Name: מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: למד שיטה מהירה וזולה למדידת הפרשת אינסולין בתאי בטא באמצעות לוציפראז Gaussia. השיטה מאפשרת בדיקת טיפולים מרובים בו-זמנית ותוצאות מיידיות לגילוי תרופות לסוכרת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לכל החברים הנוכחיים והקודמים במעבדת קוב לעבודה ולדיונים יקרי ערך, ולדיון וואר לסיוע מינהלי. מיכאל קאלוואט נתמך על ידי קרן המחקר לסוכרת קטינים סרה-2019-702-Q-R. עבודה זו נעשתה אפשרית דרך NIH R37 DK34128 ו וולש קרן גרנט I1243 למלאני קוב. חלקים מוקדמים של עבודה זו היו נתמכים גם על ידי NIH F32 DK100113 למייקל קאלוואט.

1. הכנת ריאגנטים, מדיה ומאגרים (שולחן 1)
<ol><li>הכנת MIN6 מדיה מלאה ב 500 mL של גלוקוז גבוה (4.5 g/L) בינונית שונה של הנשר של Dulbecco (Dמאמ) עם התוספים הבאים: 15% סרום של העובר (FBS), 100 יחידות/מml 100, מסטרפטומיצין μg/mL, 292 μg/מ"ל L-גלוטמין, ו 50 μM . β-מרקפטואתנול הערה: קו התאים היציבים במקרה זה מתוחזק ב250 μg/mL של אנטיביוטיקה G418.</li>
	<li>הכינו את ביקרבונט מאגר Krebs-צלצול (KRBH) על-ידי ביצוע פתרון המכיל 5 מ"מ KCl, 120 מ"מ הייגל, 15 מ"מ HEPES (pH 7.4), 24 mM נחקו3, 1 מ"מ MgCl2, 2 מ"מ cacl2, ו 1 מ"ג/mL-מבצע רדיוחיסוני כיתה בכיתה סרום אלבומין. גלוקוז יש להוסיף היכן שצוין מ 2 מניות M. הערה: KRBH משמש לדגירה את התאים עם וללא גירוי כדי להעריך אינסולין ו/או הפרשה של גאוסייה לוציפראז.</li>
	<li>הכינו את התמיסה של קומרכאזין (CTZ) כדלקמן. הכן acidified מתנול על-ידי הוספת 106 μL של HCl מרוכזת ל-10 mL של מתנול. לאחר מכן, התמוססות CTZ ב-acidified מתנול ב 1 מ"ג/mL ולאחסן ב-80 ° c ב-בורג צינורות כובע. הערה: מניות אלה לשמור על פעילות מספקת לוציפראז שגרתי, גם לאחר 1 שנה של אחסון נאות.</li>
	<li>הכינו את גאוסיה לוציפראז (GLuc) מאגר הנתונים המבוסס על ספרות9 , כמו גם פטנט מידע10 כדי לסייע במחצית החיים של שיטת Gauferase של גאוסייה ב 96 בפורמט צלחת לוחית. השתמש בנוסחה: 25 מ"מ מסנן טריס pH 8, 1 מ"מ EDTA, 5% גליצרול, 1 מ"ג/mL Na2פו4, 300 מ ל נתרן Ascorbate, 200 mm na2כל כך3 במים. הקפאת מניות ב-20 ° c. לאחר הפשרה, לאחסן את המאגר ב 4 ° c.</li>
	<li>כדי להכין את הפתרון העבודה של Gauferase, להוסיף 4.2 μL/mL של 1 מ"ג/mL (2.36 מ"מ) מניות CTZ פתרון מאגר שיטת GLuc. זה התוצאות בפתרון עבודה 2x של 10 μM CTZ אשר יהיה הריכוז הסופי של 5 μM בבחינה.</li>
</ol>2. תרבות של InsGLuc MIN6 תאים וזריעה לפרשת הפרשה
<ol><li>לתרבות MIN6 תאים, טריזיסיזציה וזרע התאים פעם בשבוע באמצעות טכניקות רגילות של תרבות התא. שינוי מדיה בתאים כל 2-3 ימים. כלול אנטיביוטי בחירה מתאים, כגון 250 μg/mL של G418 במדיה.<ol>
<li>כדי לספק מספר מספיק של תאים שבועי לניסויים, לשמור על התאים ב T75 צלוחיות. זריעת 6 x 106 תאים לכל T75 ב 10 מ ל של המדיה תניב בדרך כלל 30 x 106 כדי 40 x 106 תאים סך לכל T75 לאחר 7 ימים של תרבות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להכין תאים לציפוי לתוך 96-טוב צלחות, לשטוף confluent T75 של InsGLuc MIN6 תאים פעמיים עם PBS ולהוסיף 2 מ ל טריפסין. מודקון ב 37 ° צ' עבור ~ 5 דקות או עד התאים הנתק מן הבקבוקון. קבע את ריכוז התא למילי-ליטר.<ol>
<li>לדלל את התאים במדיה המלאה 1 x 106 תאים/mL כדי לגרום 1 x 105 תאים ב 100 μl לכל טוב ב-96-באר צלחת. התאים צריכים להיות מאוד מספקת לצורך שיטת החיבור לאחר 3 – 4 ימים. הערה: כדי להאריך את תקופת התרבות, ניתן לציפוי מחצית מריכוז התא. שינויי מדיה אינם נדרשים לפני יום הטיפול, אלא אם כן התאים חשופים לטיפולים ניסיוניים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. גלוקוז-גירוי הפרשת גאוסיה לוציפראז
<ol><li>ביום המנה מכינים מספיק KRBH לניסוי (שלב 1.2). מינימום של 50 mL של KRBH per 96-ובכן הצלחת נדרש, ולכן להכין לפחות 75 mL כדי להבטיח מספיק מאגר עבור הניסוי. הכינו מאגר נוסף, אם צירופים שונים של תנאי טיפול בסמים ידרשו KRBH לדילול.</li>
	<li>הכינו מאגר מים ללא גלוקוז. Decant המדיום מ 96-ובכן צלחת (s) על ידי היפוך במהירות את הצלחת מעל כיור מעבדה ולאחר מכן למחוק בחוזקה על ערימת מגבות נייר כדי להסיר עודף בינוני.</li>
	<li>באמצעות צינורות אלקטרוניים או ידני של 8 ערוצים, פיפטה 100 μL/ובכן KRBH מן המאגר על פני הצלחת 96-באר (s). חזור על הסכום הכולל של שתי שטיפות.</li>
	<li>(צעד אופציונלי של טיפולים בתרכובת חריפה) אם לא ביצוע טיפולים בסמים, המשך בשלבים 3.5 ו-3.6 ללא שינוי. כדי לבחון את ההשפעות של מולקולות קטנות על הפרשת אינסולין, ניתן להוסיף תרכובות לתאים במהלך תקופת הדגירה המוקדמת, תקופת הגירוי, או שניהם.<ol>
<li>טכניקה אחת היא להוסיף תרכובות אצווה כדי KRBH ב 1.5 mL ולהשתמש בצינורות הניתנים להתאמה דיגיטלית 8 ערוצים כדי להעביר את התרופה-KRBH מן הצינורות לתאים ב 96-באר צלחות. הערה: אם הצינור הניתן לכוונון אינו זמין, עותק משוכפל 96-ובכן צלחת של סמים-KRBH ניתן לעשות ומתקן שמונה ערוצים סטנדרטי ניתן להשתמש כדי להעביר את המאגר. שינויים נוספים בפרדיגמת הטיפול ניתן לטפל בתאים במשך 24 שעות במדיה לפני התיתינה, כפי שמתואר בעבר1,8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף 100 μL של KRBH המכיל את הריכוז הרצוי של גלוקוז או תרכובות ומניחים את המנה בחממה 37 ° c עבור 1 h. הערה: בהתאם לפריסה הניסיונית, היא מועילה מאוד לקבל מעבר של צינור רב ערוצי אלקטרוני המאפשר מעבר מיגדרי של הערוץ מטור של שמונה 1.5-mL לשמונה שורות של צלחת 96-באר.</li>
	<li>לאחר השעה 1 של הדגירה המוקדמת, לחזק את המאגר לתוך הכיור ולמחוק בחוזקה על מגבת נייר. הוסף 100 μL של גלוקוז חינם KRBH לכל טוב לשטוף את הרקע שנצבר של הלופראז גאוסייה. Decant הצלחת שוב ולהוסיף שליטה ומגירוי תנאים לצלחת ב 100 μL לכל טוב. מניחים את הצלחת באינקובטור 37 ° c עבור 1 h.</li>
	<li>לאסוף בקפידה 50 μL של supernatant באמצעות מצפטה רב-ערוצי, שינוי טיפים בין תנאי טיפול לפי הצורך, ולהעביר את supernatant לנקות אטום לבן אטומה ל96 בנת היטב. הערה: לוחיות השפל של הקירות הלבנים ברורים ניתן להשתמש אם יש צורך, למרות כמות משמעותית של אות לוציפראז יאבדו.</li>
	<li>לאחר איסוף של 50 μL של KRBH supernatant, המדגם יכול להיות מיידי. במקרה הצורך, לחתום ולאחסן דגימות ב -4 ° c לכמה ימים (פעילות gluc מחצית חיים ~ 6 ימים) או-20 ° c עד חודש אחד11,12.</li>
</ol>4. הסדר הלוציסייה המופרש
<ol><li>כדי להכין את הפתרון העובד העבודה GLuc, פיפטה את הכמות הנדרשת של פתרון מלאי CTZ (4.2 μL/mL) לתוך מאגר שיטת GLuc. כדי למנוע התחממות CTZ, הצינורות במהירות ב-80 ° c מקפיא או לשמור את הצינור על קרח יבש.</li>
	<li>באמצעות הצנרת האלקטרונית רב-ערוצי, להוסיף במהירות 50 μL של הפתרון העבודה GLuc לעבוד גם על פני הצלחת 96-באר המכילה את KRBH supernatants שנאספו. אם יש טיפות על הצדדים של בארות כלשהן, לקצר לסובב את הצלחת בצנטריפוגה הנדנדה השולחן הראש התנופה.</li>
	<li>קרא את האור בקורא צלחת מתאים בתוך כמה דקות ולקרוא כל טוב עם זמן אינטגרציה 0.1 s.</li>
</ol>

<ol><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li>
<li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li>
<li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li>
<li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li>
<li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li>
<li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therarpy%22%5BJournal%5D)">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li>
<li>Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , WO2018175324A1 (2018).</li>
<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14(2014).</li>
<li>Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).</li>
<li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li>
<li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li>
<li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li>
<li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li>
<li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868(2012).</li>
<li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li>
<li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li>
<li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li>
<li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li>
<li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2%2B+Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li>
<li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+%26%2334%3Bno-wash%26%2334%3B+high-throughput+alternative+to+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">AlphaLISA immunoassay platform- the &#34;no-wash&#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li>
<li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li>
<li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Sociecy+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835(2018).</li>
<li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li>
<li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן אנו מציגים שיטה להעריך במהירות גלוקוז מגורה הפרשות אינסולין תגובות מתאי MIN6 β. לקבלת התגובות הטובות ביותר בסדר זה חשוב לזרוע את התאים MIN6 בצפיפות הנכונה ולאפשר להם להפוך 85-95% confluent. זה משפר את התגובות β cell לגלוקוז בגלל שיפור תא הקשר וסינכרון התאים, אשר מתרחשת הן באיים הראשיים17,18,19,20,21 , כמו גם MIN6 תאים16,<...

השיטה המוצגת כאן מאפשרת הפרשת אינסולין מקו בטא שונה גנטית להיות מוכן במהירות ובאופן בלתי נשכח בפורמט 96-היטב-צלחת. המפתח לפרוטוקול זה הוא גרסה משתנה של אינסולין עם הגאוסיה המופרש באופן טבעי (gluc, ~ 18 kda) הוכנס ( ראה איור 1) לתוך ה-C פפטיד כדי ליצור אינסולין-גאוסייה (insgluc)1,2. חלבונים גדולים אחרים, כגון gfp (~ 25 kda), הוכנסו בהצלחה לתוך C-פפטיד של אינסולין והציגו את העיבוד לאחר הניתוח הצפוי מתוך proinsulin-gfp לאינסולין ו gfp-C-פפטיד3,4. עבור הצורך בפרוטוקול זה, gluc כבר ממוטב codon עבור ביטוי היונקים ושני מוטציות הוצגו כדי לשפר זוהר כמו הקינטיקה5,6. ניתן לבדוק בקלות צירופים מרובים ושכפול של תנאי טיפול בתבנית 96-היטב, וניתן לקבל את תוצאות ההפרשה מיד לאחר הניסוי.
יתרון מרכזי, כפי שצוין בעבר2, הוא העלות הנמוכה של מדידה זו הפרשה מבוסס לluciferase (< $0.01/טוב) אשר מבדיל אותו מן העלויות הגבוהות יחסית והיבטים טכניים של חיסוני מקושרים אנזים בחני (אליאס) ( > $2/ובכן) ו-פלואורסצנטית הומוגנית בזמן (HTRF) או אחרים Förster העברת אנרגיה (מבוסס) נוגדן (> $1/ובכן) assays. בהשוואה לאלה המבוססים על נוגדנים, אשר למדוד את הריכוז של האינסולין על ידי התייחסות עיקול סטנדרטי, שיטת InsGLuc מודד פעילות הפרשה כהשוואה יחסית לשלוט בארות על הצלחת. מסיבה זו, כל ניסוי דורש הכללה של שליטה נאותה. הבחנה זו היא עסקת חליפין כדי לאפשר מדידות מהירות וזולה. עם זאת, הפרשת insgluc הוכח להיות מתואם מאוד עם הפרשת אינסולין כפי שנמדד על ידי אליסה1,2. טכנולוגיה זו הפכה להיות מדורגים עבור הקרנת תפוקה גבוהה1,2,7 והובילה לזיהוי של מודולים הרומן של הפרשת אינסולין כולל מעכבי מגודרת מתח תעלת אשלגן7 כמו גם מעכב מוצר טבעי של β cell פונקציה, Chromomycin a28. השימוש ב-InsGLuc הוא המתאים ביותר עבור חוקרים המתכננים לבחון ללא הרף תנאי טיפול שונים להשפעה שלהם על הפרשת אינסולין. בניסויים מעקב יש צורך לחזור על ממצאים מרכזיים בתוך קו β הורים, ובצורה אופטימלית באיים מוריים או בני אדם, ולמדוד הפרשת אינסולין באמצעות שיטת נוגדן מבוססת.

<table><tbody><tr><td><חומרי תרבית תאים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rIns-GLuc תאי</td><td></td><td></td> MIN6 יציבים <td>קו תאים הורי MIN6 המבטא ביציבות pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc ומתוחזק ב-250 ug/ml G418</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>4.5 גרם/ליטר מדיה גלוקוז</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, סיגמא</td><td></td><td>F4135</td><td></td>פניצילין מומת בחום</tr><tr><td>/ Streptomycin</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>בטא-מרקפטואתנול</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP 176-100</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924-500</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G418-10</td><td>תמיסת מלאי 250 מ"ג/מ"ל במים. הקפיאו מינויים ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות T75</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-202-000</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחות תרבית רקמות באר</td><td>Celltreat</td><td>229196</td><td></td></tr><tr><td>מאגרי ריאגנטים (50 מ"ל)</td><td>קורנינג</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק</td><td>><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>תגובות</חזק></td></tr><tr><td><ריאגנטים לבדיקת הפרשה חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA (דרגת RIA)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-146-952</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Hepes, pH 7.4</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>50-213-365</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</sub</td><td>>Thermo-Fisher Scientific</td><td>15568414</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>תרופות אופציונליות לניסויי גירוי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diazoxide</td><td>Sigma</td><td>D9035</td><td>תמיסת מלאי: 50 מ"מ ב-0.1N NaOH. הוסיפו כמות שווה של 0.1N HCl לכל חוצץ שבו מוסיפים דיאזוקסיד.</td></tr><tr><td>אפינפרין (מלח ביטרטרט)</td><td>Sigma</td><td>E4375</td><td>תמיסת מלאי: 5 מ"מ במים</td></tr><tr><td>PMA (phorbol 12-myristate)</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td>תמיסת מלאי: 100 &micro; M ב-DMSO</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Guassia assay materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disodium phosphate (Na2HPO4)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>G334</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ברומיד</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>AC44680-1000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>תרמו-פישר סיינטיפיק</td><td>AC44608-5000</td><td>תמיסת מלאי: 0.5 M pH 8</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>RPI</td><td>T60040-1000.0</td><td>תמיסת מלאי: 1 M pH 8</td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AAA1775922</td><td>US7718389 פטנטים בארה"ב טוען כי אסקורבט יכול להגביר את יציבות הקואלנטרזין.</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Sigma</td><td>S0505-250G</td><td>פטנט ארה"ב US8367357 מוצע סולפיט עשוי להפחית את הרקע עקב BSA</td></tr><tr><td>Coelenterazine (מקורי)</td><td>Nanolight / Prolume</td><td>3035MG</td><td>תמיסת מלאי: 1 מ"ג/מ"ל ב-MeOH מחומצן (2.36 מ"מ)</td></tr><tr><td>OptiPlate-96, לבן אטום 96-בארות Microplate</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005290</td><td>כל צלחת לבנה אטומה של 96 באר אמורה להספיק. לוחות תחתונים שקופים יעבדו גם הם, אולם חלק מהאות יאבד.</td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 קורא צלחות היברידי או שווה ערך</td><td>BioTek</td><td>8041000</td><td>נדרש קורא צלחות עם זיהוי זוהר ויכולות צלחת 96 בארות.</td></tr><tr><td>פיפטת VOYAGER 8 ערוצים (50-1250 ומיקרו; L)</td> <td>Integra</td><td>4724</td><td>פיפטה רב-ערוצית אוטומטית שימושית ביותר להוספה מהירה של ריאגנטים לוציפראז ותאי ציפוי בפורמט 96 בארות</td></tr><tr><td>8 ערוצים 200 ומיקרו; L פיפטה</td><td>טרנספרפט S 20-200 ומיקרו; L</td><td>2703710</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

ביצוע נוגדנים מבוססי נוגדן עבור אוסף המופרש לאחר הדגימה לאחר מכן דורש בדרך כלל כמה שעות עד יום של זמן הצורך והוא יכול להיות יקר, בהתאם לצורך הספציפי. לוציפראז מופרש מזרז את התוצאות ולהקטין את עלות הכדאיות לכל מדגם באופן משמעותי. כאן אנו מציגים גישה בשימוש מועט יחסית כדי לאמוד פעילות הפרשה אינסולין מתאי β הלבלב באמצעות Gaussia לוציפראז מוכנס גנטית בתוך C-פפטיד. במהלך העיבוד האנטי-נגד-חרדה של הפרואינסולין, הג-פפטיד משחרר את הלוציפראז בתוך הפרשת האינסולין ושלפוחית האנרגיה שבה הוא מופרש עם אינסולין. תוצאות ניתן לקבל בתוך דקות לאחר איסוף המדגם בגלל המהירות של לוציפראאז assays. הגבלה של התשובה היא שזהו מדידה יחסית של הפרשת אינסולין ולא כימות מוחלטת. עם זאת, פרוטוקול זה הוא חסכוני, מדרגי, וניתן לבצע באמצעות מרבית קוראי לוחיות האור הרגילות. פיפטות אנלוגי ודיגיטלי רב ערוצי להקל על מספר שלבים של השיטת. ניתן לבדוק במקביל וריאציות נסיוניות רבות. לאחר מערכת ממוקדת של תנאים הם החליטו על, ריכוזי אינסולין צריך להיות נמדד ישירות באמצעות נוגדן מבוסס בחני עם עקומות סטנדרטיות כדי לאשר את תוצאות שיטת ללוציפראז.

כדי למדוד את הביצועים של הקבוע תחת תנאי בקרה, מינון פשוט של התגובה הגלוקוז במינון או גירוי באמצעות הפרדיגמה diazoxide ניתן להשלים. במקרה של לשעבר, מראש לקדם את התאים עבור 1 h בתנאים ללא גלוקוז ואחריו טיפול עבור 1 h עם ריכוזי גלוקוז הגוברת צריך לגרום לפעילות הפרשה מעט מאוד ב-5 מ"מ, בעוד הפרשה מוגברת נצפתה מעל 8 מ"מ גלוקוז (איור 2). גירוי עם 35 mM KCl גם משמש כשליטה חיובית על הפרשה מגורה. הכללת הפרשה-תרופות מאופפות במהלך תקופת הגירוי צריכה לתת את העיכוב הצפוי א...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מהירה בעלות נמוכה לוציפרראז בחני בתפוקה בינונית באמצעות העברת אינסולין מקושרת של גאוסיה לוציפראז כפרוקסי עבור הפרשת אינסולין מתאי בטא. ניתן לבצע את האפשרות עם מרבית קוראי הצלחות והפיפטות רב ערוצית.

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

פרוטוקול זה מתאר גישה מהירה חלופית לגילוי הפרשת אינסולין מקווי תאי בטא כדי לזרז גילוי ואפיון של תרופות. גישה זו שימושית מכיוון שניתן לבדוק טיפולים מרובים בו זמנית, התוצאות זמינות מיד לאחר הניסוי, ובדיקה זו זולה יותר מאחרים. היישום של שיטה זו לקראת הקרנה עבור אפנונים מולקולה קטנה חדשה של הפרשת אינסולין עשוי לזהות תרכובות עופרת לטיפולים עתידיים בסוכרת.ידע מוגבר בתפקוד תאי בטא יכול לתרום להבנה טובה יותר של הפרשת חלבון או נוירוטרנסמיטר באופן כללי. כתב הפרשת אינסולין זה הוקם לעבוד במערכת lentiviral בקווי תאי בטא אחרים ובאיים אנושיים. היכרות זו צריכה להיות פשוטה מאוד לאנשים המכירים את תרבות התאים ומפעילים פיפטים רב-ערוציים.לפני תכנון ניסויים כלשהם, ודאו שקווי תאי הבטא ההוריים או היציבים שלכם מגיבים כראוי לגלוקוז באמצעות ELISA של אינסולין. התחל על ידי הכנת קרבס-רינגר ביקרבונט Buffer או KRBH ו גאוסיה לוציפראז פתרון עבודה על פי הוראות כתב היד. לגדל תאי MIN6 בבקבוקי T75 באמצעות טכניקות סטנדרטיות של תרבות תאים.הכן את תאי Min6 InsGLuc עבור ציפוי על ידי שטיפת בקבוקון confluent של תאים פעמיים עם PBS והוספת שני מיליליטר של טריפסין. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך כחמש דקות, או עד התאים להתנתק מן הבקבוק. לקבוע את ריכוז התאים ולדלל את התאים במדיה מלאה למיליון תאים למיליליטר, אשר משווה ל 100, 000 תאים לכל 100 microliters בכל באר של צלחת 96 באר.התאים צריכים להיות מספיק נוחים להתרגם לאחר שלושה עד ארבעה ימים. ביום ההתרכך, הכינו מספיק KRBH ללא גלוקוז לניסוי וקנו מאגר מים. Decant המדיום מן צלחת 96 גם על ידי היפוך מהיר אותו מעל כיור מעבדה ולאחר מכן סופג בחוזקה על ערימה של מגבות נייר כדי להסיר מדיום עודף.לשטוף את הצלחת פעמיים עם 100 microliters של KRBH חינם גלוקוז לגם, ואם ביצוע טיפולים תרופתיים, להוסיף תרופות KRBH על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של KRBH ללא גלוקוז לכל באר ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, decant החיץ כתם את הצלחת על מגבת נייר.הוסף 100 microliters של גלוקוז חינם KRBH לבא לשטוף את כל הרקע שנצבר ולאחר מכן decant את הצלחת. מוסיפים שליטה וגירויים עם או בלי טיפולים תרופתיים ב 100 microliters לגם דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. חשוב לכלול פקדים בזליים ומעוררים על כל צלחת על מנת לקבוע את ההיענות של התאים בניסוי נתון.אם התאים איבדו את תגובתם לאורך זמן, לתרבות אותם מחדש ממלאי חנקן נוזלי טרי. בזהירות לאסוף 50 microliters של על טבעי באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר אותו לבן אטום 96 צלחת גם, ולשמור את המדגם בטמפרטורת החדר על הספסל עד מוכן לתדהמת luciferase. הכן את פתרון הבדיקה של גאוסיה לוציפראז על ידי צינור הכמות הנדרשת של פתרון CTZ למאגר הבדיקה של GLuc, תוך טיפול במניעת התחממות CTZ.השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף במהירות את הפתרון GLuc לתעתעת עבודה לצלחת עם על טבעי KRBH. אם יש טיפות בצדי הבאר, לזמן קצר לסובב את הצלחת בשולחן, נדנדה דלי צנטריפוגה. לאחר מכן לשים את הצלחת הקורא צלחת ולקרוא את luminescence עם זמן אינטגרציה 0.1 השני.בדיקה זו נבדקה בתנאי בקרה על ידי מדידת הפרשת אינסולין כתגובה להגברת ריכוזי הגלוקוז. מעט מאוד פעילות הפרשה נצפתה מתחת חמישה גלוקוז מילימולר, הפרשה מוגברת נצפתה מעל שמונה מילימולר. התאים מפגינים את תגובת הפרשה הצפויה כאשר הם מאותגרים בפרדיגמה של דיאזוקסיד.טיפול דיאזוקסיד חוסם הפרשת אינסולין אם אין אשלגן כלורי חוץ תאי. כאשר אשלגן כלורי קיים, הפרשה יכולה להיות מוגברת עם תוספת נוספת של גלוקוז. הוכח גם כי תאי Min6 InsGLuc מגיבים כצפוי הפרשת תרכובות אפנון כגון אשלגן כלורי, דיאזוקסיד, PMA, ואפינפרין.בעקבות הליך זה, יש לאשר תוצאות קריטיות על ידי ניתוח על טבעי KRBH בבדיקות ELISA או HTRF מבוססות נוגדנים המאפשרות קביעת ריכוזי אינסולין. הרבה עבודה חלוצית נעשתה על ידי קבוצה במכון ברוד, שסללה לי את הדרך להשתמש יותר ויותר בהסתעפות הזו במחקר שלי. קבוצות מחקר רבות, כולל אנחנו והקבוצה בברוד, משתמשות בגישה זו במאמצי גילוי תרופות בתחום הסוכרת.

measuring-relative-insulin-secretion-using-co-secreted-luciferase

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת כפולה GloTM Assay בלוציפראז מ Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

תאים סרטניים החלב להביע בלוציפראז מושתלים תת עורי בעכברים דמיינו באמצעות דימות אופטי כדי לפקח על גדילה והתפתחות הגידול הלא פולשני במחקר האורך.

בשנת vivo Bioluminescent הדמיה של גידולים החלב באמצעות ספקטרום IVIS

להלן נתאר את השיטות לבנייה, לדמיין, ולכמת את התגובות של שניהם bioluminescent גחלילית ואנזימי וציפראז renilla לידי ביטוי בתאי סרטן השד גרורתי בעת הצמיחה...

במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

הסרטון מדגים את בדיקת לוציפראז המשמשת לכימות חלבונים המתויגים בלוציפראז. הבדיקה משתמשת באנזים לוציפראז מהונדס המורכב מקטע גדול שנקשר למקטע הקטן, אשר מצומד עם חלבון מעניין. תת-היחידות הכבולות יוצרות אנזים פעיל שבנוכחות המצע משחרר אות זוהר. אות זה מכומת לאחר מכן באמצעות לומינומטר.

בדיקת לוציפראז: בדיקת תפוקה גבוהה למדידת אותות זוהרים באמצעות ביו-כתבים מבוססי מערכת ננולוציפראז מהונדסים

אינטראקציות חלבון Transcellular הם גורמים חשובים של תפקוד תא בטא בלבלב. מפורט כאן היא שיטה מותאמת ממודל של coculture synaptogenesis-לחוקר כיצד חלבוני הטרנסממברני ספציפיים להשפיע הפרשת אינסולין. HEK293 תאי transfected לבטא חלבונים של עניין; תאים בטא לא צריכים להיות transfected או אחר ישירות מוטרד.

ניתוח Coculture של אינטראקציות חלבון תאיות המשפיעות על הפרשת אינסולין על ידי תאים בטא בלבלב

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

כאן, אנו מתארים הגדרות לניטור במקביל ביולומינסנציה צירקדית ופעילות ההפרשה של תאי איים אנושיים וצינורות שריר ראשוניים. לשם כך, השתמשנו בהעברת גן לנטי-ויראלי של מדווח שעון ליבת לוציפראז, ואחריו סנכרון במבחנה ואיסוף מדיום זרימה על ידי פריפוזיה רציפה של תאים.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

כאן, אנו מציגים הומוגנית זמן נפתרה תדאג (HTRF) בתור שיטה יעילה לגילוי מהיר של אינסולין מופרש מתאי.

פורסטר זמן לפתור הומוגנית תהודה אנרגיה מבוססת על העברת Assay גילוי של הפרשת האינסולין

פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את פעילות הפרוטאוליטי פרוטאז תחלופה נמוכה-פעילות מהותית, יחיד בהקשר הסלולר. באופן ספציפי, שיטה זו מוחלת כדי להעריך את הפעילות הפרוטאוליטי של PCSK9, נהג מפתח של מטבולי הפעילות הפרוטאוליטי נדרש עבור תפקידה hypercholesterolemic האולטימטיבי.

Assay לוציפראז תפוקה גבוהה כדי להעריך את Proteolysis של PCSK9 יחיד-מחזור פרוטאז

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וזעיר פולשנית להשתלה והדמיה של תאי NIT-1 בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD) - עכברים משולבים בעלי כשל חיסוני חמור המאותגרים בטחול מטוהר מעכברי NOD סוכרתיים ספונטניים.

ניטור ביולומינסנטי של הישרדות השתל במודל העברה מאומץ של סוכרת אוטואימונית בעכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה סינכרונית ורישום משותף של אירועי איתות תוך תאיים והפרשת אינסולין וגלוקגון על ידי פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים באמצעות העברה אדנו-ויראלית של ביו-סנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP), גלאי הפרשי cAMP באתרו (cADDis) ומערכת מיקרופריפיוזיה.

מערכת פסאודואיסלט אנושית להערכה סינכרונית של דינמיקה ביו-חיישנית פלואורסצנטית ופרופילי הפרשת הורמונים

למד שיטה מהירה וזולה למדידת הפרשת אינסולין בתאי בטא באמצעות לוציפראז Gaussia. השיטה מאפשרת בדיקת טיפולים מרובים בו-זמנית ותוצאות מיידיות לגילוי תרופות לסוכרת.

מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז

גלה סרטונים נוספים