גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

היכולת לכמת שינויים במורפולוגיה של רקמות ואברונים חשובה להבנת תפקוד הגנים, כמו גם להשפעה של מוטציות גנטיות. הפרוטוקולים שלנו מסבירים כיצד ניתן להשתמש בתוכנה הזמינה באופן חופשי להערכת המורפולוגיה של הסינפסות, השרירים והמיטוכונדריה בנימטודה, C.elegans. מחקרים קודמים רבים הסתמכו על שיטות איכותיות להשוואת שינויים מורפולוגיים.

עם זאת, אלה יכולים להיות בעייתיים כפי שהם לא יכולים ללכוד הבדלים פנוטיפיים עדינים, עשויים להמעיט ולהמעיט בערכם של שינויים, והם מוערכים באופן סובייקטיבי. השיטות הכמותיות שלנו מספקות אמצעים חזקים יותר ופחות מוטים להערכת שינויים מורפולוגיים. שיטות אלה יכולות לשמש בקלות לחקר שינויים מורפולוגיים במבנים תאיים אחרים או באורגניזמים מודליים אחרים על מנת להגדיר את תפקוד הגנים ואת ההשלכות של מוטציות הקשורות למחלות.

התחל בהכנת שקופיות להדמיה. מניחים טיפה של אגוז נמס על מגלשת מיקרוסקופ ומיד ללחוץ במורד טיפה עם שקופית מיקרוסקופ אחרת, בעדינות לשטח את agarose. השאירו את ההתעוררות להתייבש במשך דקה אחת ואז בזהירות להפריד את שתי השקופיות ולהשאיר את כרית מוצק על אחת השקופיות.

מניחים את השקופית על שלב המיקרוסקופ ומוסיפים טיפה של חמישה עד 10 מיליליטר של הרדמה למרכז כרית אגרוז. השתמשו בבחירה מעקרת חום כדי להעביר במהירות 10 עד 15 בעלי חיים מצלחת המניות לירידה ההרדמה לפני שהפתרון מתייבש. לאחר מכן להחיל כיסוי על ידי מיקום זה ממש מעל כרית אגרוז בעדינות להפיל אותו.

צלמו את האזורים הסינפטיים עם מיקרוסקופ קונפוקלי סורק קו יחד עם לייזר דיודה חצי מוליך 488 ו-552 ננומטר עם משאבה אופטית ומצויד בתוכנת לכידת תמונה. לאחר איתור התולעים, עברו להגדלה של פי 40 והחלו מדיום טבילה. דמיינו את האזור הסינפטי על ידי ומרגש את הפלואורופורים עם לייזר 552 ננומטר, 1% כוח עבור פלואורופור tagRFP, ו 488 ננומטר, 2% כוח עבור פלואורופור GFP.

ללכוד תמונות באמצעות photodetector היברידית ולהגדיר את הרווחים כדי למנוע תפוקת יתר של הפלואורופורים. לאסוף תמונות מחסנית Z כדי לכסות את הסינפסה כולה באמצעות גודל Z-צעד אופטימלי בהתאם למטרה. כדי לנתח את האזור הסינפטי להתחיל על ידי טעינת התמונות לתוך תוכנת CellProfiler 3.1.5.

הגדר את מודול NameAndType וקבע את האזור הסינפטי בהגדרת יד באמצעות tagRFP המפוזרים המובעים מהמשדר UIS-115. למדוד את הגודל ואת הפלואורסצנטיות של הסינפסה המוגדרת ביד על ידי הוספת מודולים MeasureObjectSizeShape ו MeasureObjectIntensity לצינור. לאחר מכן לחשב את עוצמת פלואורסצנטיות משולבת יחסית על ידי הוספת מודול CalculateMath וחלוקת יחידות אינטנסיביות משולבת המתקבל JSIS37 על ידי אלה המתקבלים UIS-115.

לאחר שתסיים לייצא את כל המדידות והחישובים. כדי למדוד את אזור תא השריר לפתוח את התמונה בתוכנה פיג'י ולהשתמש בחירת מצולע בזהירות לעקוב אחר סביב תא שריר אלכסוני יחיד. כוונן את קו המצולע בסוף על-ידי גרירת נקודת העיגון כדי לשפר את העקיבה.

נווט אל הכרטיסיה ניתוח בחלק העליון של התוכנה ולחץ על מדידה כדי לחשב את האזור הנבחר. לתאי שריר עם אזור מנוון או חסר, עקבו אחר האזור החסר בעזרת כלי בחירת המצולע ולחצו שוב על 'מדוד'. אם קיימים רווחים מרובים, עקוב אחר כל אחד מהם בנפרד.

חשב את היחס בין אזור הפער לאזור התא כולו. יחס גבוה מצביע על מידה גבוהה יותר של ניוון שרירים. ואם אין אזורים חסרים, היחס מחושב כאפס.

פתחו את 'אלסטי' ובחרו 'סיווג פיקסלים' תחת 'צור פרוייקט חדש'. לאחר מכן שנה את שם הפרוייקט ושמור אותו. נווט אל הכרטיסיה נתוני קלט ולחץ על הוסף חדש ולאחר מכן הוסף תמונות נפרדות.

הפנה את החלון המוקפץ לתיקיה באמצעות קובצי TIF ובחר את התמונה הרצויה. בכרטיסיה בחירת תכונות, לחץ על בחירת תכונות כדי לבחור את כל תכונות הפיקסלים שצוינו על-ידי התיבות הירוקות המתקתקות. בחירת הפיקסלים בשלב זה משמשת להבחנה בין מחלקות הפיקסלים השונות בשלב הבא.

השתמש בלוח הדרכה כדי להבחין בין תריסי מיוסין המבטאים GFP בודדים לבין רקע לא רצוי. לחץ על הוספת תווית וללחוץ רקעים לא רצויים רווחים בין הכלים כדי להתחיל אימון מסווג. הוסף תווית שניה, שנה את שמה ל-Filament ו שרבט על מספר תריסים.

לחץ על עדכון חי כדי לוודא שהסיווג נעשה כראוי. במידת הצורך, להוסיף שרבטים נוספים כדי לכוונן את האימון. לאחר ביצוע מסווג האימון, עבור לחלונית 'ייצוא חיזוי' ולחץ על 'בחר ייצוא הגדרות תמונה' עם הסתברויות כמקור.

ודא שרגומי המשנה של החיתוך x ו- y מסומנים ו- c אינו מסומנים. בחר אפס ואחד כערכי התחלה ועוקצת עבור c והמרת סוג נתונים ל- 8 סיביות לא חתומות. סמן מחדש ולאחר מכן שנה את סרטון הווידאו של קובץ הפלט ל- png, ושנה את שם הקובץ והספריה כרצונך.

סגור את החלון הגדרות ייצוא וייצא את התמונה שזה לא מפולח זה לזה. לאחר מכן פתח את קובץ png בתוכנת פיג'י. התאימו את סף התמונה בעזרת קביעות ברירת המחדל והחלת תוסף השלד, שייצור טבלת תוצאות נפרדת.

פרוטוקול זה שימש כדי לחקור את הפונקציה של אלפא-טובלין אצטילטרנספראז MEC-17 בפיתוח סינפסה. ניתוח כמותי של תמונות של microtubule האחורי / בצד השני או סינפסות PLM עולה כי לחץ יתר של MEC-17 משבש את תפקוד נוירון נורמלי. בהשוואה לבעלי חיים בקרת סוג הבר overexpressing MEC-17 הפחיתו באופן משמעותי אזורים presynaptic ושלמות סינפטית.

טכניקות אלה שימשו גם כדי לנתח מודלים C.elegans של Charcot-Marie-Tooth סוג 2 או CMT2 נושא מוטציות בגנים הקשורים CMT2. הערכה חזותית של מורפולוגיה של שרירי הגוף גילתה עלייה של פי 2.5 עד 3.5 במומים בבעלי החיים במבחן בהשוואה לבקרת סוג הבר. בעלי חיים עם מוטציות ב-fzo-1 וב-unc-116 חוו אובדן של סטריטיס שרירים, הצטברות של פסולת תאית והתנוונות סיבי שריר.

בעוד שבעלי חיים עם מוטציות ב- dyn-1 חוו באופן משמעותי פחות פגמים במורפולוגיה של השרירים. המוטנטים fzo-1 ו- unc-116 הציגו עלייה של פי חמישה עד שישה ביחס הפער לאזור תא יחיד כולל ואורך סיבים ממוצע קצר באופן דרמטי בהשוואה לבעלי חיים מסוג בר. כדי לבצע השוואות בין דגימות חשוב לקבוע את התנאים האופטימליים ביותר לרכישת תמונה, ולהבטיח שתנאים אלה ישמשו באופן עקבי.

טכניקות אלה יאפשרו לחוקרים להשוות שינויים מורפולוגיים על פני רקע גנטי שונה עם גישות כמותיות. פעולה זו מפחיתה את הסובייקטיביות ולכן מסייעת לשפר את יכולת הייצוג של הנתונים הנוצרים.