מערכת בודדת של תא להערכת בקרה מכנית של התנועה הסלולרית ואירועי איתות קשורים

יש הערכה גוברת להשפעה של המיקרו-וירוס המכאני על איתות סלולרי והגירה. מחייב שימוש בגישות ניסיוניות וייחודיות כדי לספק גירוי מכני לתא בודד. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה דינמית של סביבת המיקרו המכנית מתחת לתא בזמן אמת.

המאפשר התבוננות בשינויים מוסדרים מכנית בהתנהגות נדידת תאים, ואירועי איתות תת-תאיים. הדגימה של ההליך איתי תהיה נילה נעים, פוסט-דוקטורט וג'ונתן פטרסון, טכנאי מהמעבדה שלנו. התחל על ידי שימוש Chorono-1 כדי להפעיל את משטח הזכוכית של כל להחליק כיסוי התחתון במשך 20 שניות, לפני הנחת יתר מיד 50 microliters של פתרון עבודה סילאן לאגד על כל להחליק כיסוי.

אפשר לפתרון להתייבש במשך 10 דקות לפני שטיפה הכיסוי מחליק פעמיים עם 95% אתנול פעמיים עם isopropanol. לאחר מכן, לאפשר את החלקות הכיסוי לאוויר יבש במשך כ 20 דקות. עבור תצהיר מיקרו-חרוזים פלואורסצנטי, תחילה sonicate פתרון מיקרו חרוזים עובד במשך שעה אחת.

15 דקות לפני תום sonication, מניחים את הכיסוי מופעל מחליק אנכית במחזיק כיסוי קרמיקה להחליק ולהעביר את המחזיק לתוך מנקה פלזמה שולחן העליון לטיפול פלזמה אוויר חדר במשך שלוש דקות. לאחר מכן, מניחים חתיכות של סרט פרפין במכסי צלחת פטרי 60 מיליליטר, וממקמים את כיסוי מחליק על הסרטים, הקשה קלה על כל להחליק כיסוי כדי להבטיח מגע טוב בין הסרט ואת coverlip. לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של פתרון חרוזים עובד לראש כל כיסוי, ומיד לשוגם את פתרון אתנול מהצד של coverslips, משאיר את חרוזים על כיסוי.

כדי להטיל את Hydrogels מיד לאחר ההכנה שלהם, להוסיף טיפה 25 microliter של פתרון הידרוג'ל לצד הפעיל של כל כיסוי התחתון, ומיד להפוך את כיסויי העליון חרוזים, צד חרוז למטה, על טיפה. אפשר לג'לים לעשות פולימריזציה במשך 30 דקות לפני השימוש במדפים כדי להסיר בעדינות את הכיסויים. לאחר מכן, לשטוף את הג'לים עם שלוש, חמש דקות שוטף טרי 50 miliMoler Hepes לכל לשטוף.

כדי להפעיל את משטחי הידרוג'ל, הדגירה את הג'לים טריים 50 miliMoler Hepes, בתוספת 0.4 miliMolar Sulfo Sanpah, ומיד לחשוף את הג'לים למנורת קשת אולטרה סגולה באזור סגור במשך 90 שניות. בסוף ההפעלה, לשטוף את הג'לים עם שלוש, חמש דקות שוטף ב Hepes טרי, ולטפל הידרוג'לים מופעל עם 20 מיקרוגרם למיליליטר של fibronectin במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, שאפו את תוסף הפיברונקטין העודף, ושטפו את הג'לים שלוש פעמים ב- PBS במשך חמש דקות לכביסה.

לאחר הכביסה האחרונה, מניחים את Hydrogels בנפח קטן של PBS ולעקר את הג'לים במשך 15 דקות תחת אור אולטרה סגול במכסה המנוע של תרבות הרקמה. לאחר מכן, לשטוף את הג'ל פעם אחת PBS טרי. עבור ציפוי תאים, זרע 2.1 פעמים 10 ארבעת התאים של עניין בשלושה מיליליטר של בינוני לכל הידרוג'ל ולאפשר לתאים לדבוק ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד 18 שעות.

בעוד התאים הם שיווי משקל, להשתמש מושך מיקרו פיפטה למשוך קוטר של מילימטר אחד על ידי 100 מילימטר ארוך borosilicate זכוכית מיקרו פיפטה, כדי לקבל מתחדד של מעל שני מילימטרים המפחית כ 50 מיקרומטר קוטר במילימטר הראשון, ומתרחב צינור ארוך, מקביל 10 מיקרומטר קוטר במילימטר האחרון. לאחר מכן, לטעון את פיפטה לתוך microforge ולעצב את פיפטה יש קצה קהה 15 מיקרומטר כי הוא מוקף ממש בסוף קטע 250 מיקרומטר, כפוף בערך 35 מעלות מלאך משאר פיפטה. הקוטר המשוער בעיקול צריך להיות סביב 30 מיקרומטר כדי להשאיל כוח לקצה.

לאחר מכן, מניחים הידרוג'ל על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. מכסים את המדיום בשמן מינרלי ולבחור את המטרה 10x. יש לעקר את המיקרו-פיפטה המוכנה ב-70% אלכוהול.

לאחר מכן, הכנס לתוך מחזיק מיקרו פיפטה עם הוו הצביע לכיוון המנה, ולהשתמש מניפולטור כמובן כדי להוריד את פיפטה עד הקרס רק נוגע על פני השטח של הנוזל. למקד את המיקרוסקופ על התאים דבק בחלק העליון של הג'ל, ולדאוג כי המטרה היא לא בסכנה של להכות את המדגם או השלב, להביא את המיקוד מעל הג'ל כדי למצוא את קצה המיקרו פיפטה. סובבו את הפיפסה עד שהקצה יצב למישור המוקד, כך שהקצה הקהה של המיקרו-פיפטה מצביע כלפי מטה, והתמקדו מחדש בקצה הפיפסה לפי הצורך.

התמקדו בחזרה לשכבת התא כדי לאמוד עד כמה רחוקה הפיגט מפני הג'ל, והתמקדו בחזרה למישור שהוא בחלקו בין הג'ל לקצה הפיפיט. לאחר מכן, הורידו לאט את הפיגט כדי להגיע למישור מוקד הביניים, והגדילו את ההגדלה למה שישמש בניסוי, לפני שתנמיך את הפיפיטה עד שתרחף ממש מעל פני השטח של ההידרוגל. עבור כיול מיקרו מניפולטור, תמונה אזור נטול תאים, אזור עם חרוזים, אבל לא מניפולציה, עם פיפטה העוסקים בג'ל, ועם פיפטה עוסקת מושך את הג'ל.

לאחר מכן, השתמש בתמונה J כדי להשוות את שדות ללא חרוזים לשדות חרוזים ללא מעורבות, שדות חרוזים עם ג'ל עוסק, ואת הג'ל משך כדי לחשב את תזוזות חרוזים יחסי כוח להחיל על הג'לים. כדי לבצע בדיקה durotaxis, לפקח על קבוצה של תאים במשך 30 דקות כדי לזהות תאים הנעים בצורה מכוונת. בחר תא הנע בהתמדה בכיוון אחד ונטר את התאים בקצב המסגרות הרצוי למשך 30 דקות נוספות.

לאחר מכן, מקם את הפיפיטה כ-50 מיקרומטרים לפני הצד הקרוב של הקצה המוביל של התא הנבחר, והזז את המיקרו-מניפולטור כך שהג'ל מעוות אורתוגונלית לכיוון הנסיעה של התא. לאחר מכן, להתבונן בתא לאורך זמן כפי שהוא מגיב חריפה, שיפוע מקומי של נוקשות הידרוג'ל. באמצעות טכניקה זו כפי שהודגם, פיברובלסטים עובריים חולדה לנוע לכיוון הנוקשות המוגברת שיפוע מיושם על ידי מיקרו פיפטה זכוכית.

תאים פיברובלסט עובריים חולדה, מבטאים באופן חולף חיישן מתח וינקולין על 125 ג'לים פוליאקרילמיד קילופסקל גם להדגים את היווצרות הידבקויות מוקד בכיוונים של למתוח על פני תקופה של 40 דקות. ניתוח Forster תהודה העברת אנרגיה מגלה כי וינקולין מקומי הידבקויות מוקד חווה שינוי מיידי במתח, כאשר מוצג עם גירוי durotactic חריפה. הרחבת התועלת של תצפית זו לתצפית על אירועי איתות תת-תאיים, בתגובה לגירוי דורודקטי.

אם אתה עושה ניסיונות מרובים למתוח תא, או אם המיקרונידל מחליק במהלך ההתקנה, התחל מחדש עם תא חדש כדי למנוע הענקת גירויים מרובים, משתנים ומכאניים. מעבר לתועלת שלה להתבונן durotaxis, טכניקה זו יכולה להיות משולבת עם גישות גנטיות, כגון biosensors, RNAI, או עריכת גנים כדי לעזור לתאר את המנגנונים המולקולריים המעורבים mechanotransduction.