כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

ההשלכות של מוטציות על ביטוי גנים מוערכות לעתים קרובות באופן איכותי על ידי היברידיזציה situ ובדרך כלל הבקיע חזותית, אשר סובייקטיבי מוטה על ידי הציפיות של החוקר. שיטה זו מספקת דרך עקבית יותר להשוות בניסויי situ על ידי כימות התעצמות התמונה והסרת הטיה זו. זה יכול גם להיות מותאם בקלות למערכות מודל אחרות שמשתמשות בהכלאה situ כקורא של ביטוי גנים.

התחל על ידי הדמיה של עוברים היברידיים-או מוכתמים ISH. מכינים תסכול גליצרול ומערבבים אותו להומוגניזציה. מעבירים את העוברים לתסכול גליצרול עם פיפטה פסטר שלושה מיליליטר ולהשאיר אותם להסתפק לפחות חמש דקות.

הכן ותייג מספיק צינורות PCR כדי להעביר את העוברים מוכתמים ISH לאחר הדמיה, ולאחר מכן להשתמש פיפטה פסטר שלושה מיליליטר להוסיף 100% גליצרול לתחתית של שקופית דיכאון זכוכית. מעבירים עובר בודד עם ויטראז’ איש למגלשת הזכוכית ומכווןים אותו תחת מיקרוסקופ סטריאו המצויד במצלמה דיגיטלית ותאורה תחתונה וטופ. בעזרת העובר הראשון, התאימו את זמן התאורה והחשיפה בהגדלה הרצויה.

תדמיין מספר עוברים רבים כנדרש ותייג כל תמונה במספר ייחודי. לאחר הדמיה, להעביר כל עובר לצינור PCR שכותרתו עם אותו מספר ואם יש צורך לשאיף את גליצרול עודף מצינורות PCR. כדי לחלץ את ה- DNA, להוסיף 40 עד 75 microliters של מאגר תזה אלקליין כגון HoTSHOT לכל צינור.

דגירה הצינורות ב 95 מעלות צלזיוס במשך כ 30 דקות ולאחר מכן לקרר אותם לארבע מעלות צלזיוס. הוסף נפח שווה של מאגר נטרול ולהמשיך עם genotyping עבור המוטציה של עניין. כדי לבצע ניתוח תמונה, בחר פתח את התמונה בפיג’י והפוך אותה על-ידי לחיצה על ערוך ולאחר מכן הפוך, ולאחר מכן המר את סוג התמונה ל- 8 סיביות על-ידי לחיצה על הכרטיסיה תמונה, בחירה באפשרות סוג ובחירה ב- 8 סיביות.

בחרו בכלי מצולע וציירו ידנית את אזור העניין או ה-ROI בתמונה מסביב לאזור המכיל את אות ה- ISH שיש למדוד. הקש T כדי לפתוח את מנהל ההשקעות (ROI Manager) ולבחור את אזור העניין ולאחר מכן לחץ על מדידה. העתק את הערך הממוצע מחלון התוצאות לגיליון אלקטרוני.

כדי למדוד את עוצמת הרקע, העבר את ההשקעה לאזור בעובר ללא כתמים ולחץ על הוסף במנהל ההשקעות. בחר את אזור הרקע ולחץ על מדידה ולאחר מכן רשום את ערך העוצמה הממוצע בגיליון האלקטרוני. השג את עוצמת הפיקסל הממוצעת של אות ההכלאה NC2 על-ידי חיסור עוצמת הממוצע של הרקע מזה של האזור המוכתם.

לאחר קביעת עוצמת הפיקסל הממוצעת של כל דגימה, הקצו גנוטיפ לכל דגימה. אם לא ניתן לקבוע את הסוג, אל תכלול את המדגם בניתוח הבא. מיין את ערכי עוצמת המדגם הממוצעים לפי גנוטיפ והמשך בבדיקות סטטיסטיות.

התועלת של טכניקה זו הוכח על ISH עבור dnmt3bb. 1 בעוברים מ- incross הטרוזיגוס runx1. ירידה ב-dnmt3bb.

ביטוי אחד זוהה במוטנטים הומוזיגים runx1 בעוד עוברים הטרוזיגים לא הראו הבדלים משמעותיים dnmt3bb. ביטוי אחד. כאשר מנסים לקבוע את ההשפעה של מוטציה lmo4 על ביטוי runx1, ניתוח זה לא הראה הבדלים משמעותיים בביטוי בין סוג הבר מוטציות lmo4 הומוזיגוס.

עם זאת, ירידה קטנה בביטוי runx1 זוהתה על ידי qPCR עובר יחיד. בכ-0.4% מהעוברים הנחויים של runx1, ל-ISH היה רקע גבוה שהסתיים במספר שלילי כאשר הוא הוחסך מהאות. במקרים כאלה, העוברים לא נכללו בניתוח.

ארבעה אזורים שונים על העוברים נבדקו כדי לייעל תיקוני רקע. אמנם היה הבדל יציב יחסית בעוצמת ההשקעה בכל אחד מאזורי הרקע, R3 תמיד הראה עוצמה גבוהה יותר מאשר ROI ואין להשתמש בו לתיקון רקע. R1 ו- R4 הוכיחו את עצמם כתחומים המתאימים ביותר לתיקון רקע.

חשוב למצוא את התנאים הטובים ביותר עבור ההדמיה ולשמור אותם ללא שינוי לאורך כל הניסוי. מומלץ גם לכמת את עוצמת הפיקסל לפני הקצאת גנוטיפ לכל דגימה.