Name: משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: למדו פרוטוקול לחקר צמיחת נויריטים בנוירונים קורטיקליים עובריים של עכברוש באמצעות שיתוף-הזרקה עם EGFP. השיטה משפרת את יעילות ההזרקה ומאפשרת זיהוי מדויק של תאים מוזרקים לחקר מחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי כספים מן המועצה מענקים מחקר הונג קונג, בריאות ומחקר רפואי הקרן (הונג קונג), CUHK מענק הערכה, קרן הנאמנות של המכללה המאוחדת ו TUYF נאמנות צדקה.

כל ההליכים שלאחר מכן היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת האתיקה של הניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה הסינית בהונג קונג.
1. הכנת שוברי כיסוי
<ol><li>מניחים כיסוי סטרילי מעגלי 18 מ"מ לתוך כל טוב של לוחית 12-היטב הרקמה רקמות.</li>
	<li>לחלוק את הסרבל עם 5 μg/mL פולי-D-ליזין פתרון מחולל 37 מעלות צלזיוס בחממה עבור 1 h לפחות.</li>
	<li>מנושף את התמיסה פולי-ליזין מצלחת תרבות הרקמה ולשטוף את הכיסויים מצופה פעם אחת עם מים סטריליים.</li>
</ol>2. החולדה מתחלקים לנתיחה
<ol><li>להקריב עכברוש מתוזמן בהריון ספראג-דאולי בגיל ההיריון של 18 ימים (E18) על ידי פריקה צוואר הרחם או שיתוף2 חנק. הערה: אנא בדוק את התקנות המקומיות. להקרבה של עכברושים בהריון</li>
	<li>פתח את חלל הבטן של עכברוש בהריון עם מספריים לבתר ולהעביר את הרחם על 10 ס מ צלחת פטרי.</li>
	<li>פתח את הרחם ואת שק השפיר בזהירות עם המספריים מבתר קטן ולהסיר את השליה מן העובר חולדה באמצעות מספריים מבתר קטן. להעביר את העובר כולו 10 ס מ צלחת פטרי עם מלוחים טרום מקורר פוספט באגירה בתוספת גלוקוז (PBS-גלוקוז, 10 מ"מ מלחי נתרן, 2.68 מ"מ אשלגן כלוריד, 140 mM נתרן כלוריד ו 3 g/L גלוקוז) באמצעות זוג מלקחיים קטנים.</li>
	<li>חותכים לאורך התפר המשונן של הגולגולת ופותחים אותו בזהירות עם זוג מספריים קטנים. העבר את המוח העובריים עם מרית קטנה ושטוחה לצלחת פטרי בגודל 10 ס מ עם הקרח הקר-גלוקוז.</li>
	<li>הפרידו בין שתי האונות המוחית לגזע המוח השני ובאמצעות שתי #5 פינצטה תחת מיקרוסקופ לחיתוך. הערה: בבקשה ראו התייחסות12 . למבנה של מוח החולדה</li>
	<li>הסר את הקרום הקרומי באמצעות ה#5 פינצטה.</li>
	<li>לבודד את קליפת המוח מהמיאונות המוחית עם שני מלקחיים #5 ישרים.</li>
	<li>העבירו את קליפת המוח הבודדת. ל-"PBS-גלוקוז" בתוך 15 מ ל</li>
</ol>3. תרבית תא בקליפת היסוד
הערה: כל ההליכים בשלבים 3 ו-4 מבוצעים בתוך ארון מחלקה II Biosafety טיחות.
<ol><li>ליישב את קליפת המוח הבודדת על ידי כוח הכבידה ב 4 ° c עבור 5 דקות ולאחר מכן לבשל את ה-PBS-גלוקוז.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ ל של 0.05% טריפסין-EDTA לקליפת הקליפה הבודדת וערבבו בעדינות על ידי הקשה על הרקמה באמבט מים בגודל 37 ° c במשך 10 דקות כדי לאפשר את העיכול האנזימטי. הקש על צינור בעדינות כדי ערבוב כל 2 דקות.</li>
	<li>הוסף 4 מ ל של מדיום תחזוקה (למשל, מדיום Neurobasal סיס) לרקמה/טריפסין תערובת. הערה: כל המדיום תחזוקה בשימוש בפרוטוקול זה הוא שיושלם עם פניצילין-סטרפטומיצין ו B-27 תוספת13.</li>
	<li>הנתק את הרקמה בעדינות על-ידי הטריטורציה באמצעות פיפטה של 1 מ ל.</li>
	<li>גלולה את התאים הנתק על ידי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות. ומתה את הסופרנטאנט.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.5 עד 3.7 פעמיים.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של אמצעי תחזוקה.</li>
	<li>הוסף 10 μL של 0.4% הפתרון הכחול טרימין כחול 10 μL של הבולם הסלולרי עבור ספירת תאים קיימא על-ידי הומוציטומטר.</li>
	<li>צלחת הנוירונים בצפיפות של 65000/cm2 (תאים קיימא) ב 1 מ ל של תחזוקה בינונית לכל טוב בצלחת 12-באר.</li>
</ol>4. העברה וקיבוע תאים
<ol><li>ב 2 ימים ב מבחנה (DIV2), transfect 0.5 μg של בניית EGFP (pEGFP-C1) לנוירונים יחד עם או בלי 0.5 μg של פוי באמצעות 1 μL של העברה מגיב (g., Lipofectamine 2000). השתמש בהוראות היצרן. הערה: ביטויים ממיונקים הוכנו על ידי שימוש בערכת ההכנה של הפלטוקסין בחינם. טיפול עם כימיקלים/מולקולות (בכתב יד ציטוסין D (Cyto D) ואת הצמיחה העצבים גורם (NGF) שימשו) ניתן לעשות ב 6 h לאחר מעבר החצייה.</li>
	<li>מנושף את מבנה התרבות 24 שעות לאחר ההעברה ושוטף את התאים המוגברים פעם אחת עם 37 ° c PBS (10 מ"מ מלחי נתרן, 2.68 מ"מ אשלגן כלוריד, 140 מ"מ נתרן כלוריד).</li>
	<li>תקן את התאים עם 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים עם ה-PBS.</li>
	<li>הוסף כמות מינימלית של מדיום הרכבה פלואורסצנטית בשקופית זכוכית מיקרוסקופ. העבר בזהירות את הכיסויים של הצלחת 12-הבאר אל מדיום ההרכבה עם המדגם הפונה לשקופית זכוכית. הערה: לאטום את הקצה של שמיכות עם לק ציפורניים אם מדיום הרכבה מימית משמש.</li>
</ol>5. מדידה של Neurite Outgrowth
<ol><li>השתמש במטרה 40x עבור לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ אפינפרין-פלורסנט.</li>
	<li>לכידת תמונות מ לפחות 40 נוירונים שלמים עם אות EGFP לאחר הזיהום.</li>
	<li>פתח את התמונה שנלכדה בתוכנת ImageJ עם התוסף העצבי11 כדי למדוד את אורך הneurite הארוך ביותר, מגוף התא לקצה של קונוס הצמיחה, של כל תא עצב התמונה.</li>
	<li>לנתח את הנתונים שהושגו עם התוכנה כדי לקבוע את ההשפעה של חלבונים ייעודיים ב neurite outgrowth.</li>
</ol>

<ol><li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system%3A+Lessons+from+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li>
<li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li>
<li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Chemical+Genomics%22%5BJournal%5D)">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li>
<li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li>
<li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li>
<li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+the+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain%3A+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+B27%2Fneurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum%2C+substantia+nigra%2C+septum%2C+cerebral+cortex%2C+cerebellum%2C+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li>
<li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth%3A+roles+of+microfilaments+and+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li>
<li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li>
<li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li>
<li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18(2010).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation%2FReoxygenation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li>
<li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).</li>
<li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+for+advanced+glycation+end+products+%28RAGE%29--soluble+form+%28sRAGE%29+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Investigation%22%5BJournal%5D)">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li>
<li>Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRadbruch%2C+A+%22Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting%22">Flow Cytometry and Cell Sorting</a>. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).</li>
<li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li>
<li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li>
<li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures%3A+a+methodological+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899(2013).</li>
<li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+%28hiPSC%29-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li>
<li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניין בתוכן של מאמר זה.

כפי שצוין לפני, PC12 ושיבוטים שלה הם מועסקים נרחב ללמוד הארכה neurite כי יש להם יעילותמעולהמעבר 2,3. לעומת זאת, נוירונים ראשוניים יש שיעור מעבר נמוך, שהוא מכשול גדול ללמוד neurite מוצלח הרגולטורים על ידי התפתחות7. כאן, אנו מתארים פרוטוקול נוח לכמת neurite מוצלח בנוירונים הראשי. למרות היעילות הכללית הכוללת, יותר מ 80% מהנוירונים המזוהמים היו בהצלחה בשיתוף עם שני החלבונים: FE65 ו-EGFP (איור 2א)....

Neurites, כולל אקסונים ו דנדריטים, הם התחזיות מפני נוירונים המעורבים בהקמת רשתות עצביות. הצמיחה הדינמית של neurites היא חיונית עבור פיתוח נוירולוגי. עם זאת, מנגנוני הרגולציה הבסיסיים שמתחת נותרים ברורים. בפרט, נזק neurite הוא נצפה לעתים קרובות במחלות ניווניות שונים ואחרי פציעות המוח1. לכן, חקירת התפקידים של מולקולות neurite מוצלח מסלולים שונים הרגולציה ישפר את הבנתנו את התהליך. יתר על כן, זה עשוי לחשוף מטרות טיפוליות הרומן עבור הפרעות נוירולוגיות שונות. קווי התאים העצביים הם מודלים יקרי ערך עבור לימוד תהליכים עצביים כולל neurite מוצלח כפי שהם קל לתמרן ו transfect2,3. עם זאת, הסחף גנטי דווח להתרחש כמה קווי התאים הנפוצים, אשר יכול להוביל וריאציות התגובות הפיסיולוגיים שלהם4. יתר על כן, ביטוי החלבון הדיפרנציאלי הוכח בין קווי התאים העצביים והנוירונים הראשוניים. למשל, PC12, קו של תא עצבי שנגזר בלוטת יותרת הכליה חולדה המשמשת רבות ללימוד neurite מוצלח2,3, אינו מבטא קולטנים NMDA5. יתר על כן, זה כבר הציע כי התגובה מופחתת של העכבר שורה נוירובלסטומה בקווים עצביים-2a כדי נוירוטוקסינים בהשוואה לנוירונים הראשי הוא בשל חוסר ביטוי של קולטני קרום מסוימים וערוצי יון6. לכן, הנוירונים העיקריים הם מודל רצוי יותר ומייצג לחקירה של neurite outgrowth. עם זאת, השימוש בנוירונים הראשי מפריע היעילות שלהם הזיהום הנמוך7.
כאן, אנו מתארים שיטה המערבת שיתוף הזיהום של חלבון הריבית (פוי) ו-EGFP לנוירונים הראשי הקליפת העור הפנים. ה-EGFP משמש כסמן מורפולוגי לזיהוי נוירונים שעברו בהצלחה ומאפשר את המדידה של neurites. אנו אימות שיטה זו באמצעות תרכובות/מולקולות שדווחו לווסת neurite outgrowth. יתר על כן, FE65, חלבון מתאם עצבי כי הוכח לעורר neurite outgrowth, שימש כדי להמחיש את הגישה הזאת8,9. פרוטוקול זה כולל (1) בידוד של נוירונים בקליפת העור העיקרי מן היום העובריים 18 (E18) עוברי חולדה, (2) את שיתוף הפעולה של נוירונים עם EGFP ואת פוי (FE65 במחקר זה) ו (3) הדמיה וניתוח של הנוירונים באמצעות עיבוד תמונה ImageJ של תוכנה עם תוסף עצבי10,11.

<table><tbody><tr><td>#5 פינצטה</td><td>Regine</td><td>5-COB</td><td></td></tr><tr><td>18 מ"מ כיסוי עיגול מחליק</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>CB00180RA</td><td>לעקר לפני השימוש</td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Invitrogen</td><td>PHZ1063</td><td>מומס ב-DMSO</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לניתוח, 10 ס"מ</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לניתוח, 12.5 ס"מ</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מקסי פלסמיד</td><td>EndoFree QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה פלואורסצנטית בינונית</td><td>Dako</td><td>S302380</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>נוירובזאלי בינוני</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF 2.5S חלבון עכבר מקורי</td><td>Gibco</td><td>13257019</td><td></td></tr><tr><td>Nugent Utility מלקחיים, 10 מ"מ, Straight Tip</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>#6084-1</td><td></td></tr><tr><td>pCI FE65</td><td></td><td></td><td>אנא ראה הפניות 8 ו-15</td></tr><tr><td>טבליות PBS</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>מרית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4147</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), פנול </td><td>תמיסת גיבקו</td><td>25300062</td><td></td>טריפאן</tr><tr><td>כחולה אדומה, 0.4%</td> <td>ג'יבקו</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד neurite outgrowth בנוירונים ראשוניים

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Neurite מוצלח הוא אירוע בסיסי בהקמת מעגלים עצביים במהלך פיתוח מערכת העצבים. נזק neurite חמור ותפקוד סינפטית להתרחש במחלות ניווניות שונות ניוון הקשורות לגיל. חקירת מנגנוני הווסת neurite מוצלח לא רק לשפוך אור יקר על תהליכים התפתחותיים במוח אלא גם על הפרעות נוירולוגיות כאלה. בשל יעילות ההתפתחות הנמוכה, הוא כרגע מאתגר ללמוד את ההשפעה של חלבון מסוים על neurite מוצלח בנוירונים היונקים העיקריים. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לחקירה של neurite מוצלח ידי שיתוף ההתפתחות של נוירונים בקליפת המוח הראשי עם egfp וחלבון של עניין (פוי). שיטה זו מאפשרת זיהוי של הנוירונים מנוכר פוי באמצעות אות egfp, ובכך את ההשפעה של פוי על neurite מוצלח ניתן לקבוע בדיוק. זה מבוסס EGFP מספק גישה נוחה לחקירה של מסלולים ויסות neurite outgrowth.

כדי לבדוק מתודולוגיה זו, השתמשנו cyto D ואת גורם הגדילה העצבי ngf, אשר הוכחו לעכב ולעורר neurite מוצלח בהתאמה14,15,16. אורך neurite של נוירונים מנוכר עם EGFP נמדדו לאחר הטיפול עם Cyto D או NGF. היעילות של התרגום של EGFP לנוירונים הייתה 2.7% (1,068 נוירונים שנספרו). כפי שמוצג באיור 1, Cyto D דיכאneurite הארכהבצורה תלוית מינון. לעומת זאת, neurite מוצלח...

בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור לימוד neurite מוצלח בנוירונים הקליפת המוח העובריים על ידי שיתוף הפעולה עם egfp ואת חלבון הריבית.

משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

יעילות transfection נמוכה היא מכשול מרכזי כדי לקבוע כיצד חלבון מחדש נויריט תיעוב בנוירונים ראשוניים. הפרוטוקול שלנו להתגבר על בעיה זו על ידי שיתוף transfection של EGFP כדי לזהות תאים שהועתקו בהצלחה. שיעור השיתוף-transfection הגבוה של EGFP וחלבוני הריבית מבטיחים את דיוק ההתוודאות.וכתוצאה מכך, כתמי שפעת חיסונית נדרשים כעת. כמו גידול neurite מתרחשת במהלך התחדשות עצבית, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על זיהוי של מטרות חדשניות לשיקום הרשת העצבית פגום בטראומה מוחית או מחלות ניווניות. לפני תחילת ההליך, מניחים כיסוי עגול סטרילי של 18 מילימטר לתוך כל באר של צלחת תרבות רקמות 12 היטב ומעיל כל מכסה עם חמישה מיקרוגרם למילימטר של פתרון פולי-D-ליזין באינקובטור 37 מעלות צלזיוס לח במשך שעה אחת לפחות.בסוף הדגירה, שאפו את תסנובת הפולי-די-ליסין ושטוף את הכיסויים במים סטריליים. ביום העוברי 18, מניחים את הרחם שנקטף מעכברוש ספראג דאוולי בהריון מתוזמן לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ ולהשתמש מספריים לנתח קטן כדי לפתוח את הרחם ואת שיכר מי האמון. השתמש במספריים כדי להסיר את שליה ולהשתמש ממטרים להעביר עובר שלם אחד לתוך צלחת פטרי חדש 10 ס"מ המכיל גלוקוז PBS צונן.השתמש במספריים כדי לחתוך לאורך התפר sagittal של הגולגולת ולהשתמש מרית שטוחה קטנה להעביר את המוח העוברי לתוך צלחת פטרי חדש 10 ס"מ המכיל קרח טרי קר PBS גלוקוז. באמצעות שני פינצטה מספר חמש ומיקרוסקופ ניתוח, להפריד את שתי ההמיספרות המוחיות מן המוח הקטן גזע המוח ולהסיר את קרום המוח. לאחר מכן לבודד את קליפת המוח מן ההמיספרות המוחיות ולמקום את קליפת המוח בצינור 15 מיליליטר המכיל גלוקוז PBS קר קרח טרי.לתרבות נוירונים קליפת המוח העיקרית, ב ארון biosafety בכיתה II, לאפשר קליפת המוח להתיישב על ידי כוח הכבידה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני החלפת גלוקוז PBS עם 0.05% טריפסין EDTA. מערבבים עם הקשה עדינה לה דגירה הרקמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות עם הקשה עדינה נוספת כל שתי דקות. בסוף הדגירה, לעצור את העיכול עם ארבעה מיליליטר של מדיום תחזוקה ולהשתמש פיפטה מיליליטר אחד כדי לנטרל את הרקמה עם טריטורציה עדינה.להרוס את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של אמצעי תחזוקה עבור צנטריפוגה שנייה. תן מחדש את גלולה נוצר לאחר הצנטריפוגה השנייה במיליליטר אחד של מדיום תחזוקה טרי לספירה צלחת הנוירונים מבודדים ב 6.5 פעמים 10 לתאים קיימא הרביעית ריכוז בריבוע סנטימטר אחד של אמצעי תחזוקה לאורך 12 צלחת היטב. לאחר יומיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לדלל EGFP וחלבון היעד פלסמיד DNAs ו reagent transfection בשני צינורות נפרדים 1.5 מיליליטר ולאחר מכן לערבב אותם יחד.לשנות את התאים עם מבנה EGFP על ידי הוספת תערובת transfection ל בארות. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים עם 37 מעלות צלזיוס PBS ולתקן אותם עם 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים עם PBS טרי לכל לשטוף ולהוסיף נפח מינימלי של מדיום הרכבה פלואורסצנטי על שקופית אחת זכוכית מיקרוסקופ לכל מדגם.לאחר מכן העבר בזהירות את הכיסויים הצפויים למדיית ההרכבה כאשר הדגימות פונות לשקופיות הזכוכית. כדי לדמיין את צמיחת הנויטריט, בחר את המטרה 40X במיקרוסקופ epifluorescent ולחץ להתחיל ללכוד תמונות של לפחות 40 נוירונים חיוביים EGFP שלמים לכל transfection. כאשר כל neurites כבר בתמונה, לפתוח את התמונות שנתפסו ImageJ עם תוסף NeuronJ ולמדוד את האורך של neurite הארוך ביותר של כל נוירון מגוף התא לקצה חרוט הצמיחה.לאחר מכן לנתח את הנתונים שהושגו עם התוכנה כדי לקבוע את ההשפעה של חלבונים ממוקדים על צמיחת neurite. ציטוכלאסין D מדכא הרחבת neurite באופן תלוי מינון בעוד צמיחת neurite משופרת נוירונים שטופלו עם גורם גדילה עצבי. בנוסף, חלבון מתאם הצמיחה העצבי FE65 מגרה באופן משמעותי גידול של נויריט פי שניים בהשוואה לנוירונים לא פתורים.למרות יעילות transfection נמוכה, ניתוח immunofluorescence מגלה כי מעל 80% של תרבות תאים יומיים ניתן לבצע בהצלחה שיתוף פעולה עם EGFP ו FE65. ביטוי EGFP מזוהה בשש שעות לאחר ההמרה בעוד FE65 מזוהה לראשונה בשעה 12 ושני האותות מזוהים עד שבעה ימים לאחר ההמרה. ההטמנה של נוירונים קליפת המוח עכברוש ראשי עם כמויות שונות של FE65 פלסמיד DNA מגלה עלייה תלוית מינון בהרחבת neurite עם 0 עד 0.5 מיקרוגרם של FE65 פלסמיד.עם זאת, אין הבדל משמעותי בצמיחה נצפתה נוירונים מנוקטים עם 0.5 או מיקרוגרם אחד של פלסמיד. בעת ניסיון הפרוטוקול, חשוב לבודד את האזור המתאים מהמוח העוברי. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על המחקר של צמיחה עצבית בנוירונים אנושיים שמקורם iPSC אשר יש כלים יקרי ערך לרפואה רגנרטיבית.

an-enhanced-green-fluorescence-protein-based-assay-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הדמיה תא חי היא של כלי מסוים כאשר לומדים את הדינמיקה של סחר אברון. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בנוירונים בתרבית שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גמיש ניתן להתאים האברונים תמונה אחרים כגון המיטוכונדריה, endosomes, ואת peroxisomes.

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

FRAP נעשה שימוש כדי לכמת את הניידות של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מתויג חלבונים בתאים בתרבית. בדקנו את השברים הנייד / נייח של ה-GFP על ידי ניתוח שחזור אחוז הקרינה לאחר photobleaching. במחקר זה, FRAP בוצעה על עמוד השדרה של נוירונים בהיפוקמפוס.

שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) של החלבונים המתויגים הקרינה הקוצים הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה מבוססת לומינסנציה להערכת הרעילות העצבית של תרכובות מולקולות קטנות המקדמות צמיחה עצבית על יכולת הקיום של נוירונים שמקורם ב-hNPC. הבדיקה מודדת את רמת ה-ATP התוך-תאית, אינדיקטור לכדאיות התא, כדי להעריך רעילות עצבית לאחר טיפול בתרכובת בדיקה.

בדיקה מבוססת Luminescence להערכת רעילות עצבית של תרכובות בדיקה על נוירונים

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקה אימונופלואורסצנטית מבוססת EGFP כדי לזהות את היעילות של חלבוני מטרה על צמיחת נוירונים עצביים ראשוניים בקליפת המוח. תאי העצב הראשוניים נגועים בחלבון פלואורסצנטי, EGFP וחלבון מטרה, ולאחר מכן מתבצעת בדיקה חיסונית כדי לחקור את ההשפעה של חלבון המטרה על צמיחת נוירוטים.

בדיקת Immunofluorescence להערכת ההשפעה של חלבוני מטרה על צמיחת נוירויט

פלסטיות עצבית היא תכונה מוכרת יותר ויותר, אבל הבינה מספיק של מערכת העיכול (GI). כאן, בדוגמא של הפרעות לבלב אנושיות, אנו מציגים assay neuroplasticity במבחנה לחקר פלסטיות עצבית במערכת העיכול ברמה שני מורפולוגיים ופונקציונלית.

הדמיית הלבלב Neuroplasticity:<em&gt; במבחנה</em&gt; Dual-נוירון פלסטיות Assay

המורפוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים מכריעים שבבסיס התפתחות מוח תקין. כאן אנו מתארים שיטות לתמרן גנטי נוירונים בתרבית המוח הקטן גרגיר והמוח קטן מתפתח להערכה של מורפולוגיה ומאפייני נדידה של תאי עצב.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

אנו מתארים של assay אופטי עבור שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור בנוירונים בתרבית. שילוב פרוטוקול זה עם תרביות תאים כפול לבטא סמן presynaptic וחלבון עניין מאפשר לנו לאתר אתרי presynaptic, שלהם שלפוחית סינפטית מיחזור קיבולת, ולקבוע את תפקידו של החלבון עניין.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה לneurite מוצלח הערכה ורעילות המוח של תרכובות מולקולה קטנה.

Neurite Outgrowth שיטת והערכה רעילות נוירועם האדם העצבי תא מחולל נוירונים

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

באמצעות עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים, מתוארים פרוטוקולים מפורטים להערכת הובלה אקסונאלית in vivo של אנדוזומים איתות ומיטוכונדריה בתוך אקסונים מוטוריים וחושיים של העצב הסיאטי השלם בחיות חיות.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

למדו פרוטוקול לחקר צמיחת נויריטים בנוירונים קורטיקליים עובריים של עכברוש באמצעות שיתוף-הזרקה עם EGFP. השיטה משפרת את יעילות ההזרקה ומאפשרת זיהוי מדויק של תאים מוזרקים לחקר מחלות נוירודגנרטיביות.

משופרת ירוק מבוסס חלבון פלואורסצנטית מבוססת על לימוד Neurite Outgrowth בנוירונים ראשוניים

גלה סרטונים נוספים