כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה
28 בינואר 2020
טכנולוגיות לעריכת גנים אפשרו לחוקרים ליצור מוטציות דג זברה לחקור פונקציה גנטית בקלות יחסית. כאן, אנו מספקים מדריך לבצע היפוך העובר מקבילי וכימות של אותות היברידיזציה באתרו ב zebrafish. גישה זו לא משוחדת מספק דיוק גדול יותר בניתוחים פנוטיניים המבוססים על היברידיזציה באתרו.
ההשלכות של מוטציות על ביטוי גנים מוערכות לעתים קרובות באופן איכותי על ידי היברידיזציה situ ובדרך כלל הבקיע חזותית, אשר סובייקטיבי מוטה על ידי הציפיות של החוקר. שיטה זו מספקת דרך עקבית יותר להשוות בניסויי situ על ידי כימות התעצמות התמונה והסרת הטיה זו. זה יכול גם להיות מותאם בקלות למערכות מודל אחרות שמשתמשות בהכלאה situ כקורא של ביטוי גנים.
התחל על ידי הדמיה של עוברים היברידיים-או מוכתמים ISH. מכינים תסכול גליצרול ומערבבים אותו להומוגניזציה. מעבירים את העוברים לתסכול גליצרול עם פיפטה פסטר שלושה מיליליטר ולהשאיר אותם להסתפק לפחות חמש דקות.
הכן ותייג מספיק צינורות PCR כדי להעביר את העוברים מוכתמים ISH לאחר הדמיה, ולאחר מכן להשתמש פיפטה פסטר שלושה מיליליטר להוסיף 100% גליצרול לתחתית של שקופית דיכאון זכוכית. מעבירים עובר בודד עם ויטראז' איש למגלשת הזכוכית ומכווןים אותו תחת מיקרוסקופ סטריאו המצויד במצלמה דיגיטלית ותאורה תחתונה וטופ. בעזרת העובר הראשון, התאימו את זמן התאורה והחשיפה בהגדלה הרצויה.
תדמיין מספר עוברים רבים כנדרש ותייג כל תמונה במספר ייחודי. לאחר הדמיה, להעביר כל עובר לצינור PCR שכותרתו עם אותו מספר ואם יש צורך לשאיף את גליצרול עודף מצינורות PCR. כדי לחלץ את ה- DNA, להוסיף 40 עד 75 microliters של מאגר תזה אלקליין כגון HoTSHOT לכל צינור.
דגירה הצינורות ב 95 מעלות צלזיוס במשך כ 30 דקות ולאחר מכן לקרר אותם לארבע מעלות צלזיוס. הוסף נפח שווה של מאגר נטרול ולהמשיך עם genotyping עבור המוטציה של עניין. כדי לבצע ניתוח תמונה, בחר פתח את התמונה בפיג'י והפוך אותה על-ידי לחיצה על ערוך ולאחר מכן הפוך, ולאחר מכן המר את סוג התמונה ל- 8 סיביות על-ידי לחיצה על הכרטיסיה תמונה, בחירה באפשרות סוג ובחירה ב- 8 סיביות.
בחרו בכלי מצולע וציירו ידנית את אזור העניין או ה-ROI בתמונה מסביב לאזור המכיל את אות ה- ISH שיש למדוד. הקש T כדי לפתוח את מנהל ההשקעות (ROI Manager) ולבחור את אזור העניין ולאחר מכן לחץ על מדידה. העתק את הערך הממוצע מחלון התוצאות לגיליון אלקטרוני.
כדי למדוד את עוצמת הרקע, העבר את ההשקעה לאזור בעובר ללא כתמים ולחץ על הוסף במנהל ההשקעות. בחר את אזור הרקע ולחץ על מדידה ולאחר מכן רשום את ערך העוצמה הממוצע בגיליון האלקטרוני. השג את עוצמת הפיקסל הממוצעת של אות ההכלאה NC2 על-ידי חיסור עוצמת הממוצע של הרקע מזה של האזור המוכתם.
לאחר קביעת עוצמת הפיקסל הממוצעת של כל דגימה, הקצו גנוטיפ לכל דגימה. אם לא ניתן לקבוע את הסוג, אל תכלול את המדגם בניתוח הבא. מיין את ערכי עוצמת המדגם הממוצעים לפי גנוטיפ והמשך בבדיקות סטטיסטיות.
התועלת של טכניקה זו הוכח על ISH עבור dnmt3bb. 1 בעוברים מ- incross הטרוזיגוס runx1. ירידה ב-dnmt3bb.
ביטוי אחד זוהה במוטנטים הומוזיגים runx1 בעוד עוברים הטרוזיגים לא הראו הבדלים משמעותיים dnmt3bb. ביטוי אחד. כאשר מנסים לקבוע את ההשפעה של מוטציה lmo4 על ביטוי runx1, ניתוח זה לא הראה הבדלים משמעותיים בביטוי בין סוג הבר מוטציות lmo4 הומוזיגוס.
עם זאת, ירידה קטנה בביטוי runx1 זוהתה על ידי qPCR עובר יחיד. בכ-0.4% מהעוברים הנחויים של runx1, ל-ISH היה רקע גבוה שהסתיים במספר שלילי כאשר הוא הוחסך מהאות. במקרים כאלה, העוברים לא נכללו בניתוח.
ארבעה אזורים שונים על העוברים נבדקו כדי לייעל תיקוני רקע. אמנם היה הבדל יציב יחסית בעוצמת ההשקעה בכל אחד מאזורי הרקע, R3 תמיד הראה עוצמה גבוהה יותר מאשר ROI ואין להשתמש בו לתיקון רקע. R1 ו- R4 הוכיחו את עצמם כתחומים המתאימים ביותר לתיקון רקע.
חשוב למצוא את התנאים הטובים ביותר עבור ההדמיה ולשמור אותם ללא שינוי לאורך כל הניסוי. מומלץ גם לכמת את עוצמת הפיקסל לפני הקצאת גנוטיפ לכל דגימה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לגנוטיפיקציה מקבילית של עוברים וכמותית של אותות היברידיזציה במקום (in situ hybridization) בדגי zebrafish. באמצעות גישה בלתי מוטה זו, חוקרים יכולים להשיג דיוק רב יותר בניתוחים פנוטיפיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- טכנולוגיות לעריכה גנומית מקלות על יצירת מוטנטים של דג הזברה.
- הibridiზציה במקום (In situ hybridization) היא שיטה נפוצה להערכת ביטוי גנים.
- שיטות דירוג מסורתיות עלולות להוביל להטיה ולסובייקטיביות.
- מחקר זה נועד לספק גישה עקבית וכמותית יותר.
מטרת המחקר
- לשיפור הדיוק של ניתוחים פנוטיפיים בדג זבברה.
- לספק שיטה סטנדרטית לגנוטיפ שלו של עוברים.
- לכימות אובייקטיבית של אותות היברידיזציה in situ.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימוי של עוברי עוברים שנצבעו ב-ISH באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
- הכנת תמיסות גליצרול להעברת עוברים.
- שימוש במבחנה של בופר ליזיס בסיסי (alkaline lysis buffer) להפקת DNA.
- שימוש בתוכנת Fiji לניתוח תמונות וכבישויות.
תוצאות עיקריות
- הוכח כי קיים ירידה בביטוי של dnmt3bb.1 במוטנטים הומוזיגוטים של runx1.
- זוהו אזורים מתאימים לתיקון רקע לצורך ניתוח תמונות.
- לא נצפו הבדלים משמעותיים בביטוי בין סוג בר (wild type) לבין מוטנטים הומוזיגוטים של lmo4.
- סופקה שיטה מהימנה לקביעת גנוטיפים על בסיס עוצמת פיקסלים.
מסקנות
- השיטה משפרת את מהימנות ניתוח ביטוי הגנים.
- ניתן להתאימה לשימוש במערכות מודל אחרות.
- שמירה על תנאי דימות עקביים היא קריטית להשגת תוצאות מדויקות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח היברידיזציה in situ כמותי מפחית את הסובייקטיביות בהערכת ביטוי גנים, ובכך משפר את אמינות הנתונים לאישור מטרות במודלים של zebrafish. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות למתאם בלתי מוטה בין הגנוטיפ לדפוסי ביטוי פנוטיפיים. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבים המוקדמים של הגילוי באמצעות אספקת מדידות סטנדרטיות וניתנות לשחזור על פני דגימות בעלות גנוטיפ מעורב.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות בלתי מוטה של אותות ביטוי גנים המוגבלים מרחבית.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה עקבית להשוואה בין פנוטיפים של מוטנטים לבין פנוטיפים של סוג בר (wild-type) ללא הטיות של הצופה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין שינויים משמעותיים בביטוי לבין רעש רקע במודלים גנטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור סריקת תרכובות בהמשך, על ידי קביעת פרופילי ביטוי בסיסיים.
- שחזור: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולי רכישת תמונות וניתוח כדי למזער שונות בין ניסויים.
- פלט כמותי: מייצר נתוני עוצמת פיקסלים מדידים המתאימים להשוואה סטטיסטית בין קבוצות הטיפול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: שומרת על עקביות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות שימוש במדדים פנוטיפיים אובייקטיביים.
- סנכרון ביומרקרים: מקלה על המתאם בין שינויים בביטוי גנים למצב הגנוטי לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- החלטות מותאמות סיכון: מאפשרת קבלת החלטות מבוססת נתונים לגבי קידום הפיתוח על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות במחקרי תיקוף מטרות.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי העבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור אישור גנוטי להערכה פנוטיפית כמותית, ובכך היא תומכת בזיהוי מועמדים מובילים (leads) באמצעות הפחתת סיכונים מבוססת מנגנונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי אספקת נתונים כמותיים על התפלגות mRNA להבהרת תפקוד גנים במסלולי התפתחות.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות תנאי דימות ואנליזה הניתנים לשחזור להערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות עצימות כמותיות וערכים לאחר הפחתת רקע, המאפשרים השוואה סטטיסטית של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי הגילוי לרצף פרה-קליני על ידי הבטחת דירוג פנוטיפי עקבי בין מערכות מודלים שונות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לגנוטיפיקה וכימות, הישימה לגנים ולקווי מוטנטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בנתוני ביטוי גנים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול בעוברים ולניתוח תמונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתונים אובייקטיביים להקצאת הון בתוכניות בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון על ידי הבחנה בין השפעות ביולוגיות אמיתיות לבין שונות טכנית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעוברי דגי zebrafish, במיקרוסקופיה ובטכניקות בסיסיות של גנוטייפינג.
- תלוי במיקרוסקופ סטריאו עם יכולות דימיון דיגיטלי ובתוכנת Fiji לצורך ניתוח.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי ההדמיה, זמני החשיפה ואזורי תיקון הרקע.
- כולל שיקולי התאמה עבור זני zebrafish שונים ושלבי התפתחות שונים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון אופטימיזציה של תיקון הרקע והדרה של דגימות עם גנוטייפים לא מוגדרים או רעשי רקע גבוהים.
