Name: הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למד את פרוטוקול מבחן NADH-coupled ATPase מותאם לסינון מולקולות קטנות של מעכבי מיוזין בפורמט 384-well. שיטה זו מאפשרת מחקר ביוכימי ופיתוח תרכובות קליניות בייעול גבוה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענק מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ המכון הלאומי על התעללות בסמים NS096833 (CAM).

1. הכנת פתרונות מניות וריאגנטים
<ol><li>להכין את הפתרון המלאי (DTT) מניות על ידי המסת DTT גבישי במים מזוקקים לריכוז הסופי של 1000 מ"מ. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.</li>
	<li>הכנת פתרון מניות ATP על ידי המסת ATP גבישי במים מזוקקים לריכוז הסופי של 100 מ"מ. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.</li>
	<li>להכין מאגר 10x NADH המכיל 70 mM 3-(N-מורגוולינו) חומצה propanesulfonic (מגבים), 10 מ"מ MgCl2, 0.9 mm אתילן גליקול-bis (β-עמינח האתר)-N, N, n ′, n′-טטראצטט חומצה (egta), ו 3 מ"מ נאן3. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. חנות ב -4 ° c.</li>
	<li>להכין מאגר רירן x המכיל 10 מ"מ מגבים ו 0.1 mM EGTA. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. חנות ב -4 ° c. הוסף סרום של שור הבקר (BSA) ו-DTT לריכוז הסופי של 0.1% (w/v%) ו -1 מ"מ, בהתאמה, לפני השימוש.</li>
	<li>הכינו מאגר אקטין 1x המכיל 4 מ"מ, 0.1 mm egta, 2 מ"מ mgcl2, ו 3 מ"מ נאן3. להתאים את ה-pH כדי 7.0 עם פתרון 1 M NaOH. חנות ב -4 ° c. הוסף BSA ו-DTT לריכוז הסופי של 0.1% (w/v%) ו -1 מ"מ, בהתאמה, לפני השימוש.</li>
	<li>הכנת פתרון מלאי NADH על ידי המסת NADH הגבישי בשנת מאגר NADH 10x לריכוז הסופי של 5.5 מ"מ. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.</li>
	<li>הכינו פתרון מלאי ה-אפ על ידי המסת ה-פפ הגבישית במאגר של 10x NADH לריכוז הסופי של 50 מ"מ. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.</li>
	<li>הכנת פתרון מניות LDH על-ידי המסת אבקת ליאופהנד בתערובת של גליצרול ומאגר 10x הנדח (50%: 50%) לריכוז הסופי של 2000-U/mL. צנטריפוגה את הפתרון כדי להסיר כל חלבון מומס הנוכחי (7,197 x g, 20 ° c, 10 דקות). להעביר את הסופרנטאנט. לצינור צנטריפוגה נקי בזהירות מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.</li>
	<li>הכינו פתרון מניות PK על-ידי המסת אבקת PK ליאופ, בתערובת של גליצרול ו-10x מאגר NADH (50%: 50%) לריכוז הסופי של 10000-U/mL. צנטריפוגה את הפתרון כדי להסיר כל חלבון מומס הנוכחי (7,197 x g, 20 ° c, 10 דקות). להעביר את הסופרנטאנט. לצינור צנטריפוגה נקי בזהירות מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c.</li>
	<li>ליצור מחדש את השריר הלב ואת השלד רירן II דגימות על ידי הוספת 100 μL מים מזוקקים כדי להשיג 10 mg/mL פתרונות מניות המתאימים ~ 37.9 μM ו ~ 40.8 μM רירן ריכוזים (monomeric), בהתאמה. לקבלת פרטים נוספים, ראה הוראות היצרן.</li>
	<li>הכינו F-actin מאבקה של שריר הארנב כמתואר על ידי Pardee ו Spudich25.</li>
</ol>2. מדידת פעילויות ATPase והשפעות מעכבות של מעכבי מולקולה קטנה
<ol><li>. הכן צלחת מורכבת<ol>
<li>התמוססות תרכובות עניין בdimethylsulfoxide באיכות גבוהה (DMSO).</li>
		<li>צור 15-צעד סדרתי 1:2 מדלל החל מ 10 מ"מ ריכוז מתחם ב DMSO.</li>
		<li>העבר את הדגימות לצלחת פוליפרופילן 384-היטב ב טריליטים (12.5 μL כל אחד) באמצעות פיפטה רב-ערוצית. השתמש בשתי שורות על הלוח המורכב עבור תרכובת אחת (במקום שלוש עמודות) כדי למזער את מספר הבארות שעלולות להיות מושפעות מאפקטי קצה. השתמש בשלוש הבארות האחרונות בשורה השניה עבור כל תרכובת כפקד שלילי (DMSO בלבד). אין להשתמש בשורה הראשונה והאחרונה בלוח עבור מדלל מורכבים.</li>
		<li>העבר DMSO טהור לתוך הבארות של השורה הראשונה (שמור עבור כיול NADH).</li>
		<li>השתמש בשורה האחרונה לבקרה חיובית. הערה: פארא-האמיאובליביוסטטין בריכוז 4 מ"מ ב dmso שימש כאן.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו 4500 μl של 20 μm מדולל פתרון אקטין עבור כל צלחת השיטת (384-ובכן שחור הקיר פוליסטירן microplate) על ידי דילול פתרון מניות אקטין במאגר אקטין. לערבב את הפתרון ביסודיות על ידי ליטוף למעלה ולמטה 30x באמצעות הפיפטה 5 מ ל כדי להפחית את צמיגות וטרוגניות על ידי שבירת החוטים אקטין. צנטריפוגה את הפתרון כדי להסיר את כל חלבון זירז הנוכחי (7,197 x g, 20 ° c, 10 דקות). העבר בזהירות את הסופרנטאנט. לתוך צינור צנטריפוגה נקי</li>
	<li>הכן תמהיל מומחה המכיל אנזימי LDH ו-PK ("תערובת אנזימים"). עבור כל צלחת השיטת, לשלב 171.4 μl של פתרון ldh, 171.4 μl של פתרון PK ו 3189.3 μl או 3252.9 μl של רירן מאגר עבור בחני מעורבים שריר הלב או השלד רירן II של, בהתאמה, ב 15 מ ל שפופרת צנטריפוגה חרוטי. אל תוסיף רירן בנקודה זו כדי למנוע צבירה ומשקעים.</li>
	<li>להכין מיקס מאסטר המכיל את כל מצעים ("תערובת מצע"). עבור כל צלחת, לשלב 162.1 μL של ATP, 162.1 μL של פפ ו 324.1 μL של פתרון NADH בשפופרת צנטריפוגה של 15 מ"ל. אין להוסיף אקטין בשלב זה כדי למנוע צבירה ומשקעים.</li>
	<li>צור שבעה שלבים סידוריים 1:2 באורך של NADH עבור כיול החל מ 250 μM.<ol>
<li>מערבבים 12.3 μL של פתרון מלאי NADH עם 257.7 μL של מאגר רירן בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.</li>
		<li>Aliquot 135 μL של מאגר רירן לתוך שבעה 1.5 מ ל צינורות מיקרוצנטריפוגה.</li>
		<li>העברת 135 μL של הפתרון מהצינור הראשון לתוך השני ומערבבים על ידי ליטוף. חזור עלהרכבת עד . שנגיע לשפופרת השביעית</li>
		<li>השתמש בצינור האחרון כפקד ללא-NADH (מאגר בלבד).</li>
	</ol></li>
	<li>באמצעות פיפטה של 8 ערוצים, העבר 20 μL של פתרונות כיול NADH לתוך השורה הראשונה של צלחת השימוש בטריליטים.</li>
	<li>הוסף 68 μL של לב או 4.2 μL של שריר השלד רירן II כדי לערבב אנזימים. . מערבולת בקצרה</li>
	<li>מלבד השורה הראשונה, לתת 8.4 μL של מיקס רירן-אנזים מוכן לתוך כל טוב של צלחת היישום באמצעות מנפק אוטומטי.</li>
	<li>העברת 100 nL של פתרונות מלוחית המתחם ועד לצלחת העיבוד המכילה את תמהיל האנזימים באמצעות מערכת הטיפול האוטומטי בנוזל מצויד בראש כלי 100 nL pin.</li>
	<li>לנער את צלחת השימוש 1 דקות בטמפרטורת החדר ב 1200 סל ד באמצעות מיקרופלייט שייקר.</li>
	<li>הוסף 4,052 μl של הפתרון centrifuged אקטין לתמהיל המצע. . מערבולת בקצרה</li>
	<li>לוותר 11.6 μL של actin-מצע לערבב לתוך כל טוב של צלחת השיטת (למעט שורה ראשונה) כדי להתחיל את התגובה אנזימטית באמצעות מנפק אוטומטי.</li>
	<li>לנער את צלחת השימוש 1 דקות בטמפרטורת החדר ב 1200 סל ד באמצעות מיקרופלייט שייקר.</li>
	<li>צנטריפוגה את צלחת המנה ב 101 x g עבור 30 s.</li>
	<li>ודא שהטמפרטורה הפנימית של קורא הלוחית התייצב ב -25 ° c. . העמיסו את הצלחת ונענו לעוד 30 שנות זה צעד לרעוד הוא הכרחי כדי להפוך את הצורה של המשטח הנוזלי דומה בכל היטב ומאפשר זמן לצלחת להגיע לטמפרטורת המדידה.</li>
	<li>הקלטת זריחה NADH עבור 30 דקות סריקת הצלחת במרווחי זמן של 45 s. השתמש 380 ננומטר, 10 מסנן העירור של רוחב הפס ו 470 nm, 24 מסנן פליטת רוחב פס בשילוב עם 425 nm לגזור דיקרואיק mirror. הפעל את המדידה במצב ריכוז גבוה. למטב את מספר הבזקים, לצבור גלאי, מידות צלחת וגובה מדידה לפני הפעלת assays. הערה: תנאי שנקבע סופי הם 300 ננומטר לב/20 שריר השלד nM רירן II, 10 μM actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 מ"מ פפ, 1 מ"מ ATP במאגר המכיל 10 מ"מ מגבים (pH = 7.0), 2 מ"מ MgCl2 , 0.15 mM EGTA, 0.1 mg/mL BSA, 0.5% (v/v) DMSO ו 1 מ"מ DTT. הנפח הכולל הוא 20 μL/ובכן. הריכוז המורכב הסופי הגבוה ביותר הוא 50 μM. 20 μM פארא-האמילבלביוסטטין ב 0.5% dmso משמש כשליטה חיובית 0.5% dmso בלבד הוא שליטה שלילית. כל המדידות מתבצעות. בטריפליטים</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
<ol><li>העלילה עוצמת הקרינה הנצפה נגד הזמן עבור כל טוב.</li>
	<li>בצע רגרסיה ליניארית פשוטה כדי לקבוע את השיפוע ואת החיתוך של תגובות הזריחה עבור כל טוב. השיפוע פרופורציונלי לקצב הצריכה של ATP (NADH), בעוד שהחיתוך פרופורציונלי לריכוז NADH בתחילת המדידה (t = 0 s).</li>
	<li>בנו עקומת כיול עבור NADH על ידי התוויית ההודעות שהתקבלו עבור השורה הראשונה של הצלחת נגד הריכוז של NADH. ודא כי ההודעות תלויות בצורה קווית בריכוז NADH. הערה: המיירט מעריכים את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית האמיתית ב-t = 0 עם הרבה יותר ביטחון מאשר הממוצע של העוצמה הפלואורסצנטית הגולמי קורא ב-t ≈ 0.</li>
	<li>בצע רגרסיה ליניארית פשוטה כדי להשיג את השיפוע והחיתוך של קו כיול NADH. הערה: החיתוך מתאר את אות הרקע הפלואורסצנטי (אין כרגע NADH), בעוד השיפוע מתאים לעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית/תאורטית של פתרון של 1 מ-NADH בניסוי מסוים זה.</li>
	<li>חלק את השיפוע של תגובת הקרינה הפלואורסצנטית שהושג לשאר הבארות על-ידי השיפוע של קו כיול NADH כדי להמיר שינויי זריחה לתעריפי צריכת ה-ATP.</li>
	<li>התווה את תעריפי צריכת ה-ATP כנגד ריכוז המעכב.</li>
	<li>כדי לקבוע קבועים מעכבות, השתמש בתוכנה סטטיסטית מתאימה כדי להתאים לנתוני המינון-תגובה למשוואה הריבועית הבאה, המתאימה למודל שיווי משקל פשוט של אחד-לאחד: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60017/60017eq01.jpg" style="opacity: 0.9;"> כאשר y הוא קצב צריכת ה-Atp, ymin הוא קצב ה-atp Int היעדר המעכב, ymax הוא קצב הצריכה התיאורטי של ה-atp ב-100% עיכוב, KI הוא הקבוע המעכב , [ה]t ו [אני]t הם ריכוז מוחלט של האנזים (רירן) ומעכב, בהתאמה.</li>
</ol>

<ol><li>Heissler, S. M., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Adaptations+of+Myosins+for+Their+Diverse+Cellular+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions.</a> Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).</li>
<li>Hartman, M. A., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+superfamily+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The myosin superfamily at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).</li>
<li>Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+millennial+myosin+census%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A millennial myosin census.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).</li>
<li>Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+classification+of+myosins%2C+a+paneukaryotic+whole-genome+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach.</a> Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).</li>
<li>Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-muscle+myosin+II+in+disease%3A+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).</li>
<li>He, Y. M., Gu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+of+myosin+heavy+chain+genes+in+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Yi+Chuan%22%5BJournal%5D)">Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases.</a> Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).</li>
<li>Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Myosin+by+Blebbistatin+Derivatives%3A+Optimization+and+Pharmacological+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).</li>
<li>Straight, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+temporal+and+spatial+control+of+cytokinesis+with+a+myosin+II+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor.</a> Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).</li>
<li>Sirigu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+selective+inhibition+of+myosin+motors+provides+the+basis+of+potential+therapeutic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).</li>
<li>Green, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+inhibitor+of+sarcomere+contractility+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice.</a> Science. 351 (6273), 617-621 (2016).</li>
<li>Morgan, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+omecamtiv+mecarbil+the+first%2C+selective%2C+small+molecule+activator+of+cardiac+Myosin%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).</li>
<li>Kepiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((para-Nitroblebbistatin%2C+the+non-cytotoxic+and+photostable+myosin+II+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li>
<li>Varkuti, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+soluble%2C+non-phototoxic%2C+non-fluorescent+blebbistatin+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative.</a> Scientific Reports. 6, 26141(2016).</li>
<li>Verhasselt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+%28S%29-3%27-hydroxyblebbistatin+and+%28S%29-3%27-aminoblebbistatin%3A+polar+myosin+II+inhibitors+with+superior+research+tool+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).</li>
<li>Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+synthesis+and+comparative+analysis+of+the+tool+properties+of+new+and+existing+D-ring+modified+%28S%29-blebbistatin+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).</li>
<li>Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+calcium+pump+using+defined+membrane+components%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).</li>
<li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+protein+exerts+diverse+modes+of+ATPase+activity+on+duplex+DNA+partially+and+fully+covered+with+Rad51+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).</li>
<li>Hanzelmann, P., Schindelin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+of+ATP+Hydrolysis+and+Intersubunit+Signaling+in+the+AAA%2B+ATPase+p97%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97.</a> Structure. 24 (1), 127-139 (2016).</li>
<li>Hackney, D. D., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+kinesin+microtubule-stimulated+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).</li>
<li>Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH-coupled+microplate+photometric+assay+for+kinetic+studies+of+ATP-hydrolyzing+enzymes+with+low+and+high+specific+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities.</a> Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).</li>
<li>Carter, S. G., Karl, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+phosphate+assay+with+malachite+green%3A+an+improvement+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).</li>
<li>Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microassay+for+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A microassay for ATPase.</a> Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+In+Vitro+ATPase+Activity+for+Enzymatic+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), 54305(2016).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+blebbistatin+inhibition+of+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II.</a> Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).</li>
<li>Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+blebbistatin+inhibition+and+specificity+for+myosin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).</li>
<li>Kettlun, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+2+Isoapyrases+from+Solanum-Tuberosum+Var+Ultimus%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus.</a> Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).</li>
<li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+binding+assays+at+equilibrium%3A+validation+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).</li>
<li>Motulsky, H. J., Neubig, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+binding+data%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Analyzing binding data.</a> Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).</li>
<li>Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase+Activity+Measurements+by+an+Enzyme-Coupled+Spectrophotometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).</li>
<li>Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+protein+stimulates+heteroduplex+DNA+formation+in+the+synaptic+phase+of+DNA+strand+exchange+via+specific+interactions+with+the+presynaptic+Rad51+nucleoprotein+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament.</a> Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).</li>
<li>Banik, U., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+fluorimetric+assay+for+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">A continuous fluorimetric assay for ATPase activity.</a> Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).</li>
<li>Xiao, Y. X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIFC1%3A+a+promising+chemotherapy+target+for+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?</a> Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).</li>
<li>See, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Dynein+Antagonists+with+Improved+Potency+and+Isoform+Selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).</li>
<li>Datta, A., Brosh, R. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+Into+DNA+Helicases+as+Druggable+Targets+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59(2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

שלבים קריטיים בפרוטוקול
למטב את פריסת צלחת על ידי הפעלת כמה צלחות עם שליטה שלילית בלבד (התגובה ATPase ללא מעכב). בדוק את התוצאות בקפידה עבור דפוסים בשיעורי התגובה. לדוגמה, אלה עשויים לנבוע מאפקטי קצה ו/או פגמים בציפוי המשטח של הידרופיפילית של צלחות "לא מחייבות". אם תבנית מסוימת נצפתה, שנה את סוג הלוח ו/או את פריסת הצלחת כדי למזער את הממצאים. לדוגמה, עקומת מינון טיפוסית (16 ריכוזים עם טריליטים, 48 נקודות בסך הכל) יכול להיות מסודר בשלוש עמודות או שתי שורות על צלחת 384-באר. סידור...

מיוחטאים הם מכניכי אנרגיה מכימיים הידרוליייז אדנוזין טריפוספט (ATP) כדי ליצור תנועה כיוונית לאורך החוטים של השלד של אקטין ב eukaryotes1,2. יש להם הן מבנית ומותאם באופן מבחינה מדומה פונקציות תאיים שונות שלהם, כגון התחבורה של אורגלים, התכווצות שרירים או את הדור של מתח ציטושלד1,2. רירן משפחה מיוצגת על ידי ~ 40 רירן גנים השייכים ~ 12 מחלקות רירן נפרדות בגנום האדם3,4. חברי הכיתות רירן לשחק תפקידים שונים בקבוצה מגוונת מאוד של הפרעות, כגון מספר סוגי סרטן, הפרעות נוירולוגיות, השלד myopathies, ו יפרטרופית שריר הלב5,6. בהתחשב במספר הגדול של התפקודים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של המנועים המולקולריים הללו, אין זה מפתיע שהם נעשים יותר ויותר מוכרים כמטרות סמים עבור מגוון של תנאים7. התקדמות משמעותית נעשתה לאחרונה בגילוי של מעכבי רירן חדשים8,9,10 ומפעילים11, כדי לשפר את המאפיינים של הקיימים12, מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , . חמש עשרה
המלון הינו בשילוב עם השימוש באותו מספר שימש למדידת פעילות ה-ATPase באנזימים שונים, כגון הsarcoplasmic הרשת2 + משאבת atpase16, תיקון DNA atpase Rad5417, AAA + ATPase p9718 או מנוע מיקרוכדורית19. התהליך מעסיק מעגל התחדשות של ATP. אדנוזין diphosphate (ADP) שנוצר על ידי ATPase הוא נוצר מחדש ל-ATP על ידי פירובט קינאז (PK), אשר הופך מולקולה אחת של פוספולרופפירופיבט (פפ) לפירובט במקביל. לאחר מכן, פירובט מופחת כדי לקטט ידי לקטט דהידרוגנאז (LDH). זה, בתורו, מחמצן אחד מולקולה של NADH ל-NAD. לפיכך, הירידה בריכוז NADH כפונקציה של זמן שווה לקצב ההידרוליזה של ATP. מחזור ה-ATP שומר על ריכוז ה-ATP כמעט קבוע והריכוז של ADP מועט כל עוד האפשרות של ה-פפ זמינה. התוצאה היא קורסי זמן ליניארי, מה שהופך אותו פשוט כדי לקבוע את שיעורי התגובה הראשונית ומסייע להימנע מעיכוב המוצר על ידי ADP19. למרות הדרישה NADH מצמידים ATPase כבר הותאם 96-היטב בפורמט20, התגובה הגבוהה ביותר (~ 150 μl) לעשות את זה יקר יחסית בשל הביקוש הגבוה של ריאגנטים, עיבוד זה קל פחות להקרנה מהירה של מספרים גדולים של תרכובות. שיטות אלטרנטיביות, כגון השיטה הירוקה למלאכית19,21, המסתמכת על גילוי הפוספט המיוצר על ידי האנזים atpase, הוכחו מתאימים יותר למזעור ולהקרנה בתפוקה גבוהה22 , מיכל בן 23 , 24. עם זאת, שיטת נקודות קצה עשויה להיות מושפעת ממספר פריטים (שנדונו להלן), שעלולים להישאר לא מתקיימים בהיעדר קורסים במשרה מלאה.
כאן, הבקשה NADH ביחד ATPase ממוטבת עבור הקרנת תפוקה למחצה גבוהה של מעכבי מולקולה קטנה. שריר השלד ושרירי הלב רירן II ו רירן מעכבי בלייבסטטין8, פארא-האמיביוסטטין11 ו פארא-ניטרוגליצרין בליביוסטטין12 משמשים כדי להדגים את כוחה של היכולת, אשר נשענת על nadh פלואורסצנטית כבדיקה. פרוטוקול זה הוא קל לסינון פרויקטים התמקדו כל הפקת האנזימים.

<table><tbody><tr><td>384 בארות אוגן נמוך שחור שטוח תחתון פוליסטירן NBS Microplate</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>ATP (אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט דיסודיום מלח הידרט)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Aurora FRD-IB Dispenser</td><td>Aurora Discovery, Inc.</td><td></td><td></td>00017425</tr><tr><td>Biomek NXP תחנת עבודה לאוטומציה במעבדה רב-ערוצית</td><td>בקמן קולטר</td><td>A31841</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/</td><td>A סינתזה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>BSA (אלבומין סרום בקר, ללא פרוטאז)</td> <td>Akron Biotech</td><td>AK1391&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5430 R, מקוררת, עם רוטור FA-35-6-30</td><td>Eppendorf</td><td>022620663</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5430, לא בקירור, עם רוטור A-2-MTP</td><td>Eppendorf</td><td>022620568</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (דימתיל סולפוקסיד)</td><td>&nbsp; סיגמא</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-דיתיותרייטול)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip Multichannel Pipette; פורמט 384;</td><td></td> פיפטה רב-ערוצית Thermo Scientific <td>4672010-E1</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 8 ערוצים; פורמט 96; 8 ערוצים</td><td>Thermo Scientific</td><td>4672080</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N&prime;,N&prime;-חומצה טטראצטית)&</td><td>nbsp; Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EnVision 2104 קורא צלחות מרובה תוויות</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>LDH (L-לקטית דהידרוגנאז משריר ארנב)</td><td>Sigma</td><td>L1254</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (מגנזיום כלוריד הקסהידרט)</td><td>&nbsp; סיגמא</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>שייקר מיקרופלייט</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 12620-926&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופלייט, 384 בארות, PP, נפח קטן, באר עמוקה,</td><td>גריינר טבעי Bio-One</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (3-(N-Morpholino)חומצה פרופנסולפונית)&</td><td>nbsp; Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>חלבון מוטורי מיוזין (באורך מלא) (שריר לב בקר)</td><td>שלד ציטו&nbsp;</td>חלבון מוטורי <td>מיוזין MY03</td><td></td></tr><tr><td>(באורך מלא) (שריר השלד של ארנב)</td><td>שלד ציטו&nbsp;</td><td>MY02</td><td></td></tr><tr><td>NADH (&בטא;-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד, מחוזר דיסודיום מלח הידרט)</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (נתרן אזיד)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (נתרן הידרוקסיד)</td><td>&nbsp; סיגמא</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>מסנן אופטי CFP 470/24 ננומטר (פליטה)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5850</td><td>ברקוד 240</td></tr><tr><td>מסנן אופטי Fura2 380/10nm (עירור)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5390</td><td>ברקוד 112</td></tr><tr><td>מודול אופטי: בטא לקטמאז</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-4270</td><td>ברקוד 418</td></tr><tr><td>תוכנת OriginPro 2017</td><td>OriginLab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>para-Aminoblebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>סינתזה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>para-Nitroblebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>סינתזה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>PEP (מלח מונופוטסיום חומצה פירובית פוספו(אנול)</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>PK (פירובט קינאז משריר הארנב)</td><td>Sigma</td><td>P9136</td><td></td></tr><tr><td>אבקת אצטון שריר ארנב</td><td> פריז ביולוגית</td><td>41995-2</td><td></td></tr></tbody></table>

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

האנזימים atpase לנצל את האנרגיה החופשית מאוחסן אדנוזין טריפוספט כדי לזרז מגוון רחב של תהליכים ביוכימיים מאנדריוני ב vivo זה לא היה מתרחש באופן ספונטני. חלבונים אלה חיוניים למעשה כל ההיבטים של החיים הסלולריים, כולל חילוף החומרים, החטיבה התא, תגובות שינויים סביבתיים ותנועה. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הסביבה הזאת באמצעות הקרנת מולקולות של מולקולה קטנה (NADH) בשילוב של מולקולת התפוקה למחצה. הדבר הוחל על שריר לב השלד רירן II של, שני actin מבוססי מנוע מולקולרי ATPases, כהוכחה לעיקרון. ההידרוליזה של ATP משולב לחמצון של NADH על ידי תגובות אנזימטיות בבחינה. ראשית, ה-ADP שנוצר על-ידי ה-ATPase נוצר מחדש ל-ATP על ידי פירובט קינאז (PK). PK מזרז את המעבר של פוספולרופפירובט (פפ) לפירובט במקביל. לאחר מכן, פירובט מצטמצם לקטט על ידי לקטט דהידרוגנאז (LDH), אשר מזרז את החמצון של NADH במקביל. לפיכך, הירידה בריכוז ה-ATP מכוונת ישירות לירידה בריכוז NADH, הבאה לאחר שינוי בזריחה הפנימית של NADH. כל עוד מערכת ה-פפ זמינה במערכת התגובה, ריכוז ה-ADP נותר נמוך מאוד, ונמנע מעיכוב באנזים ATPase באמצעות מוצר משלו. יתרה מזאת, הריכוז של ATP נשאר כמעט קבוע ומניב קורסי זמן ליניאריים. הזריחה מנוטרת ברציפות, אשר מאפשר הערכה קלה של איכות הנתונים ומסייע לסנן חפצים פוטנציאליים (למשל, הנובעים משקעים מורכבים או שינויים תרמיים).

המפה האופיינית לפריסת הלוח המשמשת לסינון ניסויים מוצגת באיור 1. השורות הראשונות והאחרונות שמורות עבור כיול NADH ושליטה חיובית (20 μM פארא-האמיבלביוסטטין, 0.5% dmso), בהתאמה. השורות הנותרות (ב-O) משמשות לבדיקת פעילות העכבות של תרכובות. כאן, 15-צעד סדרתי 1:2 לדילול החל מ 10 מילימטר הריכוז מתחם ב DMSO מוכנים והועברו מן הצלחת המתחם לצלחת הקבע, כך ריכוז המתחם הסופי הגבוה ביותר הוא 50 μM (ב 0.5% DMSO) על צלחת היכולת. שתי שורות משמשות לקבלת עקומת תגובת מינו...

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

פרוטוקול זה חל על מגוון רחב של פרויקטים סינון שמטרתם לפתח מעכבי ATPase, או כמו בדיקות למחקר בסיסי או עבור תרכובות קליניות פוטנציאליות. שיטה זו עברה אופטימיזציה עבור יישומי סינון בעלי תפוקה גבוהה למחצה. זה גם תוכנן כדי למנוע כמה חפצים נפוצים וזה לא דורש טיפול בחומרים מסוכנים.במעבדה שלנו השתמשנו בהסטה זו כדי לפתח מעכבי מיוסין II חדשים וספטיים שאינם שרירים לטיפול בהפרעת שימוש במתאמפטמין. בתיאוריה, שיטה זו יכולה בקלות להיות מיושמת על כל אנזימים המייצרים ATP. הדגמה חזותית מסייעת להבהיר את כל הפרטים הטכניים החשובים.כדי להתחיל, להכין 4, 500 microliters של 20 פתרון אקטין מדולל micromolar עבור כל מיקרופלסטיק פוליסטירן שחור 384 היטב על ידי דילול פתרון מלאי actin מרוכז במאגר actin. מערבבים את הפתרון ביסודיות על ידי צינור למעלה ולמטה 30 פעמים כדי לשבור את תווי actin להפחתת צמיגות והטרוגניות. ואז צנטריפוגה הפתרון כדי להסיר את כל החלבון המזרז הנוכחי.מעבירים בזהירות את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה נקי. הכן תערובת אנזימים ראשית בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מיליליטר עבור כל צלחת בדיקה על ידי שילוב של 3, 252.9 microliters של מאגר מיוסין עבור בדיקה מעורבים מיוסין שריר השלד II, 171.4 microliters של פתרון LDH, ו 171.4 microliters של פתרון PK. הכן תערובת מצעים ראשית בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מיליליטר עבור כל צלחת על ידי שילוב של 162.1 microliters של ATP, 162.1 microliters של PEP, ו 324.1 microliters של פתרון NADH.אין להוסיף actin בשלב זה, כדי למנוע צבירה ומשקעים. כדי ליצור דילול סדרתי של 1 ל-2 שלבים של NADH לכיול, הכינו שמונה צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מערבבים 12.3 מיקרוליטרים של פתרון מלאי NADH עם 257.7 מיקרוליטרים של מאגר מיוסין בצינור הראשון כדי ליצור פתרון 250 מיקרומולרים.ואז aliquot 135 microliters של חיץ מיוסין לתוך כל אחד משבעת הצינורות הנותרים. מעבירים 135 מיקרוליטרים של הפתרון מהצינור הראשון לצינור השני ומערבבים על ידי צינורות. חוזרים על הפעולה עד להגעה לצינור השביעי.השתמש בצינור האחרון כבקרת NO-NADH עם מאגר בלבד. כלול תמיד פקדים חיוביים ושליליים על לוחות מורכבים, ודילול NADH לכיול על לוחות מים. פקדים אלה חשובים ביותר לזיהוי ממצאים במהלך ניתוח נתונים.באמצעות פיפטה בת שמונה ערוצים, העבר 20 מיקרוליטרים של פתרונות הכיול NADH לשורה הראשונה במוליכים בצלחת בדיקה. עכשיו להוסיף 4.2 microliters של מיוסין שריר השלד II לתערובת האנזים. וורטקס בקצרה.מוסיפים מיוסין לתערובת האנזים ממש לפני חלוקת. דגירה ארוכה של פתרונות מיוסין מדוללים עלולה לגרום לאובדן פעילות עקב משקעים, וכריכה לא ספציפית למשטחי פלסטיק. לטעון את תערובת אנזים מיוסין מוכן לתוך אחד המכולות מדגם של מתקן אוטומטי.בצלחת, למעט השורה הראשונה, מחלקים 8.4 מיקרוליטרים של תערובת אנזימי המיוסין לכל באר של צלחת ההתרסה. לאחר מכן מניחים את צלחת ההתרשכות ואת הלוחית המורכבת על מיקומי כלי המעבדה של מערכת טיפול אוטומטית בנוזלים המצוידת בראש כלי סיכה 100 ננוליטר. לאחר מכן להפעיל את השיטה המתאימה בתוכנה כדי להעביר 100 nanoliters של פתרונות מן הלוח מורכב מוכן לצלחת ההתנסויות.לאחר מכן, מניחים את צלחת ההתלהמה על שייקר מיקרופלסטיק כדי לנער במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ב 1, 200 סל"ד. הוסף 4, 052 microliters של פתרון actin צנטריפוגה לתערובת המצע ומערבולת לזמן קצר. כדי להתחיל את התגובה האנזימטית, לוותר על 11.6 microliters של תערובת מצע actin לתוך כל באר של צלחת מרשם באמצעות מתקן אוטומטי, למעט השורה הראשונה.על שייקר מיקרופלסטיק, לנער את צלחת ההתבונן במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ב 1, 200 סל"ד. צנטריפוגה צלחת ההתחשמלות ב 101 פעמים g במשך 30 שניות. השתמש במסנן קריאה ברוחב 380 ננומטר, ברוחב 10 ננומטר וב-470 ננומטר, מסנן פליטת רוחב פס של 24 ננומטר בשילוב עם המראה הדיכרומטית של 425 ננומטר להמראה הדיקורית של ה- assays.מטב את מספר ההבזקים, רווח הגלאי, מידות הלוח וגובה המדידה לפני הפעלת ההבזקים. הפעל את המדידה במצב ריכוז גבוה. ודא כי הטמפרטורה הפנימית של קורא הלוח התייצב ב 25 מעלות צלזיוס.לטעון את הצלחת לתוך קורא הלוחות ולנער עוד 30 שניות כדי להפוך את הצורה של פני השטח הנוזלי דומה בכל באר ולאפשר את הצלחת להגיע לטמפרטורת המדידה. סרוק את הלוח במרווחים של 45 שניות והקליט פלואורסצנטיות NADH למשך 30 דקות. עם הנתונים המיוצאים, התווה את עוצמת הפלואורסצנטיות שנצפתה כנגד הזמן עבור כל באר.בצע רגרסיה ליניארית פשוטה כדי לקבוע את השיפוע ואת היירוט של התגובות פלואורסצנטיות עבור כל באר. השיפוע פרופורציונלי לקצב צריכת NADH אשר יכול לשמש קירוב טוב מאוד של שיעור צריכת ATP. היירוט פרופורציונלי לריכוז NADH בתחילת המדידה.לאחר מכן, לבנות עקומת כיול עבור NADH על ידי התוויית היירוטים שהושגו עבור השורה הראשונה של הלוח נגד הריכוז של NADH. היירוטים מעריכים את עוצמת הפלואורסצנטיות האמיתית בהתחלה עם הרבה יותר ביטחון מהממוצע של עוצמת הפלואורסצנטיות הגולמית שקוראת בהתחלה. בצע רגרסיה ליניארית פשוטה כדי להשיג את השיפוע ואת היירוט של קו הכיול NADH.כאן, היירוטים מתארים את אות הרקע הפלואורסצנטי ללא NADH נוכח, בעוד המדרון מתאים לעוצמת הפלואורסצנטיות התיאורטית המופחתת של פתרון NADH טוחנת אחת. כדי להמיר שינויים פלואורסצנטיים לתעריפי צריכת ATP מחלקים את השיפוע של תגובת הפלואורסצנטיות המתקבלת לשאר בארות על ידי השיפוע של קו הכיול NADH. לאחר מכן, לתכנן את שיעורי צריכת ATP נגד הריכוז של המעכב.כדי לקבוע את הקבועים המעכבים, השתמש בכל תוכנה סטטיסטית מתאימה המסוגלת להתאים עקומה לא ליניארית, כגון Origin 2017. בחר התאמה עקומה לא ליניארית כדי להתאים את נתוני תגובת המינון למשוואה ריבועית המתאימה למודל שיווי משקל מחייב אחד לאחד פשוט. Y הוא שיעור צריכת ATP.Y-מינימום הוא שיעור צריכת ATP בהיעדר מעכב. Y-מקסימום הוא שיעור צריכת ATP תיאורטית ב 100% עיכוב. t ו- t הם הריכוז הכולל של אנזים מיוסין ומעכב, בהתאמה.KI הוא הקבוע המעכב. במחקר זה, תגובות מיוסין שריר השלד והבי II ATPase הראו עקבות עוצמת פלואורסצנטיות ליניארית ללא קשר למיוסין בשימוש או נוכחות של מעכבים. שיעורי ATPase המופעלים על בסיס ואקטין הראו תלות ליניארית בריכוז של מיוסין שריר השלד או הלב II.A מקדם חלון ההקרנה או גורם Z של 0.78 הצביע על מבחן אמין עם בקרות חיוביות ושליליות מופרדות היטב.Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin, ו para-Nitroblebbistatin הראו עקומות תגובת מינון רגילות או מתחת לערכי המסון המדווחים שלהם. קבועים מעכבים עבור IIs מיוסין שריר הלב השלד נקבעו על ידי התאמת משוואה ריבועית המייצג מודל קשירה שיווי משקל פשוט לנתונים. עקבות עוצמת פלואורסצנטיות עבור blebbistatin שהושגו ב- ATPase assay באמצעות מיוסין שריר השלד II הראו אות נורמלי לירידה ליניארית בהתאם לכמות המעכב הנוכחי.עם זאת, מעל המסיסות של blebbistatin עלייה בלתי צפויה האות נצפתה ככל הנראה בשל היווצרות של גבישי בליביסטטין בהירים. במקרה של פרה-ניטרובלביסטטין עם עקבות נורמליות של עוצמת פלואורסצנטיות גולמית, שיעורי התגובה שהושגו מעל מיסות סטה מעקומת תגובת המינון שנקבעה עקב משקעים. באמצעות שיטה זו, פיתחנו מעכבי מיוסין חדשים, חזקים וסלקטיביים שעשויים לשמש ככלים מדעיים במחקר בסיסי או כמועמדים ישירים בעתיד.מומלץ תמיד להשתמש ATPase שונה או מבחן פונקציונלי אחר ספציפי האנזים של עניין להבחין בין להיטים חיוביים אמיתיים ושקריים. כל החלבונים קושרים משטחי פלסטיק. בעיה זו יכולה להשפיע מאוד על התוצאות, במיוחד אם החלבון קיים בריכוזים נמוכים.תמיד להימנע טיפול נוזלי מיותר, ולהשתמש צינורות שאינם מחייבים. בדיקות ATPase חלופיות דורשות בדרך כלל טיפול בחומצה גופרתית, חומרים רעילים או חומרים רדיואקטיביים. לעומת זאת, בדיקת ATPase המקושרת ל-NADH דורשת רייגנטים ללא רעילות או רעילות נמוכה מאוד בלבד.

a-semi-high-throughput-adaptation-nadh-coupled-atpase-assay-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

Kinesins מתאפיין באינטראקצית נוקלאוטיד תלוי עם microtubules: מחזור של מחזור ATP מצמידים את מעגל האינטראקציה microtubule. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לנתח את קינטיקה של מעברי נוקלאוטיד בודדים במחזור מחזור ATP של kinesin באמצעות נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently והפסיקה זרימת הקרינה.

שימוש בנוקלאוטידים פסיקת זרימת הקרינה ותווית לניתוח מחזור מחזור ATP של Kinesins

האינטראקציה בין ערוצי HCN ו למקטע העזר שלהם זוהה כיעד טיפולי הפרעת דיכאון מג'ורית. כאן, שיטת קרינה מבוססת קיטוב לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של אינטראקציה בין חלבונים זה, מוצגת.

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

NMR-מבוסס על פעילות שפותחה כדי לזהות ולאפיין מעכבי של שני אנזימים ריבוהיהידרוקלז. הפרוטוקולים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב-500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי נוזל מונה המסך, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם.

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.

בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

SAMHD1 הוא deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase עם תפקידים קריטיים בבריאות האדם ובמחלות. כאן אנו מציגים בדיקת פעילות רב-תכליתית של SAMHD1 מצומדת אנזימים, הפרוסה בפורמט מיקרו-צלחות של 384 בארות, המאפשרת הערכה של מולקולות קטנות ואנלוגים של נוקלאוטידים כסובסטרטים, מפעילים ומעכבים של SAMHD1.

בדיקת פעילות מצומדת אנזימים בתפוקה גבוהה לבדיקת אינטראקציה של מולקולות קטנות עם dNTPase SAMHD1

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ביוכימית של שינוי ג'ל למדידת פעילות FEN1 (Flap Endonuclease 1) והתפתחות מעכבים.

זיהוי מבוסס פלואורסצנטי של פעילות נוקלאז FEN1 וסינון של מעכבי מולקולות קטנות

למד את פרוטוקול מבחן NADH-coupled ATPase מותאם לסינון מולקולות קטנות של מעכבי מיוזין בפורמט 384-well. שיטה זו מאפשרת מחקר ביוכימי ופיתוח תרכובות קליניות בייעול גבוה.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

גלה סרטונים נוספים