משולב תאים מניפולציה פלטפורמה ביחד עם יחיד-בדיקה עבור ניתוח ספקטרומטר המסה של תרופות מטבוליטים בתאים ההשעיה יחיד
June 21st, 2019
פלטפורמת מניפולציה משולבת תא מפותחת לשימוש בשילוב עם התקנה בודדת המסה בדיקה מאסיבית עבור ניתוח מקוון של תאים ההשעיה בודדים תחת תנאי הסביבה.
מכיוון ששיטה זו מנתחת תאים מהפתרון, ניתן להשתמש בהם כדי לחקור תאים בסביבה כמעט מקורית. זה כולל ניתוח של דגימות תאים שמקורן בחולה. טכניקה זו דורשת הכנה מועטה עד ללא מדגם של תאים.
לכן, אנו יכולים לנתח תאים בודדים באינטרנט בתנאי הסביבה, אשר מאפשר לנו לחקור הטרוגניות הסלולר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד ביופסיות נוזליות ממגוון מצבי מחלה שונים, שכן היא יכולה לנתח סוגים שונים של תאים מבודדים ישירות מדגימות המטופל. כדי להמיר צינורות זכוכית נשא יחיד לתוך גשוש מחודד עם קצה חד, במקום הראשון צינור זכוכית נשא אחד לתוך המהדקים של מחזיק פיפטה אנכי, מרכך את הזכוכית ביחס לסליל החימום ומהדק כדי לאבטח את הצינור במקום.
סליל החימום מורכב מחוט התנגדות כרום ניקל 18 מד סליל סביב מוט מתכת 2.5 פעמים. הגדר את צינורות הזכוכית עם תוכנית טמפרטורה 19.5. תן את הבוכנה סולנואידית לארבע.
הפעל את סולנואיד כדי למשוך את צינורות הזכוכית. שלב זה יוצר שתי בדיקות מותכות בקצה. השתמש בסוודרים כדי לחתוך כמילימטר אחד מהקצה של כל גשוש, יצירת פתח של כ 10 מיקרון קוטר בקצה החללית.
כדי לכופף את גשושית הזכוכית עבור צימוד קל ICMP, בדיקה אחת SCMS להגדיר. ראשית להגדיר גשוש זכוכית משך לתוך microforge. מקם את החלק העליון כשלושה מילימטרים מעל חוט החימום פלטינה.
לאחר מכן, הפעל את החום על חוט הפלטינה ל-30% מהטמפרטורה המרבית. לכופף את החללית כ 45 מעלות מהמיקום המקורי. מניחים את מיקרוסקופ מיקרוסקופ הפוך בשתי מערכות מניפולציה תאים על שולחן ממונע עבור צימוד קל עם ספקטרומטר המסה.
כדי להגדיר את התקן בחירת תא הזכוכית, הכנס את גשוש בחירת תאי הזכוכית לתוך מחזיק המתכת של המיקרו-מיינר על-ידי הצבת השקופית הארוכה במחזיק נימי והידוק הבורג כדי לאבטח את החללית במקום. מקם את קצות החללית בזווית מקבילה לצלחת המחוממת. לאבטח את מחזיק המתכת של מזרק מיקרו לתוך מערכת מניפולציה התא.
לאחר מכן מקם את קצה הגשוש ליד מרכז אור המיקרוסקופ ההפוך. אבטח את מגלשת הזכוכית המכילה את הגשוש הבודד לתוך מהדק הזרוע של מערכת מניפולציה התא. חבר את הממס המספק נימי לאיחוד מוליך על ידי הנחת נימי לתוך השרוול של ferrule פלסטיק אצבע הידוק ההתאמה.
חבר את הצד השני של האיחוד מוליך נימי אשר מחובר מזרק המכיל את ממס הדגימה על ידי הנחת נימי לתוך השרוול והידוק ההתאמה. השתמש אצטוניטריל עם 0.1% חומצה פורמית כמו ממס דגימה בניסויים אלה. אבטחו את המזרק במשאבת המזרק בספקטרומטר המסה.
מקם את היוניזציה nanoelectrospray או פולט ננו ESI כמילימטר אחד אל פתח צינור העברת היונים המורחבת. השתמש במערכת מניפולציה התא כדי לשלוט בתנועות spacial של בדיקה אחת ולמקם את פולט ננו ESI במרכז מול צינורות העברת היונים המורחבת. פיפטה התאים מבקבוק תרבות התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.
לסובב את התאים ב 400 פעמים G ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולהשליך את העל טבעי. תן שימוש חוזר בתאים בארבעה מיליליטר של מדיום RPMI המכיל את תרכובת התרופה בריכוז הטיפול הרצוי. התאם אישית את הפרמטרים הניסיוניים עבור ספקטרומטר המסה.
תחת כותרת מצב הסריקה של תוכנת הכלי, בחר הגדר סריקה. השתמש ברזולוציה של 60,000 ב M מעל Z 400, מיקרוסקאן אחד 100 אלפיות שנייה זמן הזרקה מקסימלית ושליטה אוטומטית להשיג על. תחת משאבת מזרק, בחר את קצב הזרימה של 150 ננוליטר לדקה.
בחר מקור NSI והחל מתח של כ- 4.5 קילו-וולט. הפעל את המיקרוסקופ ההפוך בהגדלה של פי 40 שנבחרה הן עבור הלוח העליון והן עבור העדשה התחתונה. חבר אותו ליציאת ה- USB של מחשב נישא כדי ללכוד הזנות וידאו בשידור חי.
הפעל את הצלחת המחוממת והגדר אותו ל 37 מעלות צלזיוס. במחשב, עבור אל הכרטיסיה רכישת נתונים ובחר ברציפות תחת זמן שנרכש. כדי להכין את המדגם לניתוח, פיפטה 2-3 של המדגם לתוך המכסה של צלחת פטרי קטנה.
מקם את המדגם במרכז האור מהמיקרוסקופ ההפוך מעל הלוח המחומם. הכן את הבדיקה לבחירת תאי זכוכית לניתוח. השתמש במערכת מניפולציה התא כדי להזיז את החללית כך החלק העליון שלה ממוקד תחת microcsope הפוך באותו מישור כמו התאים.
השתמש במערכת טיפול בתאים כדי להעביר את קצה הבדיקה של בחירת התא לתא ייעודי לניתוח. תהליך זה מנוטר באמצעות המיקרוסקופ ההפוך. בעדינות לסובב את הידית של microinjector כדי להתאים את המיקום של שמן מינרלי בתוך הצינור.
יניקה עדינה מסופקת על ידי המיקרו-מיינר כדי לאבטח את התא הממוקד לקצה הבדיקה לבחירת התא. השתמש במערכת טיפול בתאים כדי להעביר את התא בקצה הבדיקה לבחירת התא לקצה הבדיקה הבודד באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי המתמקד בקצה הבדיקה הבודד כדי לפקח על תהליך זה. תאי K-562 לא מטופלים משמשים לביסוס השיטה הניסיונית.
בניסוי SCMS טיפוסי, ניתן לראות שינויים ברורים בספקטרום המסה מהעברת תא במהלך זיהוי התוכן התאי ולאחר סיום המדידה. שלוש פסגות נפוצות של שומנים סלולריים, כולל מחשב 34:4, מחשב 36:4 ומחשב 38:5 מנוטרות כדי להבטיח שהתא יועבר בהצלחה ותוכן סלולרי יתגלה. זהותם של מחשבים רבים בטווח המסה של 750 עד 850 מאושרת באמצעות MSMS בדגימות ליט תאים לא מטופלים.
באמצעות בדיקה אחת ICMP MS להגדיר, Gemcitabine, Taxol ו OSW1 זוהו בעקבות הדגירה עם תאים K-562. תוצאות אלה מראות כי שיטה זו יכולה לשמש לחקר שומנים תאיים, תרופות, מטבוליטים ברמת התא הבודד מתאים בתסרון בסביבה ילידית קרובה. זכור למקם באופן מאובטח את הבדיקה בחירת תא זכוכית לתוך מחזיק פיפטה אוניברסלי, כך יניקה ניתן להחיל כראוי.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על דגימות המטופל נגזר להבחין הבדלים בין מטבוליטים הסלולר ממגוון רחב של סוגי תאים, אשר מאפשר לנו להשיג הבנה טובה יותר של מצבי מחלה אלה. לאחר פיתוח שיטה זו, אנו יכולים ליישם באופן פוטנציאלי כימות של תרכובות סמים ברמת התא הבודד. כאשר עובדים עם תאים, חשוב שיהיה ציוד מגן אישי מתאים כולל חלוק מעבדה וכפפות.
ניתן להשתמש ללבוש עיניים נוספות בעת עבודה עם זכוכית.
סקירה כללית
פלטפורמת מניפולציה של תאים משולבת פותחה לניתוח מקוון של תאי השעיה בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה עם בדיקה יחידה בתנאים סביבתיים. שיטה זו מאפשרת את המחקר על הטרוגניות תאית בסביבה כמעט טבעית.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- ספקטרומטריית מסה
- ניתוח של תא בודד
רקע
- שיטה זו מנתחת תאים ישירות מתוך תמיסה.
- היא דורשת הכנה מינימלית של הדגימה.
- מתאימה למחקר ביופסיות נוזליות ממצבי מחלה שונים.
- מאפשרת ניתוח של דגימות תאים שמקורן בחולים.
מטרת המחקר
- לחקור את ההטרוגניות התאית.
- לנתח ליפידים תוך-תאיים, תרופות ומטבוליטים ברמת תא בודד.
- לפתח שיטה לניתוח בזמן אמת של תאים בודדים.
שיטות ששימשו
- הכנת בדיקות זכוכית מחודדות למניפולציה של תאים.
- שימוש במערכת מניפולציה של תאים המחוברת לספקטרומטר מסה.
- יישום יינון ננו-אלקטרו-ספריי להכנסת דגימה.
- מעקב אחר ספקטרום מסה במהלך העברת ניתוח תאים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של תוכן תאי במהלך ספקטרומטריית מסה.
- זיהוי פסגות ליפידים המאששות העברה מוצלחת של תאים.
- זיהוי תרופות כמו גמציטבין וטקסול בתאי K-562.
- הוכחת יישומיות השיטה למחקר סוגי תאים שונים.
מסקנות
- הפלטפורמה המשולבת מאפשרת ניתוח יעיל של תא בודד.
- היא מספקת תובנות לגבי תגובות תאים לטיפולים תרופתיים.
- שיטה זו יכולה לשמש למחקר נוסף בביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The integration of single-probe mass spectrometry with a cell manipulation platform enables direct, quantitative analysis of drugs and metabolites in individual suspension cells from patient-derived samples. This approach addresses the challenge of studying cellular heterogeneity and drug response in a near-native environment, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. The platform's minimal sample preparation and compatibility with liquid biopsies position it as a valuable asset for risk-adjusted portfolio decisions in disease biology and personalized medicine.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying intracellular drug and metabolite levels in single cells.
- Supports biological de-risking by revealing cellular heterogeneity and functional target engagement in patient-derived samples.
- Facilitates predictive confidence and triage of targets based on direct molecular readouts from disease-relevant cells.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Delivers reproducible, quantitative mass spectrometry outputs for assay standardization and benchmarking.
- Enables scalable, high-content analysis of drug uptake and metabolism at the single-cell level.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling analysis of patient-isolated cells from body fluids.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting liquid biopsy and disease-state profiling.
- De-risks advancement decisions by offering direct evidence of drug action in clinically relevant cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This platform bridges early discovery, lead identification, and translational research by enabling direct, quantitative analysis of single suspension cells from clinical samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through single-cell drug and metabolite profiling.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for evaluating compound effects in heterogeneous cell populations.
- Analytics: Delivers high-resolution, quantitative mass spectrometry data for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery outputs to preclinical and clinical biomarker strategies using patient-derived cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical capability for diverse disease models and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by resolving cellular heterogeneity at the molecular level.
- Operational Value: Streamlines workflows with minimal sample preparation and robust, reproducible outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing actionable data from clinically relevant samples.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of programs based on direct evidence from patient-derived cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell manipulation, mass spectrometry, and data interpretation.
- Demands specialized instrumentation, including microinjectors, inverted microscopes, and high-resolution mass spectrometers.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling and analytical protocols.
- Adaptable to various cell types and body fluids, but may require optimization for specific disease models.
- Practical limitations include throughput and the need for precise cell selection and transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Glass Cell-Selection Probe Fabrication and Integrated Cell Manipulation Platform Assembly
2:32
Couple the ICMP with a Single-Probe Setup and Suspended Cell Sample Preparation
3:58
Perform SCMS Measurements Using the ICMP/Single-probe Setup
5:57
Results: Integrated Cell Manipulation Platform Testing of Single Suspension Cells
7:07
Conclusion
