהשגת CD34+ hematopoietic שמקורם ב- leukofilter ואת בידול המבחנה וההתבגרות שלהם למגקריוציטים נושאי פרופלטלט המסוגלים לשחרר טסיות דם במדיום התרבותי. הליך זה שימושי לניתוח מעמיק של מנגנונים תאיים ומולקולריים השולטים megakaryopoiesis.

תאי CD34+ שמקורם במסנני לויקודלציה כמקור לתא לחקר בידול מגהקריוציט והיווצרות טסיות דם

היווצרות טסיות דם מעודדות נקשרה עם סיכון מוגבר לפקקת. מוצג כאן פרוטוקול מדויק לבידוד טסיות דם שטופות מדם אדם, שנועד לכמת את החשיפה של פוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחית, שהם מאפיינים ייחודיים של טסיות מעודדות.

אפיון טסיות מעודדות קרישה על ידי מדידת חשיפה לפוספטידיל-סרין ושחרור מיקרו-שלפוחיות מטסיות אדם מטוהרות

חילוף החומרים של טסיות הדם מעניין, במיוחד בכל הנוגע לתפקיד של היפראקטיביות והיפראקטיביות של טסיות דם בדימום והפרעות פקקת. בידוד טסיות הדם מפלזמה הכרחי לכמה בדיקות מטבוליות; מוצגת כאן שיטה לבידוד מטבוליטים תוך-תאיים מטסיות דם שטופות.

הכנת טסיות דם אנושיות שטופות למחקרי שטף מטבולי כמותי

למד טיהור טסיות מדם עכבר באמצעות צנטריפוגה בגרדיאנט iohexol. שיטה זו מאפשרת ניתוח זרימה ומיקרוסקופיה לחקר תפקוד טסיות וחיוניותן במחקר ביולוגי.

טיהור של טסיות מתוך דם העכבר

גלה סרטונים נוספים