הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה
19 בפברואר 2020
מאמר זה מציג שיטות הכנה לדוגמה עבור שיטה אנליטית ייחודית בזמן אמת המבוססת על ספקטרומטר מסה סביבתי. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע ניתוח בזמן אמת של המולקולות הביולוגית בvivo ללא כל טיפול מיוחד.
לכן, זוהי ספקטרומטריית מסת סביבה ייחודית, המתאימה במיוחד לניתוח דגימות ביולוגיות, הן במבחנה והן במבחנה. מכיוון שזה אינו דורש באופן קבוע טיפול מקדים מיוחד של דגימות, כגון מיון תאים, שברים וריכוז, הוא יכול לנתח מדגם עם אובדן מינימלי של רכיבים ביולוגיים, במיוחד אלה הקיימים כמות קטנה מאוד. טכניקה זו מאפשרת לך לנתח את חומרי רקמת הגלם ישירות בדקה על ידי ספקטרומטריית מסה.
המהירות היא ללא הפרעה החוסן של המערכת, היתרונות העיקריים הטבועים בטכניקה זו. כל מה שאתה צריך לעשות הוא רק כדי להכין סיליקה, 10 מיליגרם של דגימת רקמות, ו 10 microliters של להתרבות. ולשים אותם לתוך מחסנית חד פעמית.
הוא מוגדר למכונת PESI-MS, ותקבל את התוצאה תוך מספר דקות. על ידי בחירת ספקטרומטר המסה המתאים, אתה יכול להוסיף ביאורים לזהות המולקולרית. כדי להתחיל, לאחזר את הכבד או רקמת הכליה מהמקפיא.
על צלחת פקק, לחתוך את דגימת הרקמה על שניים על שניים על שני מילימטרים באמצעות אזמל או סכין. לחלופין, אגרוף את המדגם עם Trepan לקצץ את אורך העמודה לשני מילימטרים. אם הרקמה מזוהמת בדם, יש לשטוף בקצרה עם מלוחים קרים כקרח.
מניחים כ -10 מיליגרם של דגימת החתך או אגרוף החוצה לתוך microtube פלסטיק ולהוסיף 100 microliters של 50% אתנול. השתמש micropestle כדי הומוגניזציה המדגם. ואז עם pipetman, למקם 10 microliters של homogenate לתוך הבאר של המחסנית של ספקטרומטר המסה.
מניחים את המחסנית בתא היוניזציה של ספקטרומטר מסה יינון בדיקה ישירה ולהתקין את בדיקה מחט לגנוב אל חלד שישמש עבור יינון מדגם. סגור את מכסה התא בחוזקה כדי להפעיל באופן אוטומטי את התקן הבטיחות. הפעל את המחשב על הלוח על ידי לחיצה על סמל ההתחלה לנתח, באמצעות לוחות על המסך, להחיל מתח של 2.3 קילובולטים על המחט כדי ליצור את electrospray ולהבטיח כי התדירות של המחט הוא שלושה הרץ.
המתן 30 שניות עד שהמדידה תושלם. לאחר מדידת כל דגימה, יש להשליך את המחסנית והמחט במנושל biohazard. כדי לנתח את ספקטרום המסה, פתח את התוכנה הקשורה לספקטרומטר המסה.
לחץ על קובץ L-C-D בחלון דפדפן קובץ הנתונים של התוכנה. בחירה ללחוץ על שיא אחד של חלון ספקטרום המסה, ולתאר באופן אוטומטי E-I-C. בדוק את T-I-C ו- E-I-C, ולחץ על סמל הספקטרום הממוצע כדי לבחור את טווח הזמן ליצירת ספקטרום המסה.
יצא את נתוני הטקסט הספקטרליים של המסה. כדי לנתח נוזלי גוף, יש להכין עד 10 מיקרוליטר של דגימת הסרום, ולחלק אותה למיקרו-צינור של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 190 מיקרוליטרים של 50% אתנול לצינור, ואז מערבולת לשתי דקות בטמפרטורת החדר.
כדי לחסל את כל תאי הדם האדומים, צנטריפוגה הנוזל ב 15, 000 פעמים G במשך 1 עד 5 דקות בארבע מעלות צלזיוס. להעביר 10 microliters של supernatant לתוך הבאר של המחסנית ולהמשיך למדוד על ספקטרומטר המסה כמו קודם לכן. פרוטוקול זה מציג הכנת מדגם עבור PESI-MS על מדגם מוצק, מדגם נוזלי, ובעלי חיים חיים.
קרצינומה של תאי הכליה האנושיים מראה פסגות אופייניות של שומנים ניטרליים. היו פסגות חזקות יחסית בספקטרום ביחס מסה לטעינה של 900 מרקמה קרצינומה של תאי הכליה האנושיים שלא זוהו ברקמה הלא סרטנית שמסביב. פסגות אלה מייצגות בעיקר טריאצ'יל גליצרול.
דוגמה לנתונים שנרכשו ברקמות כבד רגילות, תיארו את הנגע הניאופלסטי של חולה עם הפטיטיס כרונית ושחמת הכבד. סרום אנושי משלושה אנשים נותח באמצעות PESI-MS, היו הבדלים ברורים בדפוסים הספקטרליים בקרב האנשים. עבור השינויים המטבוליים ב 5-FdU מוזרק דרך הווריד לתוך כלי הזנב של העכבר, זיהוי מהיר מאוד ורגיש של 5-FdU עם adduct נתרן הושג בכבד במקום.
כמו העומק של קצה המחט מאתר הרקמה, ממלא את התפקיד החשוב ביותר יינון שקורא את רכישת נתונים מוצלחת, הקפד לעקוב אחר ההוראות. אתה יכול לזהות את המין המולקולרי על ידי התבוננות במסד הנתונים המסחרי. זוהי דרך להכשיר את המנגנון המולקולרי של המחלה.
חוקרים רבים הפכו מעוניינים ביישום של טכניקה זו לחיזוי השגשוג של המחלה וזה פרוגנוזה. במיוחד באמצעות ביופסיה של ריקט. רק תוודא שלא תידקר על ידי מחט הגשוש.
זה יכול פשוט להימנע עם מכשיר מסוים להסרת המחט מהמכונה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה ייחודית לספקטרומטריית מסות בסביבה (ambient mass spectrometry) לאנליזה בזמן אמת של דגימות ביולוגיות in vivo. טכניקה זו מאפשרת אנליזה של חומרי רקמה גולמיים ללא טיפולי קדם מיוחדים, ובכך ממזערת את אובדן הרכיבים הביולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ספקטרומטריה של מסות
- אנליזה ביולוגית
- כימיה אנליטית
רקע
- ספקטרומטריית מסה בסביבה פתוחה (Ambient mass spectrometry) מתאימה לניתוח הן in vitro והן in vivo.
- השיטה אינה דורשת הכנה מקיפה של הדגימות.
- היא מאפשרת ניתוח של דגימות עם איבוד מינימלי של רכיבים ביולוגיים.
- ניתוח מהיר הוא יתרון מרכזי של טכניקה זו.
מטרת המחקר
- להציג שיטה לניתוח בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות.
- להדגים את היעילות של ניתוח חומרי רקמה גולמיים.
- להדגיש את היתרונות של שימוש בספקטרומטריית מסות בסביבה (ambient mass spectrometry).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של דגימות סיליקה ורקמה.
- שימוש במחסניות חד-פעמיות לניתוח דגימות.
- ניתוח ישיר של דגימות ביולוגיות באמצעות ספקטרומטריית מסות.
- עיבוד מהיר של דגימות בתוך דקה אחת.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת ניתוח מהיר ללא אובדן משמעותי של רכיבים.
- היא יעילה לניתוח דגימות המכילות כמויות קטנות מאוד של חומר ביולוגי.
- מפגינה חוסן ואמינות בניתוח בזמן אמת.
- מקל על חקר מולקולות ביולוגיות במצבם הטבעי.
מסקנות
- ספקטרומטריית מסות בסביבה (Ambient mass spectrometry) היא כלי בעל ערך לאנליזה ביולוגית.
- הטכניקה משפרת את ההבנה של תהליכים ביולוגיים.
- היא מציעה שיטה מהירה ויעילה לאנליזה בזמן אמת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
ספקטרומטרית מסות עם יינון ברסס חשמלי באמצעות גשושית (PESI-MS) מאפשרת ניתוח מולקולרי בזמן אמת של דגימות ביולוגיות עם טיפול מקדימה מינימלי, ובכך תומכת בתיקוף מהיר של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. הטכניקה דורשת רק 10 mg של רקמה או 10 µL של סרום, מה שהופך אותה למתאימה לדגימות פרה-קליניות בנפח נמוך ומפחית את אובדן הרכיבים הביולוגיים. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מובילים (leads) על ידי אספקת נתונים ישירים, in situ, על דינמיקת תרופות ומטבוליטים ממערכות חיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של השערות טיפוליות באמצעות זיהוי ליפידים ניטרליים ומטבוליטים ישירות מרקמות מוצקות, כגון קרצינומה של התאי הכליתיים.
- ערך תפעולי: דורש הכנה מינימלית של הדגימה — הומוגניזציה של הרקמה ב-50% ethanol בלבד — ובכך מפחית את מורכבות זרימת העבודה ואת השונות.
- ערך ניבוי: תומך באישור של מנגנונים מולקולריים באמצעות התאמה למסדי נתונים מסחריים, ובכך מסייע בהערכת רמת הביטחון במטרות (target confidence).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מאפשר ניתוח ישיר של סרום דם אנושי לאחר שקיעה פשוטה באתנול וסנטריפוגציה, ובכך מאפשר סריקה של סממנים ביולוגיים מבוססת נוזלים.
- ערך תפעולי: נעשה שימוש במחסניות חד-פעמיות ובגששים מפלדת אל חלודה, מה שמבטיח סטנדרטיזציה ומפחית את הסיכון לזיהום צולב.
- יכולת הרחבה: מקל על תפזורת דגימות מהירה — תוצאות תוך מספר דקות — ובכך תומך במוכנות לסריקה בשפיעת גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר דינמיקה של מטבוליטים או תרופות באיברים ספציפיים בבעלי חיים חיים, כגון זיהוי 5-FdU בכבד של עכבר.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מספקת נתונים מולקולריים in situ ללא הרס של הרקמה, ובכך משמרת את ההקשר הפיזיולוגי לצורך תרגום טוב יותר מהשלב הפרה-קליני לשלב הקליני.
- קידום מותאם סיכונים: מזהה דפוסים ספקטרליים הקשורים למחלה (למשל, נגעים נאופלסטיים בכבד צהוב/שחיר - cirrhotic liver) כדי לספק בסיס להחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go).
שילוב תהליכי עבודה ושרשראות עיבוד
שיטת PESI-MS משתלבת ברצף הגילוי, מהביולוגיה המוקדמת ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת תוצאות מולקולריות כמותיות ומהירות התומכות בבדיקת השערות ובמוכנות של מערכי בדיקה.
- ביולוגיית גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי זיהוי חתימות מולקולריות ספציפיות לרקמה (למשל, triacyl glycerol בקרצינומה) ללא פראקציונציה.
- סריקה: מאפשרת ניתוח של נוזלים ורקמות המוכנים לבדיקה באמצעות הכנסת דגימות בסטנדרט של מחסנית (cartridge).
- אנליטיקה: מייצרת נתוני ספקטרום מסות (m/z peaks, EIC, TIC) לצורך השוואה כמותית בין תנאים ואנשים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לתיקוף פרה-קליני על ידי ניטור מטבוליטים של תרופות in vivo, כגון 5-FdU תוך-ורידי בווריד זנב של עכבר.
- שימוש חוזר ארגוני: משתמשת בחומרה רב-פעמית (פרובה, תא) עם מתכלים חד-פעמיים, מה שמאפשר סטנדרטיזציה בין פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באמצעות אספקת נתונים מולקולריים ישירים ממערכות ביולוגיות שלמות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות הכנת דגימות סטנדרטית (10 mg רקמה, 10 µL סרום, 50% ethanol) והגדרות מתח/תדר קבועות (2.3 kV, 3 Hz).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי מתן אפשרות לזיהוי מהיר של מטבוליטים/תרופות במודלים של מחלות.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכון באמצעות זיהוי פיקים ספציפיים למחלה (למשל, m/z 900 בקרצינומה) שאינם מופיעים בביקרים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהפעלת ספקטרומטריית מסות, כולל הכנת ממסים (50% ethanol) ושימוש בצנטריפוגה לעיבוד סרום.
- נדרש ספקטרומטר מסות עם יינון באמצעות גשוש ישיר (Direct Probe Ionization), הכולל מערכת מחסורות תואמת וגשוש מחט מפלדת אל-חלד.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של טיפול בדגימות — חיתוך רקמה, הומוגניזציה והעברת תסמין (supernatant) — כדי להבטיח עקביות בנתונים.
- יש להתחשב בעומק קצה המחט כמשתנה קריטי המשפיע על יעילות היינון ועל איכות הנתונים ביישומים in vivo.
- מוגבל לדגימות התואמות ליינון בסביבה (ambient ionization); השפעות מטריצה עשויות לדרוש אופטימיזציה עבור נוזלים ביולוגיים מורכבים.
