Name: זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: למד לזהות 5-hydroxymethylcytosine בתאי עצב ובמוח עכברים באמצעות צביעת immunofluorescence ו-DNA dot-blot. פרוטוקול זה מאפשר חקר שינויים אפיגנטיים במהלך התמיינות עצבית ומסייע בהבנת מנגנוני מחלות נוירולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

XL היה נתמך בחלק על ידי תוכנית הלאומית R & D של סין (2017YFE0196600), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט Nos. 31771395, 31571518). Q.S. היה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2017YFC1001703) ואת תוכנית מחקר ופיתוח מפתח של פרובינצית ג'ה-ג'יאנג (2017C03009). W.X. היה נתמך על ידי הקרן המדע הטבעי של מחוז ג'ה-ג'יאנג (LY18H020002) ואת טכנולוגיית המדע של מחוז ג'ה-ג'יאנג (2017C37057).

כל ההליכים בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג.
1. התרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים ונוירונים
<ol><li>בידוד בתאי גזע עצביים מבוגרים מן המוח הקדמי של מבוגר (8-10 בן שבוע) C57/BL6 עכבר זכר כמתואר בעבר31,32.</li>
	<li>תרבות תאי גזע עצביים למבוגרים בלבד/F-12 בינונית המכילה 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 תוספת, 1% אנטיביוטי-antimycotic, ו 2 מ"מ L-גלוטמין בחממה 5% CO2 ב 37 ° c. לגרום הבידול של תאים גזע עצבי מבוגרים עם חומצה retinoic 1 μm ו 5 μm forskolin עבור 48 h כמתואר בעבר31,32.</li>
	<li>בידוד נוירונים מן היום העובריים 17 (E17) היפוקמאני של העכבר והתרבות עם מדיום נוירוסיס המכיל של 0.25% L-גלוטמין, 0.125% גלוטמקס ו 2% B27 תוספת בחממה 5% CO2 ב 37 ° צ' כמתואר לעיל33.</li>
</ol>2. הטרנס הפרזיה של העכבר
<ol><li>הכינו 10% כלוראל הידרוקסיד, 4% פאראפורמלדהיד (הכלט) ו פוספט מאגור באגירה (PBS) יום אחד לפני הניסוי, ולאחסן ב 4 ° c.</li>
	<li>מורדם בוגר זכר או נקבה C57 BL/6J עכבר עם 10% כלוראל הידרוקסיד (50 מ"ג/ק"ג, כלומר), ולהבטיח כי החיה הוא מורדם עמוקות על ידי בדיקת תגובת הגוף. תקן כל איבר בסרט דביק על לוח פלסטיק (במצב פנים-למעלה).</li>
	<li>חותכים את העור ואז את השריר עם מספריים ניתוח. פתח את חלל בית החזה. עם מספריים כירורגיים לחשוף את הלב ולחתוך חלק קטן של האטריום הימני עם מספריים כירורגית נאה.</li>
	<li>מבשם העכבר עם מזרק 10 mL חד פעמיות מחדר שמאל עם PBS קר (סביב 30 mL לעכבר למבוגרים).</li>
	<li>מבשם העכבר עם 4% בכיוון התנועה (כ -30 מ ל ב -10 דקות למבוגר) עד שהוא נוקשה.</li>
	<li>לפתוח את הגולגולת של העכבר עם מלקחיים עצם. הסירו את המוח והכניסו לתוך 5 מ ל של 4% כלפי התחתית בצינורית צנטריפוגה של 15 מ"ל לפוסט-קיבוע ב -4 ° c. הערה: לנקות את האזור כירורגי לאחר הניתוח הסתיים.</li>
	<li>לפחות 24 שעות מאוחר יותר, להעביר את דגימות המוח לתוך 30% סוכרוז פתרון להתייבשות מלאה ב 4 ° c.</li>
</ol>3. בנייה מוחית
<ol><li>הטמע את דגימות המוח בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) במיכל קטן, וצנן את הטמפרטורה ב-20 ° c לפחות 1 h.</li>
	<li>דגימות מוח מקטע בעובי של 20-40 יקרומטר עם מיקרוסטט קריוטום.</li>
	<li>לאסוף מקטעים לתוך PBS ולאחסן ב 4 ° c.</li>
</ol>4. מאימונולואובורנציה
<ol><li>לאסוף את הסעיפים עם אזורי המוח ממוקד ולשים אותם לתוך צלחת 24-היטב עם PBS. עבור תאים מתורבתים על מחליק, ללכת ישירות לשלב 4.2.</li>
	<li>לשטוף עם PBS על שייקר בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות.. חזור על זה פעמיים</li>
	<li>הסירו את ה-PBS, והתייחסו לרשימת הHCl של 1 מ' במשך 30 דקות ב-37 ° c. הערה: להכין הHCl 1 M על ידי הוספת 1 מ ל של חומצה הידרוכלורית (36-38%) לתוך 10 מ ל של מים בשכונה כימית. מחממים את הHCl 1 מ' בחממה ב 37 ° c.</li>
	<li>שטוף את הדגימות עם ה-PBS במשך 5 דקות.. חזור על זה פעמיים</li>
	<li>דגימות בלוק עם PBS המכילה 3% סרום עז רגיל 0.1% טריטון X-100 עבור 1 h על שייקר בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לילה ב -4 ° c על שייקר. הערה: השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: נוגדנים מפולי-שבטיים anti-5-הידרוקסימתילציטוסין (1:5000), העכבר נוגדן מונושבטיים אנטי NeuN (1:500).</li>
	<li>, תוציא את הדגימות. ועוד מודרות בטמפרטורת החדר לשעה</li>
	<li>שטפו את הדגימות בערוץ הPBS במשך 10 דקות.. חזור על זה פעמיים</li>
	<li>מודטה עם נוגדנים משניים המתאימים לנוגדנים העיקריים בטמפרטורת החדר עבור 1 h על שייקר. . כסו את הצלחת באלומיניום הערה: השתמש בנוגדנים המשניים הבאים: אלקסה Fluor 488 עז נגד ארנבת IgG (1:500), אלקסה Fluor 568 עז נגד עכבר מבוססי-IgG (1:500). גרעיני נגד כתמים עם 4 ′ -6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI).</li>
	<li>רחץ את הדגימות עם PBS עבור 10 דקות על שייקר. . חזור על זה פעמיים</li>
	<li>הר מקטעי המוח על השקופיות, להוסיף כמות נאותה של בינונית הרכבה antifade (סביב 100-150 μL), ולכסות עם זכוכית כיסוי פרימיום. . חותם עם לק</li>
	<li>לקחת תמונות עם מיקרוסקופ רגיל או קונפוקלית וקד הקרינה.</li>
</ol>5. דנ א גנומית בידוד
<ol><li>המתת חסד למבוגרים C57 BL/6J העכבר (זכר או נקבה) על ידי פריקה צוואר הרחם ולהסיר את המוח.</li>
	<li>מנתח את ההיפוקמפוס, הקליפה ואת הרקמות המוח על צלחת מקורר קרח. טוחנים רקמות עם מטחנת רקמות ב 1 מ ל של מאגר לפירוק DNA והעברה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נקי. הוסף 250 μg of פרוטטינואז K לכל 600 μL של מאגר הליזה. עבור כדורי תא, ישירות להוסיף מאגר הליזה, פרוטטינואז K, ו לערבב ביסודיות. הערה: הכנת מאגר לפירוק ה-DNA: 5 מ"מ EDTA, 0.2% SDS, 200 mM הנאקל ב-100 mM טריס-HCl, pH 8.5. רוחצים ומקלבים את מטחנת הרקמה לפני הניסוי.</li>
	<li>ביום השני, להוסיף כ 50 μg של RNase A לכל מדגם עבור לפחות 12 h ב 37 ° c.</li>
	<li>הוסף נפח שווה של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25:24:1) ולערבב לחלוטין.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 15 דקות, ולהסיר את supernatant לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש.</li>
	<li>הוסף 600 μL של כלורופורם ל-supernatant כדי לזרז את ה-DNA, ולערבב היטב.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 15 דקות, ולהסיר את הסופרנטנט לתוך צינור חדש אחר.</li>
	<li>הוסף 500 μL של איזופנול לסופרנטאנט, וערבב היטב.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 15 דקות, ולהסיר את supernatant לחלוטין.</li>
	<li>לשטוף את המשקעים עם 1 מ ל של 70% אתנול, צנטריפוגה ב 20,817 x g עבור 1 דקות, ולהסיר את supernatant לחלוטין. . חזור על זה פעם אחת</li>
	<li>. תייבש את הגלולה לגמרי</li>
	<li>התמוססות את הגלולה DNA עם מאגר של Tris-HCl (pH 8.5) לריכוז הנכון.</li>
</ol>6. כתם דנ א של נקודה
<ol><li>הכינו את הפתרונות: 2 M NaOH, מאגר Tris-HCl (pH 8.5), 6x מלוחים נתרן ציטראט (מתחת לס).</li>
	<li>הפוך את הדוגמה לתערובת כטבלה 1.</li>
	<li>דגימות דנ א בספרות ב 100 ° c עבור 10 דקות, ולהתקרר על קרח.</li>
	<li>חותכים את הגודל המתאים של קרום ניילון (למשל, Hybond-N +) ולשטוף עם התחנה התחתית 6x.</li>
	<li>לשים את הקרום על מכשיר כתמי נקודה ולהתחבר למשאבת ואקום. ספוט 6 μL של תערובת לכל נקודה על הקרום.</li>
	<li>Hybridize עבור 30 דקות ב 80 ° c, ולחסום את קרום לדוגמה עם חלב ללא שומן ב מלוחים באגירה Tris (TBS) עבור 1 h.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן ראשי ב 4 ° c לילה. הערה: הנוגדן העיקרי הבא: ארנב רב-שבטיים אנטי-5-הידרוקסימתיל (1:5000).</li>
	<li>ביום השני, מודפה את הקרומים לדוגמה בטמפרטורת החדר במשך 1 h. לשטוף עם TBS עבור 10 דקות. חזור על השטיפה. הזאת פעמיים יותר</li>
	<li>דגירה את הקרום עם נוגדן אנטי ארנב משני (1:5000) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף עם TBS במשך 10 דקות. חזור על השטיפה הזאת פעמיים.</li>
	<li>. ומכמת את עוצמות האות</li>
</ol>

<ol><li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li>
<li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li>
<li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li>
<li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+active+DNA+demethylation%3A+mechanism%2C+function+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li>
<li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li>
<li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li>
<li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Geneticset%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li>
<li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li>
<li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li>
<li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li>
<li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer%27s+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li>
<li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+DNA+methylation%3A+mechanisms%2C+genomics%2C+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905(2013).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
<li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li>
<li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903(2017).</li>
<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li>
<li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).</li>
<li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

לא קיימים אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שינויים אפיגנטיים לשחק תפקידים חיוניים במהלך התפתחות המוח, התבגרות, ותפקוד. כסמן יציב עבור שינוי DNA, דינמי 5-hmC מגיב לעיבוד התנהגותי, פעילות עצבית, והוא מתואם באופן חיובי עם ביטוי גנים; לכן, הוא מעורב בתפקוד תקין של המוח והפרעה נוירולוגית4. כדי לחקור את תפקידה בתאים ורקמות, יש צורך לזהות את קיומו של 5-hmC ולהשוות את הרמה לפני ואחרי הטיפול. כאן, הדגמנו שתי שיטות נוחות כדי לזהות 5-hmC בתאים ורקמות, אשר ניתן לבצע עם ציוד משותף במעבדה.
המפתח מגיב של גילוי 5-hmC עם כתמים i...

שינויים אפיגנטיים, כולל שינוי ה-DNA, שינוי היסטון ו-RNA שינוי, הוכחו לשחק פונקציות חיוניות בתהליכים ביולוגיים שונים ומחלות1,2,3, ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. במשך זמן רב, מתילציה DNA (כלומר, 5-מתיל ציטוסין (5-mC)) הוצג כסמן מאוד יציב אפיגנטי ולא ניתן לשנות עוד בגנום. לאחרונה, זה נמצא כי 5-mC יכול להיות תחמוצת ל 5-הידרוxyמתילציטוסין (5-hmc) על ידי ט (10-11 טרנסמקומות) משפחה חלבונים כולל TET1, TET2, ו TET38,9. מחקרים נוספים מראים כי 5-hmc יכול לשמש סמן יציב ולשחק תפקידים ביולוגיים באמצעות ויסות גן ביטוי4,10,11,12.
הראיות הקיימות מצביעות על כך 5-hmc הוא מועשר מאוד ברקמות הנוירואליות/תאים ביחס לסוגים אחרים של רקמות יונקים, ומציג תכונות דינמיות במהלך פיתוח עצבי13,14. במערכת עצביים, 5-hmC בתיווך אפיגנטי שינויים לשחק תפקיד חשוב בוויסות תאי גזע עצביים, פעילות עצבית, למידה וזיכרון, והוא מעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות כולל תסמונת רט, אוטיזם, אלצהיימר מחלה, מחלת הנטינגטון, וכו '2,13,15,16,17,18,19,20.
ישנן מספר גישות לגילוי 5-hmc בתאים ורקמות14,21,22,23,24. כאן, אנו מתארים שתי שיטות כדי לזהות את קיומו של 5-hmC ולכמת את הרמה הגלובלית של 5-hmC: מכתים החיסונית של כתמים ו-DNA נקודה-כתם. שתי שיטות אלה הן נוחות ורגישות, ובשימוש בהצלחה במחקרים קודמים25,26,27,28,29,30. השלבים העיקריים של שתי שיטות אלה הם denaturation DNA. עבור מכתים החיסונית של 5-hmC, טרום טיפול של דגימות עם HCl 1 M נדרש. עבור 5-hmC נקודה-כתם, דנ א הדנטורציה מבוצעת עם פתרון NaOH. שתי שיטות אלה יחד עם רצף הדור הבא הם כלים שימושיים מאוד לחקירת הפונקציה של 5-hmC.

<table><tbody><tr><td>4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop software</td><td>Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 עז נגד עכבר IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-5-הידרוקסימתילציטוזין</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat microtome</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 בינוני</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים-בסיסי</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Vector Laboratories</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>קרום ניילון (Hybond&trade;-N+)</td> <td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td>RPN303B</tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24:1)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>פולי-די-ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>חומצה</td> <td>רטינואיתסיגמא-אולדריץ'</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סולארביו</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

שינויי דנ א מרובים זוהו בגנום היונקים. מתוך זה, 5-מתילציטוסין ו-5-הידרוגרד מתילציטוסין-בתיווך מנגנונים גנטיים נחקרו באופן אינטנסיבי. 5-hydroxyמתילציטוסינוס מציג תכונות דינמיות במהלך פיתוח המוח העובריים והפוסט-לידתיים, משחק תפקיד רגולטורי בביטוי הגנים, והוא מעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות. כאן, אנו מתארים את השיטות המפורטות כולל כתמים immunofluorescence ו-DNA נקודה-כתם כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים מתורבתים ורקמות המוח של העכבר.

כדי לחשוף את ההתפלגות של 5-hmC בהיפוקמפוס של עכברים למבוגרים, ביצעו immunofluorescence עם נוגדנים נגד תאים עצביים (NeuN) ו 5-hmC. בהיפוקמפוס, 5-hmC שיתוף מקומי היטב עם סמן תא עצבי NeuN (איור 1A-H), המציעה העשרה של 5-hmc ב נוירונים.
כדי לקבוע את הדינמיקה של 5-hmC במהלך התפתחות עצבית, כתם נקודה התבצע לראשונה עם דגימות DNA מבודדים מתרבים והבדיל תאים גזע עצבי מבוגרים (NSCs). תוצאות כתמי הנקודה הראו כי הרמה הגלובלית של 5-hmC גדלה באופן משמעותי במהלך הב...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות 5-hydroxyמתילציטוסין בתאים ורקמות המוח, ניצול immunofluorescence כתמים ושיטות כתמי נקודה DNA.

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגילוי 5-hydroxymethylcytosin בתאים ורקמות המוח באמצעות immunofluorescence, השיטה החדשה, ואת כתם נקודה DNA. 5-hydroxymethylcytosin, כלומר 5hmC, שינוי אפיגנטי מקל, ממלא תפקיד חשוב בוויסות ביטוי גנים ומעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות.למעשה, השיטות שלנו ניתן להשתמש כדי לזהות 5hmC בתאים מרובים ואת הרקמות. זה נוח ו ניתן לבצע עם ציוד משותף במעבדה. התחל על ידי מיקום העכבר עם הפנים כלפי מעלה על לוח פלסטיק ותיקון כל איבר עם סרט דביק.השתמש מספריים כירורגיים לחתוך דרך העור והשרירים, ולפתוח את חלל בית החזה. לחשוף את הלב ולנתק חלק קטן של אטריום הנכון עם מספריים כירורגיים עדין. באמצעות מזרק חד פעמי 10 מיליליטר, מעוקר, לבלבל את העכבר מן החדר השמאלי עם PBS קר.לאחר מכן, לבלבל את העכבר עם 4%PFA עד שהוא נוקשה. לאחר מכן, לפתוח את הגולגולת עם מאלץ עצם ולהסיר את המוח. מניחים את המוח לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר מלא חמישה מיליליטר של 4% PFA ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.לאחר 24 שעות, מעבירים את המוח לתסיסה של 30% סוכרוז ומשאירים אותו בארבע מעלות צלזיוס להתייבשות מוחלטת. לפני החיתוך, דפק את המוח בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית וקירור למינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. דגימות מוח חתוכות בעובי של 20 עד 40 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום קריוסטט.לאסוף קטעים לתוך PBS ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס. להרים את חלקי המוח של עניין ולשים אותם לתוך צלחת 24 גם עם PBS. לשטוף חלקים עם PBS על שייקר במשך 10 דקות.מוציאים את ה-PBS ומטפלים בחומצה הידרוכלורית חד-טוחנית שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. חומצה הידרוכלורית היא קורוזיבית ובבקשה להכין אותו בהמתנה כימית. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות ולחסום אותם עם PBS המכיל 3% סרום עזים נורמלי ו 0.1% טריטון X-100.השאירו את הדגימות על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה. מוסיפים נוגדנים ראשוניים ספציפיים למקטעים ו דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר. למחרת, להוציא את הדגימות ולהשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף נוגדנים משניים. מכסים את הצלחת עם אלומיניום ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת תוך כדי רעידות. לאחר הדגירה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS ולהרים אותם על שקופיות.הוסיפו 100 עד 150 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד עמעום, מכסים בזכוכית כיסוי פרימיום וחותמים עם לק. תדמיין את חלקי המוח במיקרוסקופ רגיל או קונפוקל. כדי לבודד דנ"א גנומי, התחל על ידי ניתוח רקמות ההיפוקמפוס, קליפת המוח והקטנה על צלחת מקורר קרח.מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ תות DNA וטוחנים את הרקמות. מעבירים את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי ומוסיפים 250 מיקרוגרם חלבון-K לכל 600 מיקרוליטר של מאגר תמוגה. לאחר מכן, מוסיפים כ-50 מיקרוגרם של RNase A לדגימה ודגירה למשך 12 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, מוסיפים נפח שווה של פנול כלורופורם isoamyl אלכוהול ומערבבים ביסודיות. צנטריפוגה את התערובת על פי הוראות כתב יד ולהעביר את supernatant לצינור חדש. מוסיפים 600 מיקרוליטרים של כלורופורם לעל-טבעי, מערבבים ביסודיות וצנטריפוגה לפי הוראות כתב היד.מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש ומוסיפים 500 מיקרוליטרים של isopropanol. מערבבים ביסודיות וצנטריפוגה שוב כדי לזרז את ה-DNA. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את העל-טבעי, ושטפו את גלולת הדנ"א ב-70% אתנול בהתאם לכיווני כתב היד.אוויר לייבש את גלולת ה-DNA לחלוטין ולאחר מכן, להמיס אותו במאגר טריס-HCl. לפני ההתחלה, הכינו את הפתרונות הנדרשים ודגמו תערובת לפי הוראות כתב היד. Denature דגימת ה-DNA על ידי חימום זה 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן, למקם אותו על קרח.חותכים את הגודל המתאים של קרום ניילון ולשטוף אותו עם 6X SSC. מניחים את הממברנה על מנגנון כתם נקודה ולחבר את משאבת ואקום. ספוט שש נקודות microliter על הממברנה ולהכליל במשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, לחסום את הממברנה מדגם עם חלב ללא שומן מלוחים טריס-buffered, או TBS, במשך שעה אחת. מוסיפים את נוגדן הארנב הפולקלונאלי נגד 5-הידרוקסימטילציטוסין לממברנה ומצטיידים במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להשאיר את הממברנה מדגם בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBS.דגירה הממברנה עם נוגדן משני נגד ארנב במשך 30 דקות ולאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים עם TBS. לדמיין את אותות chemiluminescence לכמת את עוצמתם. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לדמיין 5-hydroxymethylcytosin, או 5hmC, בהיפוקמפוס של עכברים בוגרים.Immunofluorescence עם נוגדנים נגד תאים עצביים, 5hmC מגלה כי יש העשרה של 5hmC בנוירונים. דינמיקה של 5hmC במהלך התפתחות עצבית ניתן לקבוע עם מבחנה נקודה כתם של דגימות DNA מבודדים מתרבים ומובחנים תאי גזע עצביים למבוגרים. רמות גלובליות של 5hmC להגדיל באופן משמעותי במהלך ההידול ואת הרמה של 5hmC בנוירונים גבוה יותר מאשר בתאי גזע עצביים.השלב העיקרי בשיטה זו הוא לוודא כי denaturation מלא של דגימות DNA.

the-detection-5-hydroxymethylcytosine-neural-stem-cells-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

EpiMark 5-5-HMC ו MC ערכת ניתוח יכול לשמש כדי לנתח לכמת 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine בתוך מוקד spe cific. הערכה מבדיל 5-MC מתוך 5-HMC על ידי תוספת של גלוקוז אל קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC דרך התגובה האנזימטית ניצול β-glucosyltransferase (T4-BGT). כאשר 5-HMC מתרחשת בהקשר של CCGG, שינוי זה ממיר אתר cleavable MspI לאתר הלא cleavable.

רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח

תאר הוא תהליך תיוג שני שלבי שימוש (β-GT) β-glucosyltransferase להעביר תזיד-גלוקוז ל5-HMC, ואחרי לחץ כימיה להעביר מקשר ביוטין להעשרה קלה וצפיפות בלתי תלויה. שיטת תיוג יעילה וספציפית זו מאפשרת העשרה של 5-HMC עם רקע נמוך ביותר ומיפוי epigenomic תפוקה גבוהה באמצעות רצף של הדור הבא.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

מנהל של שני אנלוגים של תימידין, edu וBrdU, בעכברים בהריון מאפשר הניתוח של התקדמות מחזור התא בעצבי ובתאים במוח העכבר העוברי. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את ההשפעות של מתח genotoxic, כוללים קרינה מייננת, בהתפתחות המוח.

התקדמות מחזור תא הערכה של גזע עצבי ובתאים במוח המתפתח העכבר, למרות מתח genotoxic

כאן אנו מתארים שיטה אימונוכימית רגישה למיפוי ההתפלגות המרחבית של נגזרות חמצון 5mC המבוססת על שימוש בנוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידאז והגברת אות טירמיד.

איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

חדשות שהתגלו מחמצנים צורות של 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC) עשוי לייצג שינויים ברורים DNA עם תפקידים פונקציונליים ייחודיים. כאן מתוארת זרימת עבודה כמותית למחצה עבור ויזואליזציה של התפוצה המרחבית של oxi-mCs, פרופיל עוצמת האות ו colocalization.

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

מטרת הדו ח היא לתאר את הפרוטוקול לגילוי immunohistochemical חזקה של סמני epigenetic, 5-methylcytosine (5mC) ו- 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בפיתוח, postmitotic העכבר הרשתית.

Immunohistochemical זיהוי של 5-Methylcytosine, 5-Hydroxymethylcytosine בפיתוח ואת הרשתית העכבר Postmitotic

מבחני האימונו-פסיכוטיציה של ה-RNA המתילציה הם שיטה מבוססת נוגדנים המשמשת להעשרה עבור שברי RNA מתילציה. יחד עם רצף עמוק, זה מוביל לזיהוי של תעתיקים הנושאים את שינוי m5C.

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m5C שינוי ערבידופסיס

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

מאמר זה מתאר פרוטוקול לניטור מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה שלמים.

ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה

למד לזהות 5-hydroxymethylcytosine בתאי עצב ובמוח עכברים באמצעות צביעת immunofluorescence ו-DNA dot-blot. פרוטוקול זה מאפשר חקר שינויים אפיגנטיים במהלך התמיינות עצבית ומסייע בהבנת מנגנוני מחלות נוירולוגיות.

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

גלה סרטונים נוספים