Name: בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: למדו שיטת תיוג ביוטין לחקירת אינטראקציות חלבון-חומצת גרעין בתוך מבחנה. הפרוטוקול מאפשר ניסויים אמינים וחוזרים לאורך זמן ללא ציוד מיוחד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים P. ג'רמי וואנג (אוניברסיטת פנסילבניה) עבור עריכות ודיונים מועילים. אנחנו גם מודים Sigrid Eckardt לעריכת שפה. ק. ז. היה נתמך על ידי תוכנית מפתח לאומי R & D של סין (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) והקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31771653). ל. י. הייתה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81471502, 31871503) ותוכנית חדשנית ויזמית של מחוז ג'יאנגסו. J. N. נתמך על ידי ג'ה-ג'יאנג מדע הרפואה והטכנולוגיה פרויקט (2019KY499). מ. ל. הייתה נתמכת על ידי מענקים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31771588) ו-1000 תוכנית כישרון הנוער.

<ol><li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox30+initiates+transcription+of+haploid+genes+during+late+meiosis+and+spermiogenesis+in+mouse+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes.</a> Development. 145 (13), (2018).</li>
<li>Watanabe, T., Lin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+gene+expression+by+Piwi+proteins+and+piRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs.</a> Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).</li>
<li>Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+high-throughput+screening+method+to+identify+compounds+targeting+protein-nucleic+acids+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), 52(2015).</li>
<li>Hwang, H., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+induced+fluorescence+enhancement+%28PIFE%29+for+probing+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions.</a> Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+DNA-protein+interactions+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).</li>
<li>Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+quantitative+EMSA+and+its+application+in+the+study+of+RNA--protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).</li>
<li>Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+binding+affinity+of+poly%28ADP-ribose%29+to+specific+binding+proteins+as+a+function+of+chain+length%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length.</a> Nucleic Acids Research. 35 (21), 143(2007).</li>
<li>Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+Protocol+for+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Infrared+Fluorescent+Dye-labeled+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Yan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphan+Nuclear+Receptor+Nur77+Inhibits+Cardiac+Hypertrophic+Response+to+Beta-Adrenergic+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+the+study+of+RNA-protein+interactions%3A+the+IRE%2FIRP+example%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Nishida, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+roles+of+mitochondrial+Papi+and+Zucchini+in+Bombyx+germline+piRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis.</a> Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).</li>
<li>Anders, C., Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+enzymology+of+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro enzymology of Cas9.</a> Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).</li>
<li>Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+plant+in+vitro+assay+system+for+pre-mRNA+cleavage+during+3%27-end+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation.</a> Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li>
<li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+Is+a+5%27+to+3%27+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3%27+UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), (2014).</li>
<li>Talwar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAD-box+protein+DDX43+%28HAGE%29+is+a+dual+RNA-DNA+helicase+and+has+a+K-homology+domain+required+for+full+nucleic+acid+unwinding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).</li>
<li>Nagy, N. M., Konya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+fast+and+slow+consecutive+processes+by+heterogeneous+isotope+exchange+using+P-32+radiotracer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radioanalytical+And+Nuclear+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer.</a> Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).</li>
<li>Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Probes+for+ALKBH2+Allow+the+Measurement+of+DNA+Alkylation+Repair+and+Drug+Resistance+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses.</a> Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).</li>
<li>Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essentials+of+biorecognition%3A+the+%28strept%29avidin-biotin+system+as+a+model+for+protein-protein+and+protein-ligand+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction.</a> Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).</li>
<li>Trippier, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+strategies+for+the+biotinylation+of+bioactive+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules.</a> ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).</li>
<li>Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biotin-labeled+nucleic+acids+for+protein+purification+and+agarose-based+chemiluminescent+electromobility+shift+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+Pulldown+of+Biotinylated+RNA+for+Detection+of+Protein-RNA+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes.</a> Bio-Protocol. 6 (24), (2016).</li>
<li>Bednarek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNAs+biotinylated+within+the+5%27+cap+and+protected+against+decapping%3A+new+tools+to+capture+RNA+-+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+Of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes.</a> Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).</li>
<li>Souquet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIOB+Targets+Single-Strand+DNA+and+Is+Necessary+for+Meiotic+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination.</a> Plos Genetics. 9 (9), (2013).</li>
<li>Luo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIOB+exhibits+single-stranded+DNA-binding+and+exonuclease+activities+and+is+essential+for+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination.</a> Nature Communications. 4, 2788(2013).</li>
<li>Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+proteins+MEIOB+and+SPATA22+cooperatively+associate+with+the+single-stranded+DNA-binding+replication+protein+A+complex+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks.</a> Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).</li>
</ol>

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

חקירת אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצות הוא קריטי להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים ביולוגיים מגוונים. לדוגמה, meiob הוא חלבון ספציפי להעיד חיוני עבור meiob ופריון ביונקים25,26,27. MEIOB מכיל תחום OB הנקשר ל-DNA בודד נטוש ומוצגים 3 ' כדי 5 ' הפעילות של אקסאוחכירה26, אשר מתייחס ישירות הרלוונטיות הפיזיולוגית שלה במהלך reiotic שילוב. דוגמה נוספת, MOV10 הוא RNA הליקאז עם פונקציה בכל מקום שעשוי לקשר ע...

אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה מעורבים בתהליכים סלולריים חיוניים רבים כגון תיקון DNA, שכפול, תמלול, עיבוד RNA, ותרגום. אינטראקציות חלבונים עם רצפי DNA ספציפיים בתוך כרומטוטין נדרשים לשליטה הדוקה של ביטוי הגנים ברמה הטרנסספית1. התקנה מדויקת של הפוסטסקריפט של קידוד רבים והתקנת RNAs שאינה מחייבת אינטראקציות נרחבות ומסובכות בין כל חלבון ו-RNA2. שכבות אלה של ביטוי גנטי מנגנון הרגולציה מהווים מפל של אירועים מולקולריים דינמיים, אשר מתואמים על ידי אינטראקציות של שעתוק/אפיגנטי גורמים או RNA-מחייב חלבונים עם מטרות חומצות גרעין שלהם, כמו גם אינטראקציות חלבונים בחלבון. כדי לנתח אם חלבונים בvivo משויכים במישרין או בעקיפין לחומצות גרעין וכיצד מתרחשות שיוכים ומתקרבים, באופן ביוכימיים מתורבת מתנהלים כדי לבחון את הזיקה הקשירה או הפעילות האנזימטית של חלבונים המעניינים ב עוצב מצעים של DNA ו/או RNA.
טכניקות רבות פותחו כדי לזהות ולאפיין חומצות גרעין מתחמי חלבון, כולל משמרת הניידות electrophoretic (emsa), הנקרא גם שיטת לפיגור ג'ל או משמרת הלהקה שיטת3,4,5 . EMSA היא שיטה מגוונת ורגישה ביוכימית המשמשת רבות ללימוד הכריכה הישירה של חלבונים עם חומצות גרעין. Emsa מסתמך על משמרת ג'ל אלקטרופסטי בלהקות, אשר באופן שגרתי דמיינו באמצעות chemiluminescence כדי לזהות תוויות ביוטין6,7, את הזריחה של תוויות fluorophore8,9, או על ידי האדיגרפיה של רדיואקטיבי 32P מדבקות10,11. מטרות אחרות של מחקרים ביוכימיים הם זיהוי ואפיון של פעילות עיבוד חומצות גרעין של חלבונים, כגון תגובות nuclease מבוסס להעריך את מוצרי מחשוף מתוך חומצות גרעין מצעים12, מיכל בן 13 , 14 ו-DNA/RNA מבנה-הרגיעה בחני להעריך את פעילות הליקאז15,16,17.
במסגרת הפעילות האנזימטית הזאת, חומצות הגרעין המסומנות ברדיואיזוטופ או fluorophore המסומנות בדרך כלל כסובסטרטיות בשל רגישותם הגבוהה. ניתוח רדיוגרפים של תגובות אנזימטיות הכרוכות ב- 32P המסומן באמצעות רדיומשדרים שנמצאו רגישים לבין18. עם זאת, במספר גדל והולך של מעבדות בעולם, השימוש ברדיואיזוטופים מוגבל או אסור אפילו בשל הסיכונים הבריאותיים הקשורים לחשיפה פוטנציאלית. בנוסף לחששות ביולוגיים, החסרונות האחרים הם הציוד הנדרש הדרוש כדי לנהל את העבודה עם רדיואיזוטופים, נדרש רדיואקטיביות רישיון, קצר מחצית חיים של 32P (כ 14 ימים), הידרדרות הדרגתית של איכות החללית בשל . בדיקת רדיופוליזיס Thus, שיטות חלופיות שאינן איזונושא פותחו (כלומר, תיוג הגשוש עם fluorophores מאפשר זיהוי על ידי הדמיה פלורסנט19). עם זאת, מערכת הדמיה ברזולוציה גבוהה יש צורך בעת שימוש בבדיקות מתויג פלואורוסקופים. Biotin, תווית בשימוש נפוץ, נקשר בקלות קרו ביולוגיים כגון חלבונים וחומצות גרעין. Biotin-streptavidin מערכת פועלת ביעילות ומשפרת את רגישות הזיהוי מבלי להגדיל את הרקע שאינו ספציפי20,21. מלבד emsa, ביוטין משמש רבות עבור טיהור חלבון ו-RNA למשוך למטה, בין השאר22,23,24.
פרוטוקול זה משתמש בהצלחה בחומצות גרעין ביוטין המסומנות כסובסטרטיות לשימוש בלתי-מתורבת ביולוגי הכולל EMSA, בנוסף לתגובות אנזימטית בהן לא נעשה שימוש נפוץ בביוטין. מתחם meiob OB הוא בנוי ושני מוטציות (מוטציה חיתוך נקודה) מבוטאים כמו gt היתוך חלבונים25,26,27, כמו גם עכבר MOV10 רקומביננטי דגל היתוך חלבון16. דו ח זה מדגיש את האפקטיביות של פרוטוקול משולב זה לטיהור חלבונים ולצורך ביוטין מתויג במטרות נסיוניות שונות.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף, גרמניה</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה כימילומינסנט</td><td>טאנון, סין</td><td>5200</td><td></td></tr><tr><td>סוניפר דיגיטלי</td><td>ברנסון, ארה"ב</td><td>BBV12081048A</td><td>450 וואט; 50/60 הרץ</td></tr><tr><td>כתם אלקטרופורטי חצי יבש</td><td>Hoefer, ארה"ב</td><td>TE77XP</td><td></td></tr><tr><td>אקדח צינור&nbsp;</td><td>קריסטל, ארה"ב</td><td>3406051</td><td></td></tr><tr><td>UV-LIGHT CROSS-LINKER</td><td>UVP, USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 מסנן צנטריפוגלי&nbsp;</td><td>Milipore, ארה"ב</td><td>UFC801096</td> ממברנת ניילון <td>4 מ"ל/10 K</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific, ארה"ב</td><td>TG263940A</td><td></td></tr><tr>קורנינג<td>צלחות תרבית שטופלו ב-TC</td><td>, ארה"ב</td><td></td><td>430167 100 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>קורנינג צלחת תרבית מטופל</td> TC<td>, ארה"ב</td><td>430597</td><td>150 מ"מ&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות מיקרו-צינורות</td><td>AXYGEN, ארה"ב</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות</td><td>קורנינג, ארה"ב</td><td>430791</td><td>15 מ"ל</td></tr><tr><td><ריאגנטים חזקים>ריאגנטים&nbsp; < / חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>SunShine Bio, סין</td><td>8h288h28</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים מגנטיים נגד FLAG M2</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>M8823</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>תרמו מדעי, ארה"ב</td><td>591136</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פיתוח צבע פוספטאז אלקליין BCIP / NBT</td><td>Beyotime, סין</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>CelLyticTM M ליזיס תאים ריאגנט&nbsp;</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>107M4071V</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II ערכת שיבוט צעד אחד&nbsp;</td><td>Vazyme, סין</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>ערכת זיהוי חומצות גרעין כימיות</td><td>Thermo Scientific, ארה"ב</td><td>T1269950</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, ארה"ב</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, ארה"ב</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>מאגר DPBS</td><td>Gibco, ארה"ב</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>AM9260G</td><td>0.5 מ'</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז חינם EDTA</td><td>רוש, ארה"ב</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פלסמיד מקסי EndoFree&nbsp;</td><td>Vazyme, סין</td><td>&nbsp; DC202</td><td></td></tr><tr><td>FastPure ג'ל מיצוי DNA מיני ערכת</td><td>Vazyme, סין</td><td>DC301-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, ארה"ב</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>פפטיד FLAG</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא, ארה"ב</td><td>SHBK3676</td><td></td></tr><tr><td>GST בתפזורת ערכת</td><td>GE Healthcare, ארה"ב</td><td>27-4570-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigmaארה"ב</td><td>SLBZ2837</td><td>1 חודשים;</td>,</tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific, ארה"ב</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>KoAc</td><td>Sangon Biotech, סין</td><td>127-08-02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific, ארה"ב</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>AM9530G</td><td>1 M</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td>5 חודשים&nbsp;</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>אמרסקו, ארה"ב</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM בינוני</td><td>Gibco, ארה"ב</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, ארה"ב</td><td>10010023</td> מעכב <td>PH 7.4</td></tr><tr><td>RNase</td><td>Promega, ארה"ב</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin אלקליין פוספטאז</td><td>Promega, ארה"ב</td><td>V5591</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>מאגר Tris-HCI&nbsp;</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>15567027</td><td>1 מ', PH 7.4</td></tr><tr><td>Tris-HCI Buffer&nbsp;</td><td>Invitrogen, ארה"ב</td><td>15568025</td><td>1 M, PH 8.0</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, סין</td><td>A600560</td><td></td></tr></tbody></table>

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה לשחק תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים כגון תמלול, שילוב מחדש, ו-RNA חילוף החומרים. שיטות נסיוניות ללמוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצות דורשות שימוש בתגי פלורסנט, איזוטופים רדיואקטיביים, או תוויות אחרות כדי לזהות ולנתח מולקולות היעד הספציפי. Biotin, שאינה רדיואקטיבית חומצת גרעין התווית, משמש בדרך כלל בתנועה חשמלית אלקטרופואורית משמרת (EMSA) אבל לא היה מועסק באופן סדיר כדי לפקח על פעילות החלבון במהלך תהליכי חומצות גרעין. פרוטוקול זה ממחיש את כלי השירות של ביוטין תיוג במהלך התגובות אנזימטיות מבחנה, הוכחת כי תווית זו פועלת היטב עם מגוון של ביוכימיים שונים. באופן ספציפי, ביישור עם ממצאים קודמים באמצעות רדיואיזוטופ 32P-התווית מצעים, הוא אישר באמצעות biotin מתויג emsa כי meiob (חלבון מעורב במיוחד בשילוב meiob) הוא חלבון מחייב DNA, כי MOV10 (מ RNA הליקאז) פותר את מבני ה-RNA המסומנים בביוטין, והוא משאיר את התווית ביוטין. מחקר זה מדגים כי ביוטין מסוגל להחליף 32P ב שונים חומצות גרעין הקשורות ביוכימיה ביוכימית הקשורים בתחום החוץ.

מבנה החלבון של MEIOB ובניית הביטויים המשמשים במחקר זה מומחשים באיור 1א. OB קפלים ב MEIOB הם קומפקטי כמו חבית מבנים שיכולים לזהות ולתקשר עם אחד תקוע חומצות גרעין. אחד מתחומי OB (aa 136-307, לבנות A) נקשר DNA אחד תקוע (ssDNA), החלבון נחתך (aa 136-178 הגישות, לבנות C) ואת הטופס מוטציה הנקודה (R235A מוטציה, לבנות E) של MEIOB אין הפעילות איגוד ה-DNA26. החלבונים של הפיוז GT-MEIOB הביעו מוגזם בחיידקים BL21, עם שלבי הבידוד הבאים וכתוצאה מכך חלבונים מטוהרים המ...

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור ביוכימית מחוץ למבחנה המשתמשת בתוויות ביוטין שעשוי להיות מתאים באופן נרחב עבור לימוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה.

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

פרוטוקול זה מציע פלטפורמה עם תווית ביוטין לחקר אינטראקציות חומצת גרעין החלבון המוכיחה עצמה כחזקה, אמינה, יעילה ובמחיר סביר. אותה אצווה של חומצות גרעין שכותרתו ביוטין ניתן להשתמש על פני תקופה ארוכה של זמן, שמירה על שכפול של ניסויים. לבסוף, כל בדיקות ביוטין שכותרתו המתוארות כאן יכול להתבצע בתוך יום ולא דורשים ציוד מיוחד.הפגנת ההליך תהיה לינה יו, תואר שני מהמעבדה שלנו. הכינו מבנים MEIOB ו- MOV10, והפכו אותם לחיידקים המתאימים. כדי לחלץ MEIOB, גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה ו resuspend אותם 20 מיליליטר של קרח קר פוספט של דולבקו אגף מלוחים, או DPBS, חוצץ.Sonicate ההשעיה חיידקית על קרח. לאחר מכן, צנטריפוגה lysate ב 12, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, ולהעביר את supernatant לצינור טרי. טרום שטיפה חרוזים גלוטתיון-Sepharose, ולהדגיר אותם עם ליזאט בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים.צנטריפוגה את התערובת ב 750 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת כדי גלולה את חרוזים. לשטוף את חרוזים עם 10 מיליליטר של PBS קר כקרח שמונה פעמים. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ אלוטיון, דגירה חרוזים בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, וללטף את חרוזים באמצעות צנטריפוגה.חזור על האלוטיון שש פעמים, ובריכה יחד את ששת השברים. מעבירים את החלבונים האלמותיים למסנן צנטריפוגלי, ומתרכזים בצנטריפוגה פי 7, 500 גרם לנפח סופי של 100 עד 200 מיקרוליטר. כדי לחלץ MOV10, לבטא את החלבון בתאי HEK293T ו גלולה התאים על פי הוראות כתב היד.תן את גלולה בשלושה מיליליטר של חיץ תות תא עם קוקטייל מעכב פרוטאז מלא ללא EDTA, ודגירה במשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, צנטריפוגה ליט בארבע מעלות צלזיוס. הכינו חרוזים מגנטיים נגד דגל על ידי שטיפתם פעמיים עם חיץ K150.לאחר הכביסה, תוכלו למפות את חרוזים במיליליטר אחד של חיץ K150 קר כקרח ולהדגור אותם במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין. לאסוף את חרוזים על מגנט, ולהסיר את supernatant. מוסיפים את חרוזים לתא lysate, ו דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים.לשטוף את חרוזים עם חיץ K150 על פי הוראות כתב היד, ו resuspend את חרוזים 300 microliters של חיץ אלוטיון דגל. מניחים את חרוזים על מגנט, לאסוף את supernatant עם חלבוני MOV10, ולקבוע את ריכוז החלבון. הכן את אוליגונוקלאוטידים RNA על ידי דילול כל אוליגו ל 20 micromolar ו annealing אותם כדי ליצור דופלקסים RNA על פי הוראות כתב היד.עבור מוצ"ש שינוי הניידות האלקטרופורטי של MEIOB, או EMSA, מערבבים את ריאגנטים בהתאם לכיווני כתב היד. מוסיפים מים לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטרים. הדגירה את התגובה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, ולאחר מכן להוסיף חיץ עצירה 5x.לצורך בדיקה של פעילות הליקס MOV10, מערבבים את ריאגנטים על פי הוראות כתב היד ומוסיפים מים לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטרים. הדגירה את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, 30 דקות, ו 60 דקות, ולאחר מכן להוסיף חיץ עצירה 5x כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, הכינו ג'ל פוליאקרילמיד מקורי של 20%, והעמיסו 20 עד 25 מיקרוליטרים של כל דגימה לתוך כל באר.הפעל את הג'ל ב 100 וולט על אמבט קרח עד הסמן הכחול bromophenol עבר לרבע התחתון של הג'ל. אקרילאמיד מזיק ורעיל. חשוב לטפל בו עם ציוד מגן אישי מתאים.לפרק את צלחות הג'ל, לקצץ את הג'ל על ידי הסרת בארות טעינה נתיבים שאינם שימוש. מניחים את הג'ל במאגר TBE 0.5x. חותכים נייר סינון וממברנה ניילון לגודל של הג'ל, מראש להרטיב את הנייר ואת הממברנה, ולהרכיב את הערימה להעברה.מעבירים את הדגימות מהג'ל לממברנה במנגנונים אלקטרופורטיים יבשים למחצה ב-90 מיליאמפר למשך 20 דקות. לאחר מכן, לחצות את הדגימות על ידי הקרנת הממברנה ב 120 מיליליטר סנטימטר בריבוע במשך 45 עד 60 שניות. לגילוי chemiluminescence, להתחיל על ידי הוספת 20 מיליליטר של חיץ חסימה לממברנה דגירה זה במשך 15 עד 30 דקות תוך רעידות בעדינות.הסר בזהירות את מאגר החסימה והחלף אותו במאגר תאוב/חסימה. דגירה הממברנה שוב במשך 15 דקות. לשטוף את הממברנה ארבע פעמים תוך כדי רעידות במשך חמש דקות לכל לשטוף.לאחר מכן, מוסיפים 30 מיליליטר של חיץ שיווי משקל מצע לממברנה, ו דגירה אותו במשך חמש דקות תוך רועד ב 20 עד 25 סל"ד. מכסים את כל פני השטח של הממברנה בתת פתרון עבודה מצע, ו דגירה במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, סרוק את הממברנה במערכת הדמיה כימלומינסנטית למשך דקה עד שלוש שניות.טיהור של חלבוני MEIOB A, C ו- E ניתן לאמת עם כתמים כחולים קומאסי וניתוח כתם מערבי. החצים האדומים מציינים את מיקומם של חלבוני MEIOB המטוהרים. אינטראקציות של MEIOB ו- DNA חד-גדילי ניתן לדמיין באמצעות EMSA.כריכה תלוית ריכוז ומחשוף נצפו. כצפוי, רק MEIOB-A מסוג פראי אינטראקציה עם ה-DNA בעוד המוטנט MEIOB-E ו MEIOB-C לא. אינטראקציות של MEIOB ו- RNA חד-תקע ניתן גם לצפות.MEIOB מסוג פראי מראה פעילות מחייבת ואקסונוקלאז תלוית ריכוז ב- RNA חד-תקע. עם זאת, השוואה כמותית מראה כי MEIOB קושר DNA ביעילות גבוהה יותר מאשר RNA. טיהור של MOV10 אומת עם כתמים כחולים קומאסי, ופעילות ההליקאז של החלבון נמדדה בדופלקס RNA עם אוברהאנג של חמישה ראשים.ככל שזמן התגובה עולה, MOV10 מהשתחרר בהדרגה מה-RNA הדו-גדילי. כדי להפחית את עלות ההתמדה, זיהוי chemiluminescence יכול להתבצע עם דילול כפול של רייגנטים ערכת זיהוי או עם reagents תוצרת עצמית. הפרוטוקול המתואר כאן השתמש בהצלחה בחומצות גרעין המסומנים ביוטין כמצעים עבור מיסיונים ביוכימיים במבחנה כגון EMSA ולתגובות אנזימטיות שבהן ביוטין לא היה נפוץ.

in-vitro-biochemical-assays-using-biotin-labels-to-study-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו...

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

סרטון זה מדגים טכניקה המשתמשת בפפטידים חודרי תאים ביוטינילציה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון תוך-תאי. הפפטידים חודרי התא מאפשרים לפפטיד המצומד להיכנס לתא ולהיקשר באופן ספציפי לחלבונים המקיימים אינטראקציה איתו. הביוטין, לאחר קשירה לאבידין, מאפשר טיהור של קומפלקס החלבונים המקיימים אינטראקציה מליזט התא.

בדיקת פפטיד חודר תאים ביוטינילציה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון

בסרטון זה, אנו מדגימים את ההליך לקביעת פעילות הליקייס של חלבון מטרה כדי לשחרר את מצע dsRNA המסומן בביוטין. פעילות האנזים זוהתה על ידי ניתוח שינוי הניידות האלקטרופורטית, ואחריו בדיקת כימילומינסנציה באמצעות סטרפטווידין מצומד אנזים כימילומינסנטי.

מדידת פעילות מנחת מסוקים של חלבון מטרה באמצעות דופלקסים RNA המסומנים בביוטין

פיתחנו assay כמותיים-DNA מחייבת, המבוסס על ELISA למדוד אינטראקציות עם גורם שעתוק ה-DNA. סגוליות גבוהה לחלבון Runx2 הושג עם oligonucleotide DNA לזיהוי קונסנסוס ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים. איתור Colorimetric עם תגובת מצע נוגדנים בשילוב אנזים היה פיקוח בזמן אמת.

כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.

Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

זהו פרוטוקול ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים המבוסס על מערכת נפתחים ביוטין-אבידין עם החידוש של שילוב רצפים חודר לתא. היתרון העיקרי הוא הרצף היעד מודגרת עם תאים חיים במקום תא lysates, ולכן האינטראקציות תתרחש בתוך ההקשר הסלולר.

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר אינטראקציות דנ"א-חלבון באמצעות מערכת אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין (BLI). הוא מתאר את השלבים והשיקולים החיוניים לשימוש בקינטיקה מחייבת בסיסית או מתקדמת כדי לקבוע את זיקת קשירת שיווי המשקל (KD) של האינטראקציה.

ניתוח אינטראקציות DNA-חלבון עם אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין

הפרוטוקול מציג שיטה להצמדה קוולנטית in vivo של ביוטין לחלבונים על סמך קרבתם לביוטין ליגאז המותך לחלבון מעניין. שינוי זה מאפשר העשרה סלקטיבית של החלבונים באמצעות חרוזי סטרפטווידין לפי הצורך במחקרי אינטראקציה עם חלבונים.

ב Vivo ביוטינילציה של קרבה למחקרי אינטראקציה בין חלבונים ב-Paramecium tetraurelia

למדו שיטת תיוג ביוטין לחקירת אינטראקציות חלבון-חומצת גרעין בתוך מבחנה. הפרוטוקול מאפשר ניסויים אמינים וחוזרים לאורך זמן ללא ציוד מיוחד.

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

גלה סרטונים נוספים