Name: מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: למד שיטה רגישה למדידת התפשטות תאים בשרירים וסקולריים חלקה באמצעות כימיה לחיצה עם EdU. השיטה מספקת חלופה זולה ולא רעילה לערכות מסחריות ללא שימוש ברדיואקטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לקייטי קארול. על סיוע טכני אנו מודים גם ד ר דוד Cool ואת המעבדה לניתוח פרוטאומניקס להוראה על והאספקה של הקורא לוחית הדמיה של העיבוד. עבודה זו נתמכת על ידי המענק של קרן רייט סטייט (כדי L.E.W.).

1. זיהוי של EdU באמצעות תווית פלורסנט
<ol><li>פתרונות מניות<ol>
<li>הכינו פתרון מניות של 5 ממ מ על ידי הוספת 12.5 מ"ג של EdU ל 10 מ ל של כפול מזוקקים H2O.</li>
		<li>להכין את רכיבי הפתרון תיוג: 200 mM טריס (3-הידרוקסימתיל) אמין (THPTA) (100 mg ב 1.15 mL H2o), 100 MM cuso4 (15.95 Mg ב 1 ml h2o; להפוך טריים), 10 מ"מ Cy3 picolyl-azide (1 מ"ג בתוך 95.3 mL-h2o) , מאוחסן ב-5 μL מעלות at-20 ° c), ו 1 ascorbate נתרן (200 mg ב 1 mL H2O; להפוך טריים).</li>
		<li>הכנת resazurin מניות פתרון בריכוז של 0.15 mg/mL. מסנן לעקר ולאחסן 1 mL הבליטים ב 4 ° c. הערה: picolyl אזיד זמין מצומת לכמה fluors שונים, biotin, ו חזרת peroxidase (hrp).</li>
	</ol>
</li>
	<li>סמן תאים שריר וסקולריים חלקה (VSMC) עם EdU. הערה: vsmcs האנושי מבודדים מעורקים כסל באמצעות התרחבות מפיסות הרקמה ההסבר. כאשר גדל בתוך מדיה חינם סרום עם אינסולין, העברת, סלניום תאים אלה לבטא סמנים VSMC smoothelin, שריר חלק רירן שרשרת כבדה (SM-MHC) ו-SMC αactin13.<ol>
<li>לוחית כלי דם חלקה שרירים בתוך 2 x 104/mL ב בינונית של הנשר שונה של העיט (dmem) ב 96 צלחת היטב. הערה: התאים גדלים ב 37 ° צ' בתקשורת תא שרירים חלקה עם 2% סרום עוברי העובר.</li>
		<li>אופציונלי אפשר מספר שעות למשך הלילה לצורך הדבקות. הוסף 20 מניות Μrea במלאי לכל באר. מחלת הקרינה ב 37 ° c עבור 3 ה. לקרוא את האות הפלואורסצנטית בקורא צלחת (560ex, 594em). החלף מדיה באמצעות DMEM טרי. הערה: שלב זה הוא אופציונלי. Resazurin משמש לנרמל מספרי תאים וחשבון עבור השתנות היטב בציפוי14.</li>
		<li>הוספת מלוחים באגירה פוספט (PBS) או גורם הגדילה הנגזר של טסיות (PDGF) 30 ng/mL ל 3-6 בארות לכל טיפול בתחילת תקופת התרבות ו הדגירה עבור 72 h.</li>
		<li>לדלל 5 מ"מ מלאי של המניה 1 מ"מ. הוסף 2 μL לכל הבאר (ריכוז סופי 20 μM) עבור 24 שעות האחרונות של תקופת התרבות 72 h. אל תוסיף EdU לקבוצה אחת של שכפול. בארות אלה ישמשו לקביעת מעבר לאור ברקע. הערה: משך התרבות והתיוג עם EdU מותאם במיוחד לתאי שריר חלקים, אך ייתכן שיהיה צורך לשנותם לכל סוג תא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תקן תאים פאראפורמלדהיד.<ol>
<li>הסרת מדיה והוספת 150 μL של 4% בכיוון הערוץ (PBS) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להסיר את התחתית ולהוסיף 150 μl של 1% פוליאתילן גליקול טרט-octylphenyl אתר (TX-100) (במים) בבאר עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר TX-100 על ידי שטיפת שלוש פעמים עם PBS. התראה: המטה רעיל, לטפל בזהירות. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן תאים קבועים ב-PBS ב-4 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זיהוי משולב של EdU.<ol>
<li>לבצע תיוג פתרון (10 מ"ל לכל 96 צלחת הבאר, באמצעות הפנימי 60 בארות) רק לפני השימוש על ידי הוספת ריאגנטים מתוך פתרונות המניה בסדר הבא: thpta 20 μl, cuso4 20 μl, Cy3 picolyl אזיד 5 μl, Na ascorbate 100 μl ל-PBS עבור נפח כולל של 10 mL.</li>
		<li>להסיר PBS מבארות ולהוסיף 150 μL של הפתרון תיוג לכל טוב. דגירה 30 דקות ב 37 ° c. כדי לזהות את כל גרעיני, להוסיף 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לכל טוב. קרא על הקורא צלחת הזריחה (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350לשעבר, 470em) או תמונה על מיקרוסקופ. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן תאים קבועים ומוכתמים ב-PBS ב-4 ° צ' ובתמונה במועד מאוחר יותר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. זיהוי של EdU באמצעות הומינסנציה
<ol><li>סעיפים שלמים 1.1 – 1.3.</li>
	<li>הכינו טריס-מלוחים באגירה עם 0.1% polysorbate 20 (TBST).</li>
	<li>. בלוק בארות<ol>
<li>הוסף 150 μL של חסימת מאגר (טבלה של חומרים) על כל באר ו מארג עבור 90 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר מאגר חוסם ושטוף שלוש פעמים עם 200 μL של PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זיהוי משולב של EdU.<ol>
<li>הפוך את פתרון התיוג כמכוון בשלב 1.4.1, והחליף ביוטין picolyl עבור Cy3 picolyl אזיד.</li>
		<li>רוחצים את הבארות חמש פעמים עם 200 μL של TBST, עם טלטול, 3 דקות לכביסה.</li>
		<li>Peroxidases אנדודוגני כיבוי עם 150 μL של 0.3% H2O2 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסרת H2O2 ולשטוף חמש פעמים עם 200 ΜL של tbst, עם טלטול 3 דקות לשטוף.</li>
		<li>לדלל streptavidin-חזרת peroxidase (SA-HRP; 1:200) ב TBST ולהוסיף 50 μL לכל טוב. . משטח 1 בטמפרטורת החדר</li>
		<li>שטוף חמש פעמים עם 200 μL של TBST, עם טלטול, 3 דקות לכביסה.</li>
		<li>הוסף 50 μL של שיטת האנזים החיסוני המקושרת באמצעות אנזימים (שולחן חומרים) לכל באר.</li>
		<li>קרא מיד בקורא לוחית המסוגל לזהות הומינסנציה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis%3A+Insights+from+animal+models+and+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li>
<li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li>
<li>Cizek, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+atherosclerosis+and+the+development+of+preatherosclerotic+intimal+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+pathology+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia.</a> Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).</li>
<li>Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+Techniques+to+assess+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).</li>
<li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+%28CFSE%29+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).</li>
<li>Sletten, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+Chemistry%3A+Fishing+for+Selectivity+in+a+Sea+of+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).</li>
<li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cell+Cycle+Position+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).</li>
<li>Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+for+Analysis+of+Cell+Proliferation+in+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).</li>
<li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+glycosylation+in+vivo+using+supersensitive+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).</li>
<li>Izquierdo, E., Delgado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+in+sphingolipid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Click chemistry in sphingolipid research.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).</li>
<li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li>
<li>Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+Live+Cells+by+Copper-Catalyzed+Alkyne-Azide+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).</li>
<li>Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+Functional+IL-2+Receptor+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).</li>
<li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoddart%2C+MJ+%22Mammalian+cell+viability%3A+methods+and+protocols%22">Mammalian cell viability: methods and protocols</a>. , Humana Press. New York, NY. (2011).</li>
<li>Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+Cell-compatible+Click+Chemistry+with+Copper-chelating+Azides+for+Biomolecular+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).</li>
<li>Bescancy-Webler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+the+Efficacy+of+Bioorthogonal+Click+Reactions+for+Bioconjugation%3A+A+Comparative+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte.+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study.</a> Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li>
<li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2%E2%80%B2-deoxyuridine+%28EDU%29+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li>
<li>Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+and+limitations+of+%E2%80%9CClick-Chemistry%E2%80%9D-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2%E2%80%B2deoxyuridine+%28EdU%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

התאגדות של EdU היא דרך פשוטה ופשוטה למדוד הפצת תאים; הוא שימושי במיוחד עבור תאים חסיד13. הפרוטוקול שלנו משתמש בתאי שריר חלקה, אבל זה חל על כל תא חסיד (אפיתל, אנדותל, וכו '). למרות שהפרוטוקול אינו מורכב, הצעד הקריטי היחיד מבצע את פתרון התיוג-יש להוסיף את החומרים בסדר המפורט. בנוסף, כמו הבלוטים המערביים, אם משתמשים בלוח האור באופן מיידי, יש לקרוא את הלוחית מיד.
ניתן לשנות או למטב כמה חלקים של הפרוטוקול בהתאם לצורך. חלק אחד הוא משך הדגירה עם EdU. מכיוון שהמטרה שלנו היתה לז...

התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר1,2. שליטה על התפשטות ההשפעות על תהליכים נורמליים כגון פיתוח, תהליכים פתולוגיים כגון סרטן ומחלות לב וכלי דם. צמיחה היפרפלסטית של תאים שריר וסקולריים חלקה, למשל, הוא חשב להיות הקודמן טרשת עורקים3. שינויים בתפוצת התאים משמשים גם להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. בהתחשב בהשפעה הנרחבת שלה, מדידת ההפצה היא התווך של מעבדות רבות בביולוגיה המבוססת על תאים.
ניתן למדוד את תפוצת התא על-ידי ספירת תאים בלבד אם אוכלוסיית הריבית מתפצלת במהירות רבה. עבור תאים הגדלים לאט יותר, ספירת תאים עשויה להיות פחות רגישה. התפשטות נמדדת לעתים קרובות על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. למרות התקן הזהב הוא 3H-thymidine התאגדות, מעבדות רבות מקבל הרחק משיטה זו בהתחשב בזמינות של חדש, לא רדיואקטיבי חלופות. אלה כוללים צבעי פלורסנט cytoplasmic, זיהוי של מחזור תאים חלבונים משויכים, והתאגדות של שאינם רדיואקטיביים נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ' deoxyuridine (Bromo) ו-5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.
צבעי cytoplasmic, כגון carboxyfluoraatstcdedit (CFSE), לזהות התפשטות משום שעוצמת החצאים של הצבע בכל פעם תא מחלק5. טכניקה זו משמשת בדרך כלל בזרימה cy, לנסות תאים שאינם חסיד. זה לא נעשה הרבה עבור תאים חסיד, אבל עם הדור החדש של הקוראים צלחת ההדמיה זה עשוי להשתנות. זיהוי של מחזור התא חלבונים הקשורים באמצעות נוגדנים מבוססי טכניקות (הזרימה cy, כימיה אימונוהיסטוכימיה, וכו ') משמש לעתים קרובות עבור רקמות או תאים שאינם חסיד. תאים/רקמות אלה חייב להיות קבוע מחלחל לפני כתמים. הפונקציה מזהה את הקוד האנלוגי מדומה BrdU ו-EdU דומים בגישה ל- 3שעות-thymidine. התאגדות של BrdU מזוהה על ידי נוגדנים אנטי BrdU, ולכן התאים חייב להיות קבוע וחדיר לפני כתמים. בנוסף, התאים חייבים להיות מטופלים עם DNase כדי לחשוף את האפיפי של BrdU.
התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, שבה הקבוצה האלקין והעזידה "לחץ" יחד בנוכחות של נחושת קטליטי. כל קבוצה יכולה לשמש כמולקולה הביואופטית המשולבת או מולקולה גילוי4. הקבוצה האלמני הזמינה מסחרית. לצורך התפשטות ההפצה, לפיכך, פונקציונליות האלנובית של נוקלאוסייד אנלוגי מזוהה על ידי עזידה מצומת לצבע פלורסנט או סמן אחר. לשילוב של EdU יש מספר יתרונות על BrdU. ראשית, מכיוון שקבוצות האלאלקין והעזידה אינן מצויים בתאי היונקים, האינטראקציה הזאת היא מאוד ספציפית עם רקע נמוך6. בגלל שתי הקבוצות הן קטנות, תאים לא צריך לעבור דנטורציה DNA כדי לחשוף את נוקלאוטיד אנלוגי כנדרש brdu7. לבסוף, לחץ על כימיה הוא תכליתי מאוד, והוא יכול לשמש תיוג מטבולית של DNA, RNA, חלבון, חומצות שומן, ופחמימות8,9,10,11. אם יעד הריבית הmetabolically נמצא על משטח התא, ניתן לתייג תאים חיים12. בנוסף, תאים יכולים להיות מעובדים עוד יותר עבור הוספת כתמים אימונולוורםעם נוגדנים.
הפרוטוקול הבא מתאר את השימוש ב-EdU התאגדות ולחץ כימיה כדי למדוד התפשטות בתאי השריר החלק כלי הדם האנושיים (איור 1). אנו מראים שלוש דרכים שונות של התאגדות של EdU ניתן למדוד, מייצגים תוצאות מכל אחד, ואת היתרונות והחסרונות שלהם. מדידת התפשטות באמצעות כימיה לחץ היא שימושית במיוחד עבור חסיד, תאים הגדלים לאט יותר. בנוסף, את המבנה של התא הוא מתוחזק היטב, מבוססי נוגדן מכתים ניתן גם לבצע.

<table><tbody><tr><td>5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין</td><td>קרבוסינת'</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין פיקוליל אזיד</td><td>קליק כלים לכימיה</td><td>1167-5</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C1297-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 פיקוליל אזיד</td><td>קליק כלים לכימיה</td><td>1178-1</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות ציטציה</td><td>ביוטק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS מיקרוסקופ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מי חמצן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>אסקורבט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140-250G</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue קבוע תא כתמים מוכן בדיקות</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td>DAPI כתם גרעיני</td></tr><tr><td>אודיסיאה חוסם מאגר</td><td>Li-Cor</td><td>927-40000</td><td>מאגר</td></tr> <tr><td>חוסם</td><td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td> Paraformaldehyde <td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא מדעי החיים</td><td>S3014-5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין חזרת פרוקסידאז מצומד</td><td>Life Technologies</td><td>S911</td><td></td></tr><tr><td>סופר אות ELISA Femto</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI137075</td><td>מצע ELISA</td></tr><tr><td>קורא צלחות סינרגיה</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THPTA</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1010-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Bio-Rad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

היכולת של תא להתרבות היא בלתי נפרד לתפקוד הרגיל של רוב התאים, והדיסרגולציה של התפשטות היא בלב תהליכי מחלות רבים. מסיבות אלה, מדידת ההפצה היא כלי נפוץ המשמש להערכת הפונקציה cell. ניתן למדוד את תפוצת התא רק על ידי ספירה; עם זאת, זהו אמצעי עקיף למדידת התפשטות. אחד האמצעים השכיחים של במישרין זיהוי תאים הכנת לחלק הוא על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. אלה כוללים את הרדיו האנלוגי נוקלאוטיל 3H-thymidine פלוס non-רדיואקטיבי נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ' Deoxyuridine (bromo) ו-5-ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU). התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, אשר יש מספר יתרונות כאשר בהשוואה BrdU. בדוח זה, אנו מספקים פרוטוקול למדידת התפשטות באמצעות התאגדות של EdU. פרוטוקול זה כולל אפשרויות לקריאות שונות, יחד עם היתרונות והחסרונות של כל אחד מהם. אנו גם דנים במקומות שבהם הפרוטוקול יכול להיות ממוטב או שונה כדי לענות על הצרכים הספציפיים של הניסוי המתוכנן. לבסוף, אנו נוגעים בדרכים כי פרוטוקול בסיסי זה ניתן לשנות עבור מדידת מטבוליטים תא אחרים.

באיור 2, אנו להדגים את התוצאות של שלושה ניסויים שונים מדידת התפשטות VSMC בתגובה pdgf. לאחר שגדל את התאים במדיה שגובשה עבור SMCs, אנו ביצעו את הניסוי ב-DMEM בחינם סרום, כדי לחסל את כל ההשפעות הפוטנציאליות של סרום או גורמי גדילה על התפשטות. באיור 2A אנו משווים תוצאות, מאותו ניסוי, באמצעות פלורסנט לעומת הבדיקה זורח. כדי לקרוא את הלוחיות הללו, השתמשנו בקורא מיקרופלייט רב-שכבתי שיכול לקרוא ספיגה, זריחה והזדקנות (ראה טבלת חומרים).
<p class="jove_c...

התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר, ובדיקה משותפת המשמשת להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. מדידת התפשטות היא, לכן, שימוש תכוף בביולוגיה התא. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, רב-תכליתית של מדידת התפשטות כי ניתן להשתמש בתאים חסיד ושאינם חסיד.

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

התפשטות היא מדד חשוב לתפקוד התא. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לפתח בדיקה רגישה של התפשטות במעבדות שלהם ללא העלות הגבוהה של ערכות מסחריות זמינות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא נמנעת מטיפול קשה בתאים ו/או משימוש ברדיואקטיביות.תדגים את הטכניקה הזו ויקי וונג, מנהלת המעבדה שלי. כדי לתבצר, הסר תאי שריר חלקים של כלי הדם מבקבוקון עם מדיית תאי שריר חלקה בסרום 2%fetal bovine וצלחת ב-20,000 תאים למיליליטר ב- DMEM בצלחת של 96 בארות. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס לילה.הוסף 30 ננוגרם לכל טסיות דם מיליליטר נגזר גורם גדילה לשלוש עד שש בארות כמו שליטה חיובית כדי לעורר התפשטות. לאחר מכן הוסף PBS לאותו מספר בארות כמו פקד שלילי. דגירה במשך 72 שעות.לדלל בעבר חמישה מלאי EdU מילימולארי אחד ולהוסיף שני microliters לכל באר במשך 24 השעות האחרונות של תקופת התרבות 72 שעות. שמור קבוצה אחת של שכפולים ללא EdU כדי לקבוע פלואורסצנטיות רקע ובוהו. עשרים וארבע שעות לאחר מכן, לתקן את התאים על ידי הסרת מדיה, ולאחר מכן הוספת 150 microliters לכל באר של 4% paraformaldehyde ו דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר.מוציאים את הפרפורמלדהיד ומוסיפים 150 מיקרוליטרים של 1%TX-100 במים ל באר ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לשטוף שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את TX-100. כדי לזהות EdU משולב באמצעות פלואורסצנטיות, לעשות 10 מיליליטר של פתרון תיוג לכל צלחת 96 גם רק לפני השימוש על ידי הוספת reagents מפתרונות מלאי בסדר הנכון:20 microliters THPTA, 20 מיקרוליטר נחושת סולפט, חמישה מיקרוליטר פלואורסין picolyl-azide, ו 100 microliters נתרן ascorbate לתוך PBS עבור נפח כולל של 10 מיליליטר.השלב הקריטי ביותר הוא להפוך את פתרון התיוג ממש לפני השימוש. הסר PBS מ בארות, להוסיף 150 microliters של פתרון תיוג לכל באר דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לזהות את כל הגרעינים, הוסף DAPI לכל באר ותמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי או קורא לוחות הדמיה.כדי להימנע מספירה ידנית וכאשר קורא לוחות דימות אינו זמין, ניתן לשנות פרוטוקול זה לקריאת זוהר באמצעות HRP azide ומצע ELISA. כדי לזהות את EdU באמצעות זוהר, הכינו תחילה מלוחים עם מאגר טריס עם 0.1%polysorbate 20. לאחר מכן הוסיפו 150 מיקרוליטרים של חיץ חסימה לכל באר ודגירה במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הסרת מאגר החסימה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS. כדי לזהות EdU משולב, תחילה להכין 10 מיליליטר של פתרון תיוג לכל צלחת 96 באר על ידי הוספת reagents מפתרונות מלאי בסדר הנכון. ראשית, 20 microliters THPTA, אז 20 מיקרוליטר נחושת סולפט, חמישה microliters ביוטין picolyl-azide, 100 microliters נתרן אסקורבאט לתוך PBS עבור נפח כולל של 10 מיליליטר.לשטוף בארות חמש פעמים שלוש דקות עם 200 microliters של TBST עם רועד. מרווה פרוקסידס אנדוגני עם 150 מיקרוליטרים של 0.3% מי חמצן במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת מי חמצן, לשטוף חמש פעמים שלוש דקות עם 200 microliters של TBST עם רועד.הוסף 50 microliters של peroxidase סטרפטבידין-חזרת מדולל ב TBST לכל באר דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לשטוף חמש פעמים שלוש דקות עם 200 microliters של TBST עם רועד. הוסף 50 microliters של מצע ELISA chemiluminescent לכל באר ולקרוא מיד קורא צלחת מסוגל לזהות זוהר.למרות גרעיני פלואורסצנט ניתן לזהות על ידי קורא לוחיות פלואורסצנטיות סטנדרטי, באמצעות פרוטוקול luminescence, הסריקה פלואורסצנטי מומר קריאה נוזלי הומוגנית זוהה עם peroxidase סטרפטבידין חזרת ומצע ELISA סטנדרטי. היתרון של שיטה זו בהשוואה לקריאה פלואורסצנטי הוא קריאה הומוגנית יותר ואת הצלחת ניתן לקרוא בשניות כפי שניתן לראות כאן כאשר התפשטות של VSMC בתגובה PDGF נמדד. החיסרון הוא שהרקע גבוה יותר מאשר עם פלואורסצנטיות, ולכן פקדים שליליים נוטים להיות גבוהים יותר.בניסיון להקטין את השונות, התוצאות נרמלו לספירת תאים ראשונית. עם זאת, בקבוצה נפרדת של ניסויים, הוכח כי שיטה זו אינה רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים קטנים במספרי התאים. הדרך היעילה והמדויקת ביותר לספור תאים חיוביים וסה"כ EdU היא באמצעות קורא לוחות הדמיה.אם סוג זה של קורא לוחות אינו זמין, ספירה ידנית תניב גם תוצאות מדויקות. בעת השוואת שתי שיטות אלה, הספירה הידנית החיובית של EdU הייתה זהה לספירה האוטומטית וכך גם סך הספירות הבלתי-פתורות. היתרון של שתי שיטות אלה הוא הראות של התאים להיספר, דיוק משופר, כי כתמים לא ספציפיים של פסולת ניתן לראות ולהימנע.החיסרון העיקרי בשיטת הספירה הידנית הוא זמן. זכור להפוך את פתרון התיוג טרי ממש לפני השימוש ולהוסיף את החומרים בסדר המסופק בפרוטוקול הכתוב. אם עוצמת הכתם עמומה, נסו להתאים את הכלאטור ליחס נחושת.זכור כי paraformaldehyde הוא רעיל. זה צריך לשמש ברדס אדים בעת לבישת כפפות. ההליך עצמו אינו קשה אך ייתכן שיהיה צורך לייעל אותו על ידי התאמת כלטור ליחסי נחושת בתסייגות.בנוסף, ניתן להתאים את זמני הדגירה ואורך הטיפול ב- EdU בהתאם לסוג התא ולשאלה הספציפית שנשאל. טכניקה זו תואמת את פני התא ואת הכתמים תאיים, כך המאפיינים של תאים מתחלקים ולא מתחלקים ניתן לקבוע. למרות נפוץ למדוד התפשטות, כימיה לחץ יכול לשמש גם עבור תיוג מטבולי של RNA, חלבונים, חומצות שומן ופחמימות.אם היעד המטבולי של עניין הוא על פני השטח של התא, תאים חיים ניתן לסמן.

measuring-proliferation-vascular-smooth-muscle-cells-using-click

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון וידאו זה מתאר את מדידת התכווצות תאי השריר החלק באבי העורקים (SMC) באמצעות חישת עכבה חשמלית של מצע התא, או ECIS. ECIS מודד את תנועת התאים והיא שיטה אמינה למדידת התכווצויות.

מדידת התכווצות SMC במבחנה: שיטה לא פולשנית להערכת התכווצות תאי שריר חלק באמצעות חישת עכבת מצע תא חשמלי

שיטה זו מתארת ​​את השימוש בכימיה לחץ כדי למדוד שינויים בשעתוק תא מארח לאחר הדבקה בנגיף קדחת הבקעה (RVFV) מתח MP-12. תוצאות יכולות להיות דמיינו איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או הושגו כמותית באמצעות cytometry הזרימה. שיטה זו ניתנת להתאמה לשימוש עם וירוסים אחרים.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

פרוטוקול זה מסוקר Cell-מצע חשמלי עכבת חישה, שיטה להקליט ולנתח את ספקטרום העכבה של תאי חסיד לכימות של התקשרות סלולרי, התפשטות, תנועתיות, ותגובות תאיות לגירויים תרופתיים ורעילים. זיהוי של חדירות האנדותל והערכה של קשרים בין תאים ותא מצע מודגשים.

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

הדוח שלנו מתאר שיטה ייחודית כדי לחזות ולנתח אינטראקציות CTC / EC בסרטן הערמונית בתנאי זרימה פיסיולוגיים.

בשיטה חוץ גופית כדי לבחון אינטראקציות בתיווך-E-selectin בין תאים סרטניים בערמונית מחזור שמקורם בתאי חולים ואנדותל האנושי

אנו מתארים בדיקת פקק מטריג'ל כדי להמחיש את הפוטנציאל האנגיוגני של מאגר של גורמים המופרשים על ידי תאים סרטניים באמצעות שתי שיטות הדמיה משלימות, אולטרסאונד ואנדומיקרוסקופיה. המטריגל, ג'ל מחקה מטריצה חוץ-תאית (ECM), משמש להחדרת גורמים אנגיוגניים למארח (עכבר) המופרשים למדיה המותנית (C.M).

פונקציונליות ניטור ומורפולוגיה של כלי דם גויס על ידי גורמים מופרשים על ידי תאים מניבי גידול בצמיחה מהיר

תפקוד תאי כלי הדם תלוי בפעילות של שליחים תוך-תאיים.  מתוארת כאן שיטת הדמיית שני פוטונים ex vivo המאפשרת מדידה של רמות סידן ותחמוצת החנקן התוך תאיות בתגובה לגירויים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים בתאי אנדותל ושריר חלק בודדים של אבי העורקים המבודד.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

חקירה של נדידה מוקדמת של תאי אנדותל (EEC) חשובה להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות מסוימות וכדי לזהות אסטרטגיות חדשות להתערבות טיפולית. הפרוטוקול הבא מתאר טכניקות להערכת נדידת תאים שהותאמו לחקר EEC.

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים ראשוניים (HUVECs) גודלו למפגש בתוך מכשיר רשת מיקרופלואידי. צומת תאי האנדותל והתפלגות ה-F-actin הודגמו והשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי וייצור תחמוצת החנקן בתגובה לאדנוזין טריפוספט (ATP) כומתו בזמן אמת ברמות תאים בודדים.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות אנדותל-pericyte אדם העכבר באמצעות וריאציה של assay אנגיוגנזה תקע ג'ל מטריקס.

In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג&#39;ל עכבר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ושימוש בפרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק על ידי עכברים כדי להעריך את התכווצות השריר החלק של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים בסביבה כמעט in vivo .

שימוש בפרוסת הריאה החתוכה באופן מדויק כדי לחקור את ויסות ההתכווצות של שריר חלק עורקי דרכי הנשימה והפנים-פולמונרי

למד שיטה רגישה למדידת התפשטות תאים בשרירים וסקולריים חלקה באמצעות כימיה לחיצה עם EdU. השיטה מספקת חלופה זולה ולא רעילה לערכות מסחריות ללא שימוש ברדיואקטיביות.

מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה

גלה סרטונים נוספים