אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

פרופיל של מיקרוביום הוא הצעד הראשון לקראת הגדרת התפקיד של מיקרוביום בבריאות ומחלות. כאן, אנו מתארים הליך פשוט לבודד DNA חיידקי באיכות גבוהה מדגימה צואה הכנת הספרייה, ביצוע 16SR RNA רצף מטא גנומי וניתוח נתונים מיקרוביום. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים חדשים בתחום המיקרוביום, כמו גם לחוקרים העובדים בתחום המיקרוביום בהקמת צינור המיקרוביום במעבדה שלהם. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עבור פרופיל של מיקרוביום מדגימות ביולוגיות אחרות כגון דגימות האף, הפה או העור של בעלי חיים ונבדקים אנושיים. קטיף חרוזים הוא הצעדים החשובים ביותר גם כאשר כל השלבים במורד הזרם תלויים בדנ”א באיכות גבוהה. איטום נכון של צלחת שימור חשוב כמו איטום שלם עלול להוביל לדיכוי של מוצר מוגבר וכתוצאה מכך נתוני רצף באיכות נמוכה. כדי להתחיל, לעקר את תיבות המפריד עם 70% אתנול. מניחים את העכברים בקופסאות מחיצה מעקרות ומאפשרים להם לעשות את צרכיהם כרגיל עד שעה. השתמש מדפים סטריליים כדי לאסוף את כדורי צואה בצינור ריק מראש שכותרתו 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגה. תסגור את הצינור בצורה מאובטחת. לעקר את המדפים עם 70%אתנול, ואחריו מגבון חד פעמי germicidal, לאחר איסוף צואה מכל עכבר. שוקלים 200 מיליגרם של כדורי צואה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר, עם 0.1 מיליליטר בחנורי זכוכית, ומ מניחים את צינור חרוז לתוך חרוז להכות homogenizer ולהומוגניזציה הדגימות במשך 45 שניות בטמפרטורת החדר, במהירות של 4.5 מטרים לשנייה. לחלץ DNA לפי הוראות של יצרן הערכה ולחמק DNA בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר בידוד ה-DNA, לכמת את ה-DNA מבודד על ידי טעינת 1 microliter של ה-DNA על פלואורומטר. התקנה 16S ריבוזומלי RNA גנים הגברה PCR1 בצלחת PCR 96-Well, באמצעות נפח תגובה 25 מיקרוליטר. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 40 ננו גרם של DNA, 13.5 מיקרו ליטר של 2X תערובת אנזים פולימראז בנאמנות גבוהה, המכיל חיץ, בתוספת DNTPs קדימה ואחורי פריימר. לאטום את לוח PCR כראוי מלמעלה למטה לאורך כל ארבעת הקצוות. וצנטריפוגה ב 1000 פעמים G ב 20