Name: בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: חקור דינמיקה גרעינית במיטוז ובמיוז בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית תאים חיים בשמר Schizosaccharomyces pombe. שיטה זו מאפשרת תצפית בתהליכים פיזיולוגיים ללא שימוש בחומרים רעילים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות נטליה לה פורקייד ו-Mon LaFerte להכנת כתב יד זה מהנה יותר מאמץ. תודות לחברי מעבדת פורסבורג שתרמו להשלמת העבודה עם התובנה שלהם, התנסות ברעיונות ותמיכה מוסרית. פרויקט זה נתמך על ידי כR35 GM118109 ל-SLF.

<ol><li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy%E2%80%93tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy–tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Green, M. D., Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Microscopy techniques to examine DNA replication in fission yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MD+%22DNA+Replication%22">DNA Replication</a>. (13-41), Humana Press. New York, NY. (2015).</li>
<li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%E2%80%99s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+an+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li>
<li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li>
<li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li>
<li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+%28XPF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li>
<li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li>
<li>Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li>
<li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+methods+for+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSabatinos%2C+SA+%22Methods+in+enzymology%22">Methods in enzymology</a>. 470, Academic Press. 759-795 (2010).</li>
<li>Diffraction PSF 3D. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm">http://www.optinav.info/Diffraction-PSF-3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Optinav.info. Convolve ED. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm">http://www.optinav.info/Convolve_3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Optinav.info. Iterative Deconvolve. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm">http://www.optinav.info/Iterative-Deconvolve-3D.htm</a> (2019).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide — IJ 1.46. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell%E2%80%90cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1%2FS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li>
<li>Ostapenko, D., Burton, J. L., Solomon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+anaphase+promoting+complex+substrates+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of anaphase promoting complex substrates in S. cerevisiae.</a> PLoS One. 7 (9), e45895(2012).</li>
<li>Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+Rec8+is+required+for+reductional+chromosome+segregation+at+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cohesin Rec8 is required for reductional chromosome segregation at meiosis.</a> Nature. 400 (6743), 461-464 (1999).</li>
<li>Zhu, Y. H., Hyun, J., Pan, Y. Z., Hopper, J. E., Rizo, J., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+fission+yeast+UNC-13%2FMunc13+protein+Ync13+in+late+stages+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of the fission yeast UNC-13/Munc13 protein Ync13 in late stages of cytokinesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2259-2279 (2018).</li>
<li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1%E2%80%93Tea4%E2%80%93Pom1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580(2018).</li>
<li>Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).</li>
<li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הדמיה של תא חי במהלך מיטוזיס ו מיוזה מציעה את ההזדמנות לבחון את הדינמיקה הגרעינית מבלי לשבש באופן משמעותי את הפיזיולוגיה שמרים במהלך רכישת נתונים. עם זאת, יש לתרגל זהירות כדי להבטיח שהתאים יגדלו לצפיפויות הרצויות ללא מתחים סביבתיים; ועבור meiosis, כי התאים הם התמונה במהלך הזמן של בידול מסוף ולא מוקדם מדי או מאוחר. עודף הצפיפות התאית, הרעב וטמפרטורות הגדילה הבלתי הולמות הן גורמים נפוצים התורמים לתצפיות מיותרות. בנוסף, במהלך בניית הזנים, חשוב לבדוק כי תגי פלורסנט לא להפריע פונקציות של גנים היעד או השפעה כללית תא כללי. כישלון לבדוק באופן מקרוב את פנוטיפים של זנים הנושאים סמנים פלורסנט עלול לגרום לתוצאות לא עקבית ושאין שונים על פני גנוסוגים דומים.
למרות שרפידות מיקרוסקופ פשוטות להרכבה, הם יכולים גם להציב משוכה בהשגת נתונים הדמיה יקרי ערך. יצירת רפידות מעלה היא פשוטה כמו הצבת שלושה שקופיות מיקרוסקופ במקביל זה לזה, לחלק את הצמח מותכת בשקופית האמצעית, ולשים שקופית כי העברת החלק העליון של השקופיות האחרות. זה שימושי, עם זאת, כדי להרכיב מנגנון יצרנית שקופיות המאפשר שינויים ברוחב כדי לייצר משטחים עמידים, ספציפי למצב הצמח. מכין שקופיות פשוט שנותן גמישות רוחב pad מורכב מפלטפורמה (מחזיק טיפים או ספסל), שתי שקופיות מיקרוסקופ, קלטת מעבדה מתנהג כמו מנגנון התאמת רוחב כרית (איור 1A). עובי מקלדת מדויקת יהיה תלוי בדרישות זמן הדמיה, agarose המותג, טמפרטורה, איטום כיסוי, שיעור אידוי, וכו '. לכן, חשוב לכייל את מערכת ההדמיה לפני רכישת נתונים כדי להגביר את המידע הטכני ולשפר את האיכות של הדמיית התאים החיים1,2,3. משטח המשטח, קשיחות, וקומפוזיציה חיוניים במהלך רכישת תמונה ממושכת. Agarose יש זריחה ברקע נמוך, ניתן ליצוק בקלות, ועל הריכוז המתאים, עם עומד דפורמציה מבנית עקב אידוי. יתר על כן, שילוב מדיה שמרים ביקוע עם agarose אינו מתפשר על איכות התמונה ומאפשר התבוננות מורחבת של מעגלים מרובים ומחזורי מיוזה. כמו כן, חשוב להימנע כל בועות אוויר עבור מיקרוסקופ זמן לשגות. בתוך ובתוך המדגם, כיסי אוויר להתרחב לאורך זמן, גורם העברת תאים ושיבוש מטוסי מוקד. התאים בתנאי מפוזרים ביעילות בנפרד על ידי סיבוב coverslip, החוקרים יכולים לעקוב אחר תהליכים mitotic על פני מספר דורות ואירועים meiotic מן היתוך גרעיני לספורציות. ביצוע ובחירת הלוח הנכון עבור ניסויים הדמיה לוקח זמן מאסטר, אבל פעם השיגה, יכול לתרום לתצפיות מיקרוסקופ אינפורמטיבי מאוד.
כמו המקרה עם שיטות אחרות, מיקרוסקופ תא חי אינו חופשי של מגבלות טכניות. השימוש בחלבונים מתויגים fluorescently מציג גבולות לניסויים המגבילים את היקף מה ניתן ללמוד. צילום-הלבנת ורעילות לתמונות הן בעיות האופייניות לרכישת תמונה ממושכת. ניתן לפעול מנגד על-ידי חוסר חשיפת תאים לאורכי גל קצרים במשך זמן ארוך מדי או לעתים תכופות מדי. עבור ניסויים מעורבים GFP, CFP, YFP, mRFP, ו-DsRed, חלבונים הניאון אופייני המשמשים שמרים ביקוע לחיות הדמיה, זה נפוץ להעסיק 5-15% עירור אור ו 100-500 ms זמן חשיפה עבור ניסויים שגרתיים. פרמטרים אלה משתנים, לעומת זאת, בהתאם לדרישות הניסוי הספציפיות של החוקר. בנוסף, z-ערימות מורכב של 9-13 סעיפים עם 0.5 יקרומטר מרווח באמצעות מטרה 60x הוא מספיק כדי לפתור את העובי של תא שמרים ביקוע. יתר על כן, חשוב לאשר כי סמנים פלורסנט לא לשבש תקנה נכונה או תפקוד של חלבונים היעד או ליצור פנוטיפים מזויף. לכן, מומלץ לבנות זנים המכילים פלורסנט שונים ותגי אהדה עבור אותו גן יעד כדי לאמת את התצפיות באמצעים שונים. יתר על כן, היא האחריות של החוקרים כדי להבטיח כי פרמטרים ניסיוניים ניתן לשכפל על פני ניסויים וכי הנתונים שנאספו מתאימים ניתוח במטה1,3. טכנולוגיה לא יכול להחליף את התרגול נבדק בזמן של אימות בקפדנות מערכות ניסיוני על ידי התבוננות זהירה ובדיקה קפדנית של יניאריות בזיהוי אותות פלורסנט.
לבסוף, חשוב לנתח נתונים מיקרוסקופית בפורמטים שאינם משנים תמונות raw. פיג'י מספק כלי תיעוד מצוינים למעקב אחר מדידות נתונים גולמיים ומאפשר לחוקרים לבחון פרמטרים שונים של תאים בהפעלה אחת. תכונות אלה, כמו גם העושר שלה של הדרכות מקוונות וכיסוי ספרות נרחבת, להפוך את פיג'י כלי חשוב למדידת, ניתוח, והצגת הדמיה של תא חי נתונים המתארים את הדינמיקה הגרעינית של שמרים ביקוע ב מיטוזיס ו meiosis.

מיקרוסקופ תא חי מאפשר לחוקרים לבחון את הדינמיקה הגרעינית מבלי להרוג תאי שמרים ביקוע ומבטל את הצורך בתיקונים וכתמים קטלניים. ניתן לראות את היציבות, תנועה, לוקליזציה, והעיתוי של חלבונים מתויגים fluorescently כי הם מעורבים באירועים חשובים כגון שכפול כרומוזום, שילוב מחדש, והפרדה, בנוסף קרום והשלד ציטוזה תנועות. על ידי שמירה על הכדאיות התאית וזיהוי אותות שאינם רעילים, ישנה חדירה פיזיולוגית מינימלית. כאשר מבוצע כראוי, שיטה זו מיקרוסקופית יכולה להפחית את ההשפעות ההמייסדות שעולות מהטיפול הטכני המורחב או מפעילות מחודשת כימית מלאכותי. יתר על כן, במהלך הניסוי, החוקרים יכולים לעשות תצפיות מסוימות של מצבי הלחץ והמתח שמרים ביקוע, יעילות ההתרבות, ומצב האפוטוטיק המציינות פרמטרים לא הולמים הדמיה או פיזיולוגיה תא נורמלי1 ,2,3.
מיטוזיס ומיוזיס מאופיינים בחלוקה גרעינית ותאית. ב מיוזיס, בניגוד מיטוזיס, התוכן הגנטי הוא הסתפק בתאי ההורה להצמיח תאים הבת4. מכיוון שדימות תאים חיים מספק ממד זמני בנוסף לקשר המרחבי, ניתן לבחון מספר גדול של תאים בזמן אמת. מיקרוסקופ תא חי איפשר לחוקרים לבחון את הדינמיקה של החטיבה הגרעינית באמצעות תגי פלורסנט עבור יסטוניים5, cohesin חלבוניות6, microtubules7, צנטוממרים8, קינטומטלות9, מרכיבים של הגוף מוט הציר (SPB)10, ואלה של קומפלקס הנוסעים כרומוזום (cpc)11. מחוץ למנגנון ההפרדה של כרומוזום, הדמיה תא חי גם לכדו את ההתנהגות של חלבונים הנחוצים, אבל לא מעורב ישירות בהפרדה כרומוזום. הפונקציה של חלבונים אלה הוכח להשפיע על השכפול, כרומוזום שילוב מחדש, תנועה גרעינית, וכרומוזום מצורף ל microtubules12,13,14. תצפיות אלה תרמו להבנה טובה יותר של אירועים סלולאריים שהרכיבים הפונקציונליים שלהם לא היו מתכלים לבחינה ביוכימית או גנטית. עם ההתקדמות החדשה בטכנולוגיה מיקרוסקופית, מגבלות כגון ברזולוציה ירודה, הלבנת, פוטורעילות, ויציבות מיקוד יהיה להפחית, ובכך להקל על תצפיות בזמן אמת טוב יותר של mitotic ודינמיקה גרעינית מיוטית1, 2,3. Meiosis מאתגרת במיוחד כפי שהוא מסלול בידול מסוף שדורש תשומת לב מקרוב לתזמון.
המטרה של פרוטוקול זה היא להציג שיטה פשוטה יחסית לבחינת הדינמיקה הגרעינית בזמן אמת ביקוע הגרעיני מיטוזיס ו meiosis. כדי להשיג זאת, יש צורך להשתמש בתאים שלא נחשפו למתח סביבתי, להכין רפידות agarose שיכולות לעמוד בהדמיה ממושכת, וכן לטעון תאים בצפיפויות המאפשרים הדמיה של דינמיקה תא בודד. יתר על כן, פרוטוקול זה עושה שימוש בתאים הנושאים חלבונים מתויגים fluorescently המשמשים כסמנים שימושיים עבור קינטיקה גרעינית (Hht1-mRFP או Hht1-GFP), הפרדה כרומוזום (Sad1-DsRed), הדינמיקה של השלד (Atb2-mRFP), ההמרה הפעלה ב-G1/S (Tos4-gfp), ויציבות הלכידות ב-מיוזה (Rec8-gfp). שיטה זו גם מציגה סמנים גרעיניים ו ציטוסולג נוספים (טבלה I) כי ניתן להשתמש בצירופים שונים כדי לטפל בשאלות על תהליכים סלולריים ספציפיים. יתר על כן, כלי פיג'י בסיסיים מוצעים כדי לסייע לחוקרים לעבד תמונות בתאים לחיות ולנתח סוגים שונים של נתונים. כוחה של גישה זו נובע משימוש בתצפיות בזמן אמת של דינמיקת חלבון, עיתוי ויציבות לתיאור תהליכים הנמצאים בלתי-מתאימים לביצוע הראוי של מיטוזיס ומיוזיס.

<table><tbody><tr><td>60x תוכנית אפוכרומט עדשה אובייקטיבית</td><td>אולימפוס</td><td>AMEP4694</td><td></td></tr><tr><td>אדנין</td><td>סיגמא</td><td>A-8751</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>7558B</td><td>IB4917-10 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא</td><td>A9539-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>רקדנית בטן מסובב סטובל</td><td></td><td>פטנט ארה"ב #4.702.610</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>סיגמא</td><td>B-4501</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>סיגמא</td><td>B-6768-5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20,</td> <td>Sigma</td><td>C3306-500G</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>Sigma</td><td>C-0759</td><td></td></tr><tr><td>תוסף תוכנת תלת מימד Convolve</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ CCD מצלמה</td><td>Roper</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>תלוש כיסוי</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H20,END</td><td></td> <td>CX-2185-1</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision מיקרוסקופ פלואורסצנטי דה-קונבולוציה</td><td>GE Healthcare/Applied Precision</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Diffraction PSF 3D Software plug-in</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>אדינבורו מינימלי מדיום (EMM) Notrogen</td><td>Sunrise</td><td>2023; 1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&middot; 6H2O</td><td>END</td><td>FX9259-04</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>צלחת חום</td><td>Barnstead</td><td>Thermo Lyne</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8125-100g</td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolution software</td><td>SVI</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Imaris deconvolution software</td><td>bitplane</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מעבדת מעטפת</td> <td>חממה</td> <td>#3015</td><td></td></tr><tr><td>אינוזיטול</td><td>סיגמא</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>תוסף תוכנה תלת מימדית איטרטיבי Deconvolve</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckvadt</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>לנולין</td><td>סיגמא</td><td>L7387-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>לאוצין</td><td>סיגמא</td><td>L8912-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>ליזין</td><td>סיגמא</td><td>L5626-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>תמצית מאלט (ME)</td><td>MP</td><td>4103-032</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H20</td><td>AMRESCO</td><td>0288-500G</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4,</td> <td>Mallinckvadt</td><td>6192-02</td><td></td></tr><tr><td>חומצה מוליבדית</td><td>Sigma</td><td>M-0878</td><td></td></tr><tr><td>Na2S04 </td><td>Mallinckvadt</td><td>8024-03</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ניקוטינית,</td> <td>Sigma</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פנטותנית</td><td>Sigma</td><td>P-5161</td><td></td></tr><tr><td>שעוות פרפין</td><td>פישר</td><td>s80119WX</td><td></td></tr><tr><td>פומבה גלוטמט מדיום (PMG)</td> <td>Sunrise</td><td>2060-250</td><td></td></tr><tr><td>softWorx v3.3 תוכנת עיבוד תמונה</td><td>GE Healthcare</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sporulation אבקה בינונית</td><td>Sunrise</td><td>1821-500</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מבוקרת טמפרטורה</td><td>בקמן</td><td>Allwgra 6KR קסנטריפוגה</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>AMRESCO</td><td>0847-500g</td><td></td></tr><tr><td>וזלין</td><td>אקוולין</td><td>F79658</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים בתוספת תוספי מזון (YES)</td><td>זריחה</td><td>2011-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO<תת>4&middot; 7 ש'<תת>2</תת>O</td><td>ג'יי טי בייקר</td><td>4382-04</td><td></td></tr></tbody></table>

בחינת mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

הדמיה של תא חי היא טכניקה מיקרוסקופית המשמשת לבדיקת הדינמיקה של תאים וחלבונים בתאי החיים. שיטת דימות זו אינה רעילה, בדרך כלל אינה מפריעה לפיזיולוגיה של התאים, ודורשת טיפול ניסיוני מינימלי. רמות נמוכות של הפרעות טכניות לאפשר לחוקרים לחקור את התאים על פני מחזורים מרובים של מיטוזה ו להתבונן מיוזה מתחילתו ועד סופו. באמצעות תגי פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק (GFP) וחלבון פלורסנט אדום (RFP), החוקרים יכולים לנתח גורמים שונים שתפקידם חשוב עבור תהליכים כמו תמלול, שכפול דנ א, לכידות, והפרדה. ביחד עם ניתוח נתונים באמצעות פיג'י (גרסה חופשית, ממוטבת של התמונה), הדמיה של תא חי מציעה דרכים שונות להערכת התנועה חלבון, לוקליזציה, יציבות, תזמון, כמו גם דינמיקה גרעינית והפרדה כרומוזום. עם זאת, כמו במקרה של שיטות מיקרוסקופ אחרות, הדמיה של תא חי מוגבלת על ידי המאפיינים הפנימיים של אור, אשר לשים מגבלה על כוח הרזולוציה בעלי הרמה גבוהה, והוא גם רגיש לפוטוהלבנה או רעילות באורך הגל הגבוה תדרים. עם זאת, בטיפול מסוים, החוקרים יכולים לעקוף את המגבלות הפיזיות הללו על ידי בחירה קפדנית של התנאים הנכונים, זנים, סמנים פלורסנט כדי לאפשר הדמיה מתאימה של אירועים mitotic ו-meiotic.

כאן, אנו מציגים הדמיה תא חי שהיא שיטת מיקרוסקופ לא רעיל המאפשר לחוקרים ללמוד התנהגות החלבון הדינמיקה הגרעינית בתוך חי ביקוע תאים שמרים במהלך מיטוזיס ו meiosis.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

מיקרוסקופיה של תאים חיים מאפשרת לחוקרים לחקור דינמיקה גרעינית של שמרי ביטוזה ומיוזיס בזמן אמת. כוחה של שיטה זו מגיע מלימוד תהליכים גרעיניים בתאים חיים בתנאים פיזיולוגיים רגילים אשר מבטל את הצורך fixatives רעילים וכתמים. טכניקה זו מטפלת בשאלות הקשורות לתזמון חלבון, יציבות וניידות שאינן זמינות למניפולציה גנטית או ביומכנית.זה קריטי לשים לב לבריאות וכושר של תאי שמרים ביבוע לפני הדמיה. בדוק תמיד מורפולוגיה ומאפייני צמיחה כדי להבטיח עקביות של תוצאות על פני ניסויים. פרוטוקול זה מציג את הדרך הפשוטה יחסית להכין שקופיות מיקרוסקופ שכאשר שולטים כראוי יכול לשפר את העקביות ואת הרבייה של דימות תאים חיים ממושך.כדי להתחיל לאסוף חומר תאים מצלחת ההתעוררות הקריוגנית, תפסו אותו על צלחות YES, והדוגר אותם ב-25 מעלות צלזיוס או 32 מעלות צלזיוס בהתאם לגנוטיפ השמרים כדי להעיר זני שמרי ביקוע משיימור קריוגני. לאחר מכן השתמש בלולאה סטרילית כדי לאסוף תאים מהמושבות הבודדות בזני שמרי הבניקון המתעוררים ולחסן אותם במבחנות המכילות שלושה מיליליטר של מדיום נוזלי של YES. מניחים את הצינורות בשייקר ב 150 עד 220 סל"ד לגדול ב 25 או 32 מעלות צלזיוס לילה לשלב יומן מאוחר עם קריאה בצפיפות אופטית הרצויה של 0.7 עד 1.0.העבר 10 מיקרוליטרים של התרבות לשקופית מיקרוסקופ. שים כיסוי על ולהניח אותו תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק מורפולוגיה התא הנכון מצב תזונתי. כדי להקים שקופית מיקרוסקופ עבור מיטוזה או ניתוח meiosis הראשון להוסיף שני גרם של אגרוז בבקבוק 500 מיליליטר המכיל 100 מיליליטר של או בינוני מינימלי בתוספת תוספי תזונה עבור מיטוזה או נוזלי sporulating בינוני עבור meiosis.מחממים את תסנו ה-Agarose בתנור מיקרוגל בהפקת חשמל של 60% במרווחים של 10 שניות או מניחים את המקם באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סובב את הפתרון כדי להבטיח התכה יעילה. הגדר שתי שקופיות מיקרוסקופ על מחזיק קצה פיפטה כאשר השקופית העליונה מונחת על שתי ערימות של סרט מעבדה בשני הקצוות כתמיכה בהכנת צורת צלב.התאם את המרחק בין שתי השקופיות ליותר משני מילימטרים כדי ליצור משטח עבה בשלבים הבאים להדמיה ממושכת. לאחר קירור agarose מותך במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, להסיר את השקופית העליונה ולהשתמש טיפ פיפטה משעמם רחב לוותר 50 עד 100 microliters על השקופית התחתונה כדי להפוך את נקודה. לפני התעוררות מתקרר למקם את השקופית העליונה על גבי כדי ליצור כרית התפשטות של כאחד ו 1/2 כדי שני סנטימטרים קוטר.דימות תאים חיים אופטימלי הוא קריטי עבור שלבי עיבוד הנתונים הבאים. הקפד לחסל את כל קישוטי אוויר אגרוז מותך וליצור כרית דקה לתקופות הדמיה יותר מארבע שעות. כדי לבחון אירועים מיוטיים לגדל תאים מתרבויות המתנע ב EMM נוזלי או PMG בתוספת תוספי מזון לילה.מעבירים מיליליטר אחד של התרבות לקובט, ומודדים על הספקטרופוטומטר באורך גל של 595 ננומטר. צמיחת התא נחשבת שלב באמצע יומן כאשר הצפיפות האופטית מגיעה 0.4. ואז צנטריפוגה מיליליטר אחד של ההשעיה התא ב 1, 375 פעמים g לדקה אחת.הסר את supernatant ו resuspend גלולת התא בינוני מינימלי בתוספת תוספי תזונה לנפח הסופי של 100 microliters. כדי תמונה אירועים meiotic לגדול תאים מתרבויות המתנע בינוני מינימלי בתוספת תוספי מזון בן לילה. צמיחת תאים נחשבת שלב יומן מאוחר כאשר הצפיפות האופטית ב 595 ננומטר הוא בין 0.7 ואחד.לאחר מכן, מתרבויות יומן מאוחר להשיג 500 microliters של כל סוג חבר זן, H שלילי ו H חיובי, ולשלב כדי להפוך את השעיית תא מיליליטר אחד. צנטריפוגה התאים ב 1, 375 פעמים גרם לדקה אחת. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה במיליליטר אחד של תמצית מלטוז נוזלי.חזור על תמצית מלטוז לשטוף שלוש פעמים נוספות כדי להבטיח הסרת חומרים מזינים יעילה. לאחר תמצית מלטוז האחרונה לשטוף resuspend התאים במיליליטר אחד של תמצית מלטוז ולהעביר את התערובת לבקבוק 50 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של תמצית מלטוז. דגירה במשך 12 עד 16 שעות ב 22 עד 25 מעלות צלזיוס במהירות סיבוב מינימלית בין 50 ל 100 סל"ד.המראה של גושי שמרי ביקוע עגולים רבים הנובעים משפע של תדלוק עצמי מצביע על הזדווגות יעילה. לאחר מכן, קח דגימה של מיליליטר של תרבות ההזדווגות והצנטריפוגה ב 1, 375 פעמים g לדקה אחת. הסר 750 מיקרוליטרים של העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים בשארית העל-טבעית.וורטקס במרץ במשך חמש שניות כדי לשבש את הגושים. לוותר על 20 מיקרוליטרים של מתלה תאים מיוטי או מיוטי על כרית של 2%. הסר כל מדיום עודף על ידי היפוך השקופית ולשים אותו על החלק העליון של מגבת נייר ללא מוך במשך שתיים עד שלוש שניות.הפוך את השקופית והצב בעדינות כיסוי זכוכית על החלק העליון של הפנקס, כדי להבטיח שלא ליצור בועות אוויר. כדי ליצור monolayer התא לסובב את coverslip בכיוון השעון עם האצבע המורה עבור סיבוב אחד מלא עבור תאים מיטוזה או שני סיבובים מלאים עבור תאי meiosis. ודא כי החומר התא מתפזר על פני כרית אגרוז המאפשר הפרדה טובה יותר של תאים בודדים או asci.בעזרת מקל עץ קטן לוותר על איטום פחמימנים מותך לאורך הקצוות של כיסוי לאטום כל כרית אגרוז. לאחר כרית אגרוז אטום למקם אותו על שלב מיקרוסקופ. הפעל את תא הטמפרטורה והגדר אותו לטמפרטורה הרצויה.מניחים צלחת עם מגבת נייר רטובה לתוך התא כדי לשלוט בלחות של מערכת המיקרוסקופ. תן לו לצייד במשך 10 עד 15 דקות בתנאי ההדמיה המתאימים. זה מאפשר לכל בועות האוויר הנותרות להתפוגג וכל שינוי של הרגע האחרון התעורר להתרחש.השתמש במטרה 40X כדי למצוא שדות תצוגה מתאימים לתמונה. עבור למטרה 60X כדי להתחיל ברכישת נתונים. בתוכנה השולטת בתפקוד המיקרוסקופ, בחר את ערכות מסנן המיקרוסקופ התואמות בצורה הטובה ביותר לפליאורופורים תחת השגחה.התאימו את אורכי הגל של העירור כך שיתאימו לפלאורופורים שבהם נעשה שימוש, השתמשו בכוח העירור הנמוך ביותר שמייצר אות עקבי, והשתמשו בזמני חשיפה של ארבע עד שמונה שעות כדי ליצור נתוני הדמיה מקובלים אך ניתנים לכימות ושחזור. לאסוף לפחות שש נקודות זמן רכישה בכל שעה. בתוכנת איסוף התמונות בחרו לפחות ערוץ פלואורסצנטי אחד שממנו ניתן לרכוש נתונים ומעסיקים מלאי Z המורכב מ-13 מקטעים עם מרווח של 0.5 מיקרומטר.בתוכנת פיג'י להעלות תמונה deconvolved על ידי בחירת התכונה ביו-פורמטים יבואן תחת תפריט תוספים. בחלון הנפתח 'אפשרויות ייבוא', בחרו 'היפרסטאק', 'מצב צבע ברירת מחדל', בדקו את האפשרות 'שינוי גודל אוטומטי' וחצו על הלחצן 'אשר'. ודא שלחלון המוצג יש את המספר הנכון של ערוצי פלואורסצנטיות ומסגרות זמן על-ידי גלילה לצדדים על הסורגים המתאימים בתחתית.שמור כקובץ Tiff שאינו דוחס נתונים. לאחר מכן, בתפריט 'ניתוח', השתמשו באפשרות 'קבע מידות' לבחירת פרמטרים שונים. לדוגמה:שטח, ערך אפור מרבי דק, דחיסות משולבת, ערך אפור ממוצע, חציון, מיקום מחסנית, היקף ותווית תצוגה.בחרו 'צבע' ולחצו על הכלי ערוצים. בחלון הנפתח Channels בדקו את ערוץ הצבע עבורו יימדדו העוצמה או האזור. בחר תמונה ולאחר מכן הקלד ולחץ על 32 סיביות.בחרו בתכונות 'התאם' ו'סף' מתפריט 'תמונה'. סמן את התיבה רקע כהה, בחר את שיטת ברירת המחדל ובחר אדום כדי שכבת-על של אותות העניין. השתמש בכלי השרביט כדי לסמן כל מבנה מעניין ולחץ על האות T בלוח המקשים כדי להוסיף את ההשקעה שנבחרה לחלון מנהל ההשקעות המוקפץ.לאחר מכן, פתח את תיקיית ROI מכווצת כדי לטעון את מנהל ROI ולחץ על כל מזהה ROI בלוח בצד שמאל. בחרו 'מדוד' מתפריט 'נתח' וחזרו על פקודה זו בכל מזהה ROI כדי לכמת את האובייקטים המעניינים בכל פרוסות מחסנית התמונות. שמור את התוצאות כקובץ CSV לניתוח סטטיסטי.במחקר זה אם תאים גוועים ברעב עקב הגבלה תזונתיים או יתר על כן, הם יראה vacuoles עודף וגודל תאים מופחת. תאים לוגריתמיים מראים שכפול DNA פעיל וחלוקת תאים, כמו גם ביטוי Tos4-GFP פאן-גרעיני והפרדת מוקדים Sad1-DsRed. כישלון להזדווג, כמו במקרה של תאים אינם מורעבים מספיק של חנקן, ימנע מהם להיכנס meiosis.זוג תאי בוקיום העוברים קריוגמיה מוצגים. פלוקלציה חזקה של המתלים מתא ההזדווגות מגבירה את האינטראקציה בין התא לתא ובכך מצביעה על הזדווגות מוצלחת ועל אינדוקציה מיוטית יעילה. Zygotic asci לקחת צורות מרובות, כולל צורות זיג זג ותא בננה.במיטוזיס כמו תאים לעבור ממטאפאז לטלופאז, השינוי הראשון כרוך התכווצות של גודל גרעיני במטאפאזה, ואילו השני מראה פיצול גרעין במהלך אנאפס. מלבד שיתוף כמה דינמיקות הפרדה עם תאים mitotic, תאים meiotic להפגין תנודות גרעיניות במהלך recombination הומולוגי הפחתה נוספת של נוקלאוזידים בסוף anaphase II.It היא באחריות החוקרים כדי להבטיח כי פרמטרים הניסוי ניתן לשכפל על פני ניסויים, כי הנתונים שנאספו מתאים לניתוח במורד הזרם. הדמיית תאים חיים אפשרה לחוקרים לבחון בפירוט רב את המכניקה של החטיבה הגרעינית במיטוזיס ומיוזיס.ככל שתגי פלואורסצנטיים ויכולות מיקרוסקופ ישפרו את מספר וסוג התהליכים שאנו יכולים לצפות בהם יגדלו.

examination-mitotic-meiotic-fission-yeast-nuclear-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

אנו מספקים שיטה בסיסית הניתנת לשחזור למיקרוסקופיה ארוכת טווח של מחזור החיים המיני של שמרי ביקוע. עם התאמות קלות שתוארו, הפרוטוקול המוצג מאפשר התמקדות מחקרית בשלבים שונים של תהליך הרבייה.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

שמרי הביקוע, שמר החלוקה היא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis, השלב הסופי חלוקת תא. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופ לנתח אירועים cytokinetic שונים בתאי שמרים ביקוע חי.

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

, מבחר microinjection, הדמיה של fluorescently שכותרתו F-אקטין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רבב (FSM).

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לתמונה ולכמת את העיתוי mitotic של חיים יונקים התרבות תאים ורקמות לאחר transfection siRNA.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

גישה חזקים כדי לפקח על משלוח של האברונים את לומן חומצי של vacuole את השמרים במשך השפלה ומיחזור מתואר. השיטה מסתמכת על תיוג הספציפי של האברונים היעד עם פלואורסצנטי כפול פליטת מקודדים גנטית pH-biosensor, ויזואליזציה של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

חקור דינמיקה גרעינית במיטוז ובמיוז בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית תאים חיים בשמר Schizosaccharomyces pombe. שיטה זו מאפשרת תצפית בתהליכים פיזיולוגיים ללא שימוש בחומרים רעילים.

בחינת Mitotic ומיוטיק ביקוע הדינמיקה הגרעינית על ידי הזריחה לחיות-מיקרוסקופ התא

גלה סרטונים נוספים