Name: בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: למדו שיטה לכימות אנגיוגנזה בגידולים באמצעות זנברפיש טרנסגני עם כלי דם פלואורסצנטיים. מודל זה מאפשר מדידה מדויקת של השפעת תרופות נוגדות אנגיוגנזה במחקר סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למר אליש מאהגאונקאר לניהול מתקן הבית של אוניברסיטת אוקלנד והיחידה לחקר הדמיה ביו-רפואית, ביה ס למדעי הרפואה, אוניברסיטת אוקלנד, לסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית. עבודה זו נתמכת על ידי מועצת מחקר הבריאות של ניו זילנד מענק הפרויקט (14/105), החברה המלכותית של ניו זילנד מרסדן קרן מUOA1602 פרויקט מענק () ו אוקלנד מחקר רפואי קרן פרויקט גרנט (1116012) הוענק J.W.A.

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sunitinib+acts+primarily+on+tumor+endothelium+rather+than+tumor+cells+to+inhibit+the+growth+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma.</a> Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRibatti%2C+D+%22Tumor+Angiogenesis+Assays%22">Tumor Angiogenesis Assays</a>. , 1st. edn, Humana Press. (2016).</li>
<li>Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+tumor+xenografts+induce+neovascularization+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos.</a> Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).</li>
<li>Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+vector+system+for+tissue-specific+gene+disruption+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish.</a> Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).</li>
<li>Astin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vegfd+can+compensate+for+loss+of+Vegfc+in+zebrafish+facial+lymphatic+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting.</a> Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).</li>
<li>Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barbigerone+inhibits+tumor+angiogenesis%2C+growth+and+metastasis+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+Journal+of+Cancer+Prevention%22%5BJournal%5D)">Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKLB1002%2C+a+novel+potent+inhibitor+of+VEGF+receptor+2+signaling%2C+inhibits+angiogenesis+and+tumor+growth+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).</li>
<li>Muthukumarasamy, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+noreremophilane-based+inhibitors+of+angiogenesis+using+zebrafish+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).</li>
<li>Britto, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+enhance+Vegfa-driven+angiogenesis+in+an+embryonic+zebrafish+tumor+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).</li>
<li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish%2Ftumor+xenograft+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li>
<li>Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NXT2+is+required+for+embryonic+heart+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 5, 7(2005).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNusslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Fior, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+functional+and+chemosensitive+profiling+of+combinatorial+colorectal+therapy+in+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).</li>
<li>Eng, T. C. Y., Astin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Zebrafish+Facial+Lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics.</a> Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+xenograft+model+in+zebrafish+for+high-resolution+investigating+dynamics+of+neovascularization+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors.</a> PloS One. 6 (7), e21768(2011).</li>
<li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRN951%2C+a+highly+potent+inhibitor+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+tyrosine+kinases%2C+has+antitumor+activities+and+affects+functional+vascular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties.</a> Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).</li>
<li>Okuda, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+model+of+inflammatory+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis.</a> Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).</li>
<li>Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+architecture+of+human+xenotransplanted+tumors%3A+histological%2C+morphometrical%2C+and+ultrastructural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).</li>
<li>Vermeulen, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvessel+quantification+in+primary+colorectal+carcinoma%3A+an+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study.</a> British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).</li>
<li>Heilmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+System+for+Studying+Metastasis+Using+Transparent+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish.</a> Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).</li>
<li>Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Zebrafish+to+Identify+Anti-%28Lymph%29Angiogenic+Compounds+for+Cancer+Treatment%3A+Promise+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges.</a> Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cords+Promote+Tumor+Initial+Growth+prior+to+Vascular+Function+through+a+Paracrine+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism.</a> Scientific Reports. 6, 19404(2016).</li>
<li>Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+normalization+as+a+therapeutic+strategy+for+malignant+and+nonmalignant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486(2012).</li>
<li>Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+vascular+networks+in+zebrafish%3A+an+introduction+to+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography.</a> Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הצעד הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא השרשה של תאי הגידול. חיוני כי התאים מוזרק לתוך מיקום שיאפשר מבע להשתיל בהצלחה העובר מבלי להפוך את העובר מתרפס. זריקה הקדמי מדי יכול לאפשר לתאים לנוע לעבר הלב, חסימת הדם והמוביל בצקת, בעוד הזרקה כי הוא האחורי יותר מדי יגרום מושתל לקוי xenograft. הזרקה קדמית היא הטובה ביותר להימנע על ידי החדרת המחט דרך שק החלמון בכיוון הקדמי לכיוון אחורי, כך שהוא מצביע הרחק מהלב כפי שהוא מזריק. הזרקה האחורי היא הטובה ביותר להימנע על ידי הזרקת התאים במיקום במחצית הקדמית של החלק העגול של שק החלמון. בנוסף, התא...

אנגיוגנזה הוא אחד הסימנים הקלאסיים של סרטן ומייצג יעד של טיפול נגד סרטן1,2. כדי ללמוד את התהליך הזה, xהשתלת מודלים של סרטן נוצרו על ידי השתלת תאים סרטניים היונקים לתוך בעלי חיים כגון עכברים3. מודל דג זברה מבע יש גם פיתח, אשר כרוך ההשתלה של תאים סרטניים לתוך 2 ימים הפריה לאחר (dpi) דג זברה אשר התוצאה צמיחה מהירה של כלי דם דג זברה לתוך השתל מבע.
פרוטוקול זה מתאר vivo דג זברה העובר גידול מודל מבע שבו התגובה אנגיוגנטית ניתן לכמת במדויק על פני השתל כולו מבע שיטה זו מאפשרת לחוקר לבחון, בvivo, את המנגנונים המולקולריים הממפינים את תגובת הגידול האנטי-אנגיוגנטית. היכולת הגנטית של דג דג זברה מאפשר את התרומה המארחת להיחקר, בעוד הבחירה של קווי הגידול השונים תאים מאפשר את תרומת הגידול לאנגיוגנזה גם להיבדק5,6,7. בנוסף, כמו הזחלים דג זברה חדירות מולקולות קטנות, מעכבי מסלול ספציפי ניתן להשתמש או ספריות התרופות ניתן להקרנה כדי לזהות מעכבי הרומן של אנגיוגנזה הגידול8,9,10, . בסדר, 11
מודל העובר של הדג מציג יתרונות ייחודיים בהשוואה למודלים אחרים של היונקים האחרים. Zebrafish xשתלים הם זולים יותר לבצע, מספר גדול של בעלי חיים ניתן לבחון לחיות הדמיה תא מאפשר בדיקה מפורטת של התנהגות התא4. שלא כמו אחרים vivo מודלים, אשר דורשים עד כמה שבועות כדי להתבונן צמיחה כלי משמעותי, אנגיוגנזה ב-דג זברה xenografts ניתן לראות בתוך 24 h בעקבות השרשה3,4. עם זאת, העדר מערכת חיסונית אדפטיבית מתחלקים, בעוד מועיל לשמור על השתל xenograft פירושו התגובה החיסונית אדפטיבית ותרומתו כלפי אנגיוגנזה הגידול לא ניתן לבחון. בנוסף, העדר של תאים סטרומה הגידול, חוסר היכולת להשתיל למריחה על הגידול ואת ההבדל בטמפרטורת התחזוקה בין התאים המרכיניים ותאי היונקים הם חולשות פוטנציאליות של שיטה זו. למרות זאת, היכולת המועלת של מודל זה להדמיה חיה והיכולת לכמת באופן מדויק את תגובת האנגיוגנטית הופכת אותו למועיל בצורה ייחודית ללימוד התהליכים הסלולאריים המייוסתים את האנגיוגנזה של הגידול בvivo.

<table><tbody><tr><td>צילינדר אוויר</td><td>BOC</td><td>011G</td><td>Xenotransplantation</td></tr><tr><td>תאי B16-F1</td><td>ATCC</td><td></td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>BD Matrigel נטול LDEV (תערובת מטריצה חוץ-תאית)</td> <td>Corning</td><td>356235</td><td>Xenotransplantation</td></tr><tr><td>נימי זכוכית Borosillicate</td><td>Warner Instruments</td><td>G100T-4</td><td>OD = 1.00 מ"מ, ID = 0.78 מ"מ, אורך = 10 ס"מ תא הזרקת תאים</td></tr><tr><td> צלחת תרבית בקוטר 35 מ"מ</td><td>Thermofisher NZ</td><td>NUN153066</td><td>גידול דגים</td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CLS430167-500EA</td><td>גידול דגים</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים 75 ס"מ2</td><td>In Vitro Technologies</td><td>COR430641</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>CellTracker ירוק</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td>תיוג תאים, ריכוז מלאי (10 מ"מ ב-DMSO), ריכוז עבודה (0.2 &mu; M במדיה נטולת סרום)</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' D8418</td><td>טיפול תרופתי, תיוג תאים</td></tr><tr><td>E3 מדיה (60x ב-2 ליטר מים) 34.8 גרם NaCl 1.6 גרם KCl 5.8 גרם CaCl2&middot; 2H2O 9.78 גרם MgCl2&middot; 6H2O מסתגל ל-pH 7.2 עם NaOH</td><td>בבית [1]</td><td></td><td>גידול דגים</td></tr><tr><td>אתיל-3-אמינובנזואט מתאן סולפונאט (טריקאין)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Xenotransplantation,</td></tr><tr><td>קצה מסנן הדמיה 1,000 &mu; L</td><td>VWR</td><td>732-1491</td><td>משמש במהלך מספר שלבים</td></tr><tr><td>קצה מסנן 200 &mu; L</td><td>VWR</td><td>732-1489</td><td>משמש במהלך מספר שלבים</td></tr><tr><td>קצה מסנן 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>732-1487</td><td>משמש במהלך מספר שלבים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>הכנת עוברים</td></tr><tr><td>FBS (ממקור NZ)</td> כפפות <td>תרבית תאים</td>של <td>Thermofisher Scientific</td><td>10091148</td></tr><tr><td></td><td>כל מותג</td><td></td> מסחרי <td>בשימוש במהלך מספר שלבים</td></tr><tr><td>תא ספירת תאים המוציטומטר משופר Neubauer</td><td>HawksleyVet</td><td>AC1000</td><td>Xenotransplantation</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R צנטריפוגה</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>75004500</td><td>תרבית תאים, תיוג תאים</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>62249</td><td>תיוג תאים, ריכוז מלאי (1 מ"ג/מ"ל ב-DMSO), ריכוז עבודה (6 &mu; גרם/מ"ל במדיה נטולת סרום)</td></tr><tr><td>נקודת התכה נמוכה, UltraPure Agarose</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>16520050</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>מתיצלולוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>9004 67 5</td><td>Xenotransplantation</td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M9140</td><td>גידול דגים</td></tr><tr><td>Microloader 0.5-20 &mu; L קצה פיפטה להעמסת מיקרו-נימים</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Xenotransplantation</td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td>כל מותג</td><td></td> מסחרי <td>בשימוש במהלך מספר שלבים</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה P 87</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Xenotransplantation</td></tr><tr><td>חממת כלוב מיקרוסקופ</td><td>Okolab</td><td></td><td>הדמיית זמן-lapse</td></tr><tr><td>מיקרוגל</td><td>כל מותג מסחרי</td><td></td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3516</td><td>Xenotransplantation</td></tr><tr><td>מדיה חיונית מינימלית (MEM) - אלפא</td><td>תרמופישר Scientfic</td><td>12561056</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>MPPI-2 מזרק לחץ מכשור</td><td>מדעי יישומי Xenotransplantation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narishige micromanipulator</td><td>Narishige Group</td><td></td><td>Xenotransplantation</td></tr><tr><td>Nikon D Eclipse C1 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>גידול דגים</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>S1 מילוי פיפט</td><td>Thermoscientific</td><td>9501</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פס סרולוגי 10 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>4488</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פס סרולוגי 25 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>4489</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פס סרולוגי 5 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>4485</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פס סרולוגי 2 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>4486</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>מחט טרומו 22 גרם</td><td>אמטק</td><td>SH 182</td><td>גידול דגים</td></tr><tr><td>חממת תרבית רקמות</td><td>Thermofisher Scientfic</td><td>HeraCell 150i</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>Tivozanib (AV951)</td><td>AVEO Pharmaceuticals</td><td></td><td>טיפול תרופתי</td></tr><tr><td>העברת פיפטה 3 מ"ל</td><td>Mediray</td><td>RL200C</td><td>גידול דגים</td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies</td><td>T4049</td><td>תרבית</td></tr><tr><td>תאים פינצטה</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11295-10</td> תוכנת Volocity <td>לגידול דגים</td></tr><tr><td>(v6.3)</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td></td><td>ניתוח תמונות</td></tr></tbody></table>

בvivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-zebrafish גידול xenografts

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

אנגיוגנזה הגידול הוא יעד מפתח של טיפול נגד סרטן ושיטה זו פותחה כדי לספק מודל חדש כדי ללמוד את התהליך הזה vivo. דג זברה מבע נוצר על ידי שתילת תאים סרטניים מהיונקים לתוך החלל perivitelline של יומיים-לאחר הפריה דג זברה עוברים, ואחריו על ידי מדידת היקף התגובה אנגיוגנטית נצפתה בנקודת הקצה ניסיוני עד יומיים אחרי ההשתלה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לכמת במדויק את התגובה אנגיוגנטית מארח של דג את השתל. הדבר מאפשר בדיקה מפורטת של המנגנונים המולקולריים, כמו גם את התרומה המארחת לעומת הגידול לתגובה האנגיוגנטית. העוברים יכולים להיות חשופים למגוון טיפולים, כגון דגירה עם תרופות אנטי-אנגיוגנזה פוטנציאליות, כדי לחקור אסטרטגיות למניעת אנגיוגנזה של הגידול. תגובת האנגיוגנטית יכולה להיות גם בעלת התמונה החיה כדי לבחון תהליכים סלולאריים יותר דינמיים. הטכניקה הניסיונית יחסית בלתי תובענית, עלויות תחזוקה זולות של דג דג זברה וזמן ניסיוני קצר להפוך את המודל הזה שימושי במיוחד לפיתוח אסטרטגיות לתמרן אנגיוגנזה הגידול.

על-ידי הדמיה של השתלת מניות בודדות ב-6, 24 ו-48 hpi, ניתן לחשב את תגובת האנגיוגנטי בנקודות זמן שונות כמוצג באיור 1A-C. התגובה הגדולה ביותר של אנגיוגנטי נצפתה בין 24-48 h השתלת פוסט, עם רמות מקסימלית של השתל vascularization לראות סביב 2 dpi (איור 1A-C). סרט הזמן לפקיעה של תגובת אנגיוגנטית טיפוסית B16-F1 מבע שתל מ 20.75 hpi עד 46 hpi הוא נראה בסרט המשלים 1. הסרט הזה נוצר על ידי הדמ...

מטרת שיטה זו היא ליצור מודל vivo של אנגיוגנזה הגידול על ידי תאי גידול של השתלת מיונקים לתוך העובר הזרע כי יש מתויג כלים של כלי דם. על ידי הדמיה של השתל מבע כלים משויכים, מדידה כמותית של תגובת האנגיוגנטית ניתן להשיג.

בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד זחלי זברה מהודרים יכולים לשמש כדי לספק התזה כמותית של vivo של כלי דם קסנוגרפט הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קודמות הוא שהיא מאפשרת לחוקר לכמת במדויק שינויים ברמות של כלי דם קסנוגרפט. הצעד העיקרי הוא להבטיח כי התאים הגידול מוזרקים כראוי לתוך זחלים זברה, כך הדמיה לאחר מכן צעדים כימות אינם בסכנה.לאחר גידול ותיוג תאי B16-F1 עם צבע פלואורסצנטי, התחל להכין עוברים להשתלה. מלאו מנה של 35 מ"מ בתת פתרון 2%methylcellulose ב-E3 לרבע מנפח המנה. באמצעות פיפטה העברה, למקם כ 50 עוברים מהוכנו בעבר על methylcellulose תוך מזעור נפח פתרון E3 הועבר.בעזרת קצה פיפטה מיקרו-אפילרי, מסדרים את העוברים כך שכולם מכוונים אנכית עם ראשיהם למעלה, זנבות לתחתית, ועובר עם צד שמאל למעלה. הוסף 50%ECM לכדור תא B16-F1 שהוכן בעבר כדי לייצר תערובת של תאים ל- ECM ביחס של שניים לאחד. מערבבים היטב על ידי צינורות ומערבבים, ולאחסן את התערובת על קרח.השתמש פיפטה microcapillary לקחת עד שלושה עד 10 microliters של תאים. בזהירות להכניס את קצה פיפטה לתוך מחט microinjection שהוכן בעבר, ולאחר מכן להוציא את תערובת מטריצת B16-F1 לתוך סוף המחט. הכנס את המחט למחזיק המחט, והטה בזווית של 45 מעלות לצלחת.השתמש פינצטה כדי לשבור את קצה המחט כדי להפוך חור גדול מספיק עבור התאים להיפלט מן המחט מבלי לסחוט את התאים. הפעל את גליל האוויר בלחץ המחובר למנגנוני ההזרקה, ולאחר מכן הפעל לרגע את המזרק במצב רציף למשך לא יותר משנייה אחת כדי לדחוף את התאים לקצה המחט. כוון את המחט לכיוון שאק החלמון של העובר, ודחוף אותה דרך שאק החלמון לכיוון הגחוני עד שטיפ המחט יצא משק החלמון ודוחף את האפידרמיס העוברי בצד הגחוני של העובר, רק אחורי ללב.בזהירות ומעט לדחוף את קצה המחט קדימה עד שהוא יצר רווח קטן בין האפידרמיס ואת קרום החלמון. פולסים את המזרק כדי להוציא חלק מתערובת התאים לחלל הצפק הזה. בזהירות להסתכל על הגודל, הצורה, ואת המיקום של xenograft כפי שהוא מושתל, ולהתאים את מספר הדופק ואת המיקום של המחט בהתאם כדי להבטיח xenograft מושתל כראוי.חזור על הפולסים עד 500 עד 800 תאים הוזרקו לתוך החלל perivitelline, יצירת בליטה גלויה המשתרעת לפחות מחצית הדרך לאורך החלק התחתון של שקי החלמון. הסר את המחט מהעובר. לאחר הזרקת כל העוברים, השתמש קצה פיפטה microcapillary לדחוף את כל העוברים יחד, כך שהם יכולים להיות pipetted החוצה עם כמה שפחות methylcellulose ככל האפשר.מעבירים את העוברים לצלחת התאוששות המכילה E3 עם PTU וכחול מתילן. ואז בעדינות פיפטה E3 סביב העוברים לשטוף אותם, ולאחר מכן דגירה ב 34 מעלות צלזיוס. ואז תמונה עוברים הרדמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל.השתמש בערוץ לייזר המתאים לתאי הגידול כדי לקבוע נפח להדמיה, המאפשר לפחות חלק אופטי אחד או שניים משני צדי השתל. השתמש במרווחי מקטעים שהם בערך חמישה מיקרומטרים זה מזה כדי ליצור מחסנית Z. השתמש בהדמיה דו-ערוצית כדי לדמיין הן את כלי הדם והן את קסנוגרפט הגידול.תמונה קסנוגרפט הגידול וכלי הדם עבור זחל אחד, ולחזור על צעדים אלה עבור כל זחל להיות בתמונה. כדי להתחיל עם כימות של התגובה האנגיוגנית xenograft זברה, העברה שנוצרה בעבר Z מחסנית confocal קבצי תמונה של קסנוגרפט גידול לתיקיה חדשה על תוכנת ניתוח תמונה 3D. כדי ליצור את פרוטוקול נפח הגידול למדידת נפח xenograft הגידול, עבור אל הכרטיסיה מדידה בתפריט העליון של החלון ולאחר מכן מרשימת הפרוטוקולים המופיעים גרור את הפרוטוקול בשם חפש אובייקטים לחלל שכותרתו גרור משימות כאן כדי לבצע מדידות.לאחר שתוודא שפרוטוקול זה מוגדר למדידת אובייקטים בערוץ הגידול, גרור את הפרוטוקולים הנקראים גזור להדרה (ROIs) והפוך את ההשקעה מהאוכלוסייה לרשימת הפרוטוקולים למרחב גרור משימות כאן כדי לבצע מדידות, וודא ששני פקודות אלה חלות על האובייקטים שזוהו על-ידי חיפוש אובייקטים. לפני כיול ההגדרות של פרוטוקול זה, עבור לתפריט הנפתח שמעל לתווית Mode בחלק הימני העליון של החלון ובחר בתצוגת מיקוד מורחב. בטל את הבחירה בערוצים שאינם גידולים בחלונית בצד ימין על ידי לחיצה על העיגול השחור מתחת לכל כותרת ערוץ, כך שניתן יהיה לראות רק את ערוץ הגידול.לאחר מכן השתמש בכלי Freehand בחלק העליון של החלון כדי לצייר אזור עניין, או ROI, סביב כל נפח הגידול. בחלונית שמתחת לתמונה, בחרו בתווית Summary ולאחר מכן קבעו את האפשרות 'תצוגה' להצגת אוכלוסיה 2. כדי לכייל, במשימה חיפוש אובייקטים, לחץ על כוכבית כדי לפתוח את חלון ההגדרות.התאימו את הסף בעוצמה, וקבעו את הסף התחתון עד שרק תאי הגידול ייבחרו ולא פלואורסצנטיות הרקע. קבע את גודל האובייקט המינימלי כך שרק תאים שלמים יימדדו, בניגוד לפריטים קטנים יותר של פסולת תאים, על-ידי הגדרת גודל האובייקט המינימלי כ- 100 מיקרומטר מעוקב. שמור פרוטוקול זה כאמצעי אחסון לגידולים על-ידי לחיצה על הכרטיסיה מדידות בתפריט העליון ולחיצה על שמור פרוטוקול.השתמש באותן הגדרות למדידת כל xenografts. כדי למדוד את עוצמת הקול של כלי הדם הקשורים xenograft, ליצור פרוטוקול חדש על ידי הולך לתפריט העליון ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסייה מדידות ולאחר מכן נקה פרוטוקול. גרור את המשימות חפש אובייקטים וגזור ל- ROIs לתוך השטח שכותרתו גרור משימות לכאן כדי לבצע מדידות עבור פרוטוקול זה.ודא שהפקודה הראשונה מוגדרת למדידת עצמים בערוץ כלי הדם ושפקודתה הבאה מוגדרת להחיל על האובייקטים שזוהו על-ידי הפקודה הראשונה. לאחר מכן בטלו את הבחירה בת ערוצי כלי השיט בחלונית השמאלית הקיצונית, כך שניתן יהיה לראות רק את כלי הדם. קבע את ההגדרות עבור פרוטוקול אמצעי האחסון של כלי הדם באופן דומה לפרוטוקול נפח הגידול שתואר קודם לכן, ושמור פרוטוקול זה כאמצעי אחסון לכלי קיבול.לנקות את הפרוטוקול, ולצייר ROI סביב xenograft, דואג לא לכלול כל שפעת אוטומטית שאינה גידול. כדי למדוד את עוצמת הקול של האובייקטים בערוץ הגידול בתוך ROI זה, לחץ על הכרטיסיה מדידות, בחר בפקודה שחזר פרוטוקול, בחר בפרוטוקול אמצעי אחסון של גידול ולחץ על שחזר. באמצעות ערך ההשקעה החדש שבוצע על-ידי פרוטוקול נפח הגידול, לחץ על הכרטיסיה מדידות ובחר בפקודה שחזר פרוטוקול, בחר בפרוטוקול אמצעי אחסון של כלי קיבול ולחץ על שורת הסכום כדי לחשב את הנפח הכולל של אובייקטים בערוץ כלי הדם בתוך ערך דיסק זה.לחלק את נפח הכלי על ידי נפח הגידול, ולהכפיל את התשובה על ידי 100 כדי לקבל ערך אחוז של כלי דם השתל. על ידי הדמיה של קסנוגרפט בודד בשש, 24 ו-48 שעות לאחר ההשתלה, ניתן לחשב את התגובה האנגיוגנית בנקודות זמן שונות, עם התגובה האנגיוגנית הגדולה ביותר בין 24 ל -48 שעות לאחר ההשתלה והרמות המרביות של כלי דם של שתלים שנראו בסביבות 48 שעות. הדמיה מוקדמת של קסנוגרפט B16-F1 שהושתל בעובר זברה-דג לאחר הפריה של יומיים מראה כלי דם בעלי תווית GFP הגדלים דרך קסנוגרפט, ויוצרים רשת מפותלת עם כלי גודל ומורפולוגיה לא סדירים האופייניים לרשת כלי הדם הלא תקינה שנראתה בגידולים של יונקים.Xenografts דגירה מעכבי VEGFR להראות הפחתת כלי גדול לעומת שליטה xenografts דגירה DMSO. בעוברים בקרה, הייתה רשת כלי דם רחבת ידיים המשתרעת על פני כל אזור קסנוגרפט, התגובה האנגיוגנית האופיינית שנצפתה לאחר השתלת תאי B16-F1. כאשר כימת, תגובה אנגיוגנית מראה ירידה ברורה כלי דם השתל ב xenografts מעכבי VEGFR מטופלים בהשוואה לפקדים.ערוץ הגידול מראה מסה של תאי B16-F1 המסווים באופן פלואורסצנטי מתחת לשאק החלמון, המציג שפעת אוטומטית. לכן, יש לצייר בזהירות את ההשקעה סביב xenograft, דואג לא לכלול את כל שפעת אוטומטית מן המקום חלמון. פרוטוקול נפח הגידול זיהה את כל תאי B16-F1 בהפרעה על ההשקעה, מדד את נפחם וקיצץ את ההשקעה בנפח שלהם.פרוטוקול נפח כלי הגידול בהפרעה על ההשקעה החדשה הזו איפשר זיהוי של כל הכלים הקשורים למסה של תאי B16-F1 ומדד את נפחם. הערכים מנפח הגידול ופרוטוקולים נפח כלי הגידול ניתן להשתמש כדי לתת מידה של כלי דם השתל. הכדאיות הגנטית והחלחלות של דגי זברה מאפשרות חקירה של מסלולי איתות גבוהים באנגיוגנזה של גידולים, והיא יכולה לשמש גם כפלטפורמת סינון לזיהוי תרכובות אנטי-אנגיוגניות.

in-vivo-imaging-quantitation-host-angiogenic-response-zebrafish-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר שיטת מיקרו-הזרקה להעברת תאי סרטן השד לחלל הפריביטלין של עוברי דגי זברה טרנסגניים. לאחר הדגירה, אנו מדמיינים את העובר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לצפות בפלישה של תאים סרטניים, הפצתם וגרורות.

zPDX-אנליזה של פולשניות: חקירת התנהגות פולשנית של תאי סרטן גרורתיים בעוברי זברה Xenografts

סרטון זה מתאר את בדיקת xenograft של דג הזברה כדי להעריך היווצרות גידול in vivo וללמוד את ההשפעה של חומרים טיפוליים.

Zebrafish Xenograft Assay: שיטה להערכת היעילות האנטי-סרטנית של טיפולים על גידולים בדגי זברה in vivo

בשיטה זו משתמשת עוברי דג זברה כדי לבדוק ביעילות את יכולת פולשני כלי הדם של תאים סרטניים. תאים סרטניים פלורסנט מוזרקים לתוך שק סינוס או חלמון precardiac של עוברים בפיתוח. פלישת תאים סרטניים כלי דם extravasation נבחנת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אזור הזנב 24 כדי 96 שעות מאוחר יותר.

בדיקת היכולת פולשנית דם של תאים סרטניים דג הזברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

כאן, אנו מתארים דגמים דג הזברה xenograft באמצעות שני אתרים הזרקה שונים, כלומר, חלל צינור perivitelline של קיביה, כדי לחקור את התנהגות פולשנית ולהעריך את הפוטנציאל intravasation ו extravasation של תאי סרטן שד אנושיים, בהתאמה.

התנהגות פולשנית של תאים סרטניים בשד אדם עוברי הזברה

השתלת תאי סרטן היא כלי חשוב לזיהוי מנגנוני סרטן ותגובות טיפוליות. הטכניקות הנוכחיות תלויים בבעלי חיים חסרי יכולת. כאן, אנו מתארים שיטה להשתלת תאים דג הזברה תאים לתוך עוברי המוסמכת-המוסמכת לניתוח לטווח ארוך של התנהגות התא הגידול בתגובות סמים vivo .

השתלת דג הזברה גידולים מוחיים במוח לתוך מארחים המוסמכת החיסונית עבור מחקר לטווח ארוך של התנהגות תאים סרטניים והתגובה לסמים

פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של המודל הנושא הגידול העכבר כדי לפקח על התקדמות הגידול ואנגיוגנזה בזמן אמת על ידי הדמיה ביולומינציה כפול.

הדמיה ביולומינסנציה כפולה של התקדמות הגידול ואנגיוגנזה

Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד, עם טיפים ליצירת קסנוגרפטים והנחיות לניתוח התנהגות הגידול, חיסוניות של כל ההר, וכימות הדמיה confocal.

דור של זברה דג זחל קסנוגרפטים וניתוח התנהגות הגידול

מודלים פרה-קליניים נועדו לקדם את הידע בביולוגיה של סרטן ולחזות את יעילות הטיפול. מאמר זה מתאר את הדור של xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם בחולה (zPDXs) עם שברי רקמת גידול. zPDXs טופלו בכימותרפיה, שהשפעתה הטיפולית הוערכה במונחים של אפופטוזיס תאי של הרקמה המושתלת.

הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה

אנו מתארים פרוטוקול להשתלת קסנו בחלמון של עוברי דגי זברה שקופים המותאם בשיטת היערכות פשוטה ומהירה. ניתוחים לאחר הזרקה כוללים הישרדות והערכת נטל המחלה של תאים מושתלים על ידי ציטומטריית זרימה.

שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה

למדו שיטה לכימות אנגיוגנזה בגידולים באמצעות זנברפיש טרנסגני עם כלי דם פלואורסצנטיים. מודל זה מאפשר מדידה מדויקת של השפעת תרופות נוגדות אנגיוגנזה במחקר סרטן.

בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts

גלה סרטונים נוספים