Name: שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: למד שיטה חישובית לניטור היווצרות דומיינים כרומטיניים מווסתי PRC2 בתאי גזע עובריים של עכברים באמצעות CRISPR/Cas9. השיטה מאפשרת עצירה זמנית לניתוח שינויים דינמיים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר ל. ואלס, ד. Ozata ו-H. Mou לתיקון כתב היד. מעבדת D.R. נתמכת על ידי המכון הרפואי הווארד יוז והמכונים הלאומיים לבריאות (R01CA199652 וR01NS100897).

דור של inducible הצלה mESCs
1. תרבית תאים
<ol><li>השתמש ללא מאכיל C57BL/6 בתאי גזע עובריים של העכבר (mESCs) בעל משולב באופן בלתי נשכח CreERT2 טרנזגנטי, אשר ניתן לאתר את הגרעין על הממשל של 4-הידרוקסיטמוקסיפן (4-OHT)13.</li>
	<li>לגדול mESCs ב-בינונית ESC קונבנציונאלי14,15, בתוספת עם 1000 U/mL בחיי, 1 μm טיפשה מעכב PD0325901 ו 3 μm GSK3 מעכב CHIR99021. עבור מדיום הרגיל ESC, השתמש בנוק-אאוט המכיל 15% סרום של שור עוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין ו 0.1 mM 2-mercaptoethanol.</li>
	<li>להשתמש לוחות מצופה עם 0.1% הג פתרון עבור culturing mESCs.</li>
</ol>2. הדור של נוקאאוט שבטים (KO) mESCs
<ol><li>מדריך עיצוב RNAs (gRNAs) כדי למחוק Exon 10 ו Exon 11 של עותק אנדוגני של mESCs באמצעות כלי העיצוב CRISPR בספסל16. הרובוט-ko-grna-1 מטרות אינטרון מיד הזרם של אקסון 10 ו--KO-grna-2 מטרות אינטרון מיד במורד הזרם אקסון 11. היישום הסימולטני של gRNAs האלה מוחק הן Exon 10 ו-Exon 11 על ידי הצטרפות לא הומוולוגי (NHEJ).</li>
	<li>שיבוט gRNAs לתוך pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) באמצעות הוראות רן et al., 201317.</li>
	<li>בפורמט 6-היטב, transfect 2 x 105 mESCs עם 1 מ ג של כל ד. ל. Ko-grna-1 ו-שולחן ה-Ko-grna-2 (ראה טבלה של חומרים) באמצעות הזיהום מגיב על ידי ביצוע הוראות היצרן. שינוי התקשורת 24 שעות לאחר הזיהום.</li>
	<li>יומיים לאחר ההעברה, לבודד את התאים החיוביים GFP באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS). צפו ליעילות השינוי בסביבות 10-30%. למיין סביב 5 x 105 תאים כדי ללכוד מספיק תאים gfp חיוביים לציפוי.</li>
	<li>צלחת מבודדת GFP חיובי mESCs לתוך 15 ס מ מצופה מראש עם 0.1% ג'לטין (10-20 x103 תאים לכל צלחת) עבור קטיף המושבה.</li>
	<li>הגדל את התאים באמצעי ESC במשך שבוע עד שמושבות בודדות יהיו גלויות. . להחליף את התקשורת כל יומיים</li>
	<li>בחר מינימום של 48 מושבות באמצעות 20 μL מיקרופיפטה טיפ. מגרדים את המושבה בזמן. שאתה מוריד את המיקרופיפטה אל תשבור את המושבה. לתאים בודדים להעביר את המושבה לתוך המאהאז (20 mL) 96 צלחת היטב.</li>
	<li>מודקון את המושבות במשך 10 דקות ב 37 ° c עד כל התאים מנוכה.</li>
	<li>הוסף 200 mL של מדיית ESC לתוך כל טוב באמצעות הצינורות רב-ערוצי.</li>
	<li>מערבבים היטב את התאים לתוך שני 96 בנפרד לוחות היטב באמצעות צינורות רב-ערוצי.</li>
	<li>השתמש באחד הצלחות 96 היטב עבור הגנוקלדה ולשמור על השני גדל עד המסקנה הגנוזה. השתמש בפתרון החילוץ DNA כדי לחלץ דנ א מ 96 צלחת הבאר על ידי ביצוע הוראות היצרן.</li>
	<li>השתמש ב-גנוהקלדה התחל Gnt_EED-KO-up ו -Gnt_EED-KO_down, אשר לאורך האתר נמחק ולבצע את ה-PCR הגנוזה עם taq DNA פולימראז בעקבות הוראות היצרן. הערה: סוגים אחרים של השימוש בדנ א יכול לשמש גם עבור הגנוטיפים, עם זאת, Taq DNA פולימראז מציע נוחות כמו תגובת ה-PCR יכול ישירות להיות טעון על ג'ל כאשר מאגר התגובה שלה בצבע משמש.<ol>
<li>צפו במוצר ה-DNA של משקל מולקולרי נמוך בתאים עם מחיקה homozygous יחסית למקרה פראי (WT). הערה: כדי ליצור תאים PRC2 null, homozygous מחיקה של exons 10 ו -11 היא הכרחית לערער ולבזות, יחידת משנה חיונית של ליבה PRC213. היעילות של המטרה היא. כ -10%</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאמת את מחיקת ה-בסיס 10 ו -11 ואובדן של חלבון ה-, באמצעות רצפי הרצף של סאנגר והמערב המערבי, בהתאמה.</li>
	<li>לאשר את דלדול של ה-H3K27me2/me3 מ כרומטין בתאי ה-, באמצעות שבב-seq באמצעות נוגדנים נגד H3K27me2/me3 ו-. השתמש בפרוטוקול שניתן ב Oksuz et al., 201715 עבור ניסויי שבב-seq.</li>
</ol>3. הנדסת mESCs לנמל הרבור הERT2 המבוסס על מinducible
<ol><li>עיצוב grna (-inducible) כדי להציג חתך בתוך אינטרון בעקבות אקסון 9 של באמצעות באמצעות כלי העיצוב crispr בספסל16 (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>שיבוט gRNAs לתוך pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) באמצעות הוראות רן et al., 201317.</li>
	<li>עיצוב ה-DNA תבנית התורם הכוללת רצף של ה-dna לאחר אקסון 9 ו-C-טרמינל דגל-HA תג במעלה של רצף T2A-gfp, הכל בכיוון הפוך ביחס לרצף הגן אנדוסוגני.<ol>
<li>האגף את הקלטת עם אחוי-מסדר ורצף פוליאדלציה מקונן בין הטרוולוגי לאתרים loxP הפוכה (lox66 ו lox71)18.</li>
		<li>כלול לפחות 500 bp של זרועות הומולוגיה מכל קצה. פצל את תבנית התורם לתוך 2 מקטעים של שברי גנים gBlocks (ראה בלוק-1, Gblocks-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" ו-Gblocks-2-כלוב-מוטציה "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") ולהרכיב אותם לתוך וקטור בוטה באמצעות גיבסון שיבוט בעקבות הוראות היצרן. הערה: gblock-2 מכיל שאריות ארומטיים (Y365) בתוך כלוב המידע החשוב לאינטראקציה עם H3K27me312. gBlock-2-Wt מכיל שאריות סוג פראי, ואילו gblock-2-כלוב-מוטציה מכיל את כלוב-המוטציה של (Y365A), לא מסוגל לחייב את H3K27me3. ההצלה Inducible WT הצלה מסומן כמו i-WT-r ו Inducible כלוב-מוטציה הצלה ההצלה מסומן כמו i-MT-r לנוחות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בתבנית 6-הבאר, transfect 2 x 105 mESCs עם 1 מ ג של grna (אני-grna-inducible) ו 1 מ"ג של תבניות התורם (i-WT-r או i-MT-r) באמצעות מגיב לבידוד ובידוד בתאי gfp חיוביים באמצעות facs.</li>
	<li>בצע את השלבים 2.3-2.11 כדי לבודד מושבות בודדות מוכן עבור מיקוד מוצלח.</li>
	<li>השתמש הקלדה התחל Inducible_Genotype-FW -1 ו -Inducible_Genotype-REV-1, אשר לאורך הקלטת שנוספה ולבצע PCR הקלדה באמצעות taq DNA פולימראז. הערה: יעילות המיקוד עבור CRISPR היא בסביבות 10%.<ol>
<li>אשר שילוב נכון של הקלטת על-ידי ה-PCR באמצעות Inducible_Genotype-FW-2 ו -Inducible_Genotype-REV-2 התחל, אשר נמצאים מחוץ לזרועות הומולוגיה. הערה: שילוב Homozygous של הקלטת הוא הכרחי כדי לבצע הצלה יעילה של הצוות. שים לב כי תאים עם אינטגרציה homozygous יפיק מוצר אחד גדול DNA בהשוואה ל-WT, אשר יפיק מוצר קצר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אשר את השילוב של הקלטת על-ידי רצף של סנגר.</li>
	<li>לאשר היפוך של הקלטת ואת הביטוי של PRC2 ורכיבי ליבה אחרים (למשל, EZH2 ו SUZ12) על ממשל 4-OHT על ידי המערב המערבי.</li>
	<li>לאשר את הביטוי של T2A-GFP ואחוז של להעיף ידי cy try זרימה. שים לב כי הביטוי של GFP הוא מעיד על היפוך של הקלטת ואת הביטוי של ה-משפט.</li>
</ol>4. בעקבות התגררות והפצת פעילות PRC2 על כרומטין
<ol><li>ודא כי i-WT-r ו-i-MT-r mESCs אין ביטוי דולף של GFP על ידי הזרמת cy, לנסות. במקרה של ביטוי דולף של GFP, לבודד תאים GFP-שליליים על ידי FACS לפני תחילת הניסוי.</li>
	<li>הרחב את i-WT-r ואני-MT-r mESCs לתוך 5 15 ס"מ לוחות (5x 106 תאים לכל צלחת).</li>
	<li>לגרום הבעה של WT או כלוב-מוטציה באמצעות מינהל של 0.5 mM 4-OHT עבור 0 h, 12 h, 24 שעות, 36 h ו 8 ימים (1 15 ס מ לתנאי). שנה את המדיה לאחר 12 h עבור טיפולים ארוכים יותר מ-12 שעות. בודד את התאים המשולבים מחדש בהצלחה על-ידי FACS באמצעות GFP. כוונן את זמן הטיפולים כך שכל התנאים ייאספו בו.</li>
	<li>בצע שבב-seq עבור H3K27me2, H3K27me3 לחקור את התצהיר הזמני שלהם כרומטין בתגובה לביטוי מחדש של WT או כלוב-מוטציה ב. השתמש בפרוטוקול שבב-seq כולל הכנה לספריה המפורטת ב-Oksuz et al., 201715.</li>
	<li>השתמש בבקרת הדקר בכל מדגם כדי לאפשר השוואה כמותית בין נקודות זמן שונות19.<ol>
<li>עבור שליטה ספייק, השימוש כרומטין מדרוסופילה מלאנוסטר (ביחס 1:50 לכרוטין הנגזרת מהsc), כמו גם לדרוזוהילה H2Av נוגדן ספציפי (1 μl של נוגדן H2Av לכל 4 μg של דרוזוהילה כרומטין על פי הוראות היצרן) בכל דוגמה.</li>
		<li>הכינו את הכרוטין מדרוסופילה באופן דומה לזה מmESCs באמצעות הפרוטוקול המפורט Oksuz et al., 201715.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מפה את הרצף קורא עבור שבב-seq כדי mm10 הגנום עם Bowtie 2 באמצעות פרמטרים ברירת המחדל20.</li>
	<li>לנרמל את העכבר שבב-seq קורא לדקר ב Drosophila ילה לקרוא ספירות21. חשב את פקטור הנורמליזציה של הדקר באמצעות הנוסחה הבאה: 1 x 106/מיוחד של דרוזוהילה הקורא ספירות. מצפים לקבל בערך 1 x 106דרוזוהילה לקרוא ספירות ו 20 x 106 העכבר סופר לכל ניסוי.<ol>
<li>כאשר אתה מסדר את דגימות הקלט, אל תכלול את הכרומטותין .</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש בכלי genomecov מכלי המיטה כדי להמיר קובץ bam לתוך bedtools22. בשלב הבא, המירו את המיטה לקובץ הפאה הגדולה בעזרת הכלי מיטה מUSCS23,24. עיין בקובץ ה-script הבא: gen = "הנתיב אל mm10 הגנום" chr = "נתיב לגודל כרומוזום mm10" inp_bam = "הנתיב אל קלט bam הקובץ" הכפל = "חישוב פקטור הנורמליזציה של הדקר" כלים למיטה genomecov-bg-$multiply-ibam $inp-g $gen > פלט. בדפורגרף מיון-k1, 1-k2, 2n פלט. בדפורגרף > output_sorted. בoutput_sorted ביגרפיטופאה. ב$chr output.bw
</li>
	<li>להמחיש את הצפיפות שבב-seq לקרוא על ידי העלאת קבצים פורסמים בדפדפן USCS הגנום24.</li>
</ol>5. ניטור הופעתה וצמיחה של H3K27me3 וקדי בגרעין mESCs
<ol><li>צלחת 1x 104 mESCs לתוך 8-היטב שקופיות קאמרית מצופה מראש עם 0.1% ג'לטין.</li>
	<li>למחרת, להתחיל לבצע ברציפות 4-OHT (0.5 מ"מ) השראות לאסוף את התאים ביטוי ד. א. עבור נקודות הזמן שצוין (0 h, 12 h, 24 h ו 36 h). שנה את המדיה לאחר 12 h עבור טיפולים ארוכים יותר מ-12 שעות.</li>
	<li>תקן את mESCs עם 4% פאראמפורמלדהיד בתמיסת מלח (PBS) בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות.</li>
	<li>החדירות התאים עם PBS/0.25% טריטון X-100 בשעה RT עבור 30 דקות.</li>
	<li>לחסום את התאים עם ה-PBS/5% סרום חמור/0.1% טריטון X-100 (חסימת מאגר) ב RT עבור 30 דקות.</li>
	<li>לדלל H3K27me3 נוגדן ראשי 1:500 במאגר חסימת ולהוסיף על התאים.</li>
	<li>מודיית את התאים עם הנוגדן העיקרי לילה ב 4 ° c.</li>
	<li>למחרת, לבצע 3 שוטף עם PBS/0.1% טריטון X-100.</li>
	<li>לדלל נוגדן משני (אלקסה פלורינציה 595) 1:1000 במאגר חסימת ולהוסיף על תאים.<ol>
<li>בצע את כל הincubations בחושך בשלבים הבאים כמו נוגדנים משני מצועם אלקסה Fluor הם רגישים באור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מודיית את הנוגדן המשני עבור 2 h ב RT.</li>
	<li>לבצע 3 שוטף עם PBS/0.1% טריטון X-100.</li>
	<li>לדלל DAPI (1 מ"ג/mL) 1:4000 עם PBS/0.1% טריטון X-100 ולהוסיף על תאים.</li>
	<li>דגירה את התאים עם DAPI עבור 10 דקות ב RT.</li>
	<li>הר את התאים עם הר אקווה.</li>
	<li>התמונה התאים עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בהגדלה 63 x.</li>
	<li>עיבוד וצבע מדומה לתמונות באמצעות התפלגות ImageJ, פיג'י25.</li>
</ol>

<ol><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li>
<li>Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Domains%3A+An+Important+Facet+of+Genome+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation.</a> Bioessays. 39 (12), (2017).</li>
<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polycomb+complex+PRC2+and+its+mark+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Polycomb complex PRC2 and its mark in life.</a> Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).</li>
<li>Holoch, D., Margueron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+Regulating+PRC2+Recruitment+and+Enzymatic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).</li>
<li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+polycomb-group+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).</li>
<li>Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+activity+associated+with+a+human+multiprotein+complex+containing+the+enhancer+of+zeste+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein.</a> Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).</li>
<li>Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+enhancer+of+Zeste%2FESC+complexes+have+a+histone+H3+methyltransferase+activity+that+marks+chromosomal+Polycomb+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites.</a> Cell. 111 (2), 185-196 (2002).</li>
<li>Müller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+activity+of+a+Drosophila+Polycomb+group+repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex.</a> Cell. 111 (2), 197-208 (2002).</li>
<li>Ferrari, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb-Dependent+H3K27me1+and+H3K27me2+Regulate+Active+Transcription+and+Enhancer+Fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity.</a> Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).</li>
<li>Margueron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+polycomb+protein+EED+in+the+propagation+of+repressive+histone+marks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks.</a> Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).</li>
<li>Oksuz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+Onset+of+PRC2-Mediated+Repressive+Domain+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation.</a> Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).</li>
<li>Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erk1%2F2+activity+promotes+chromatin+features+and+RNAPII+phosphorylation+at+developmental+promoters+in+mouse+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs.</a> Cell. 156 (4), 678-690 (2014).</li>
<li>Oksuz, O., Tee, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+chromatin+modifications+in+response+to+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing chromatin modifications in response to ERK signaling.</a> Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).</li>
<li>Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2018).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Zhang, Z., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase-mediated+inversion+using+lox66+and+lox71%3A+method+to+introduce+conditional+point+mutations+into+the+CREB-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein.</a> Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).</li>
<li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+ChIP-Seq+normalization+reveals+global+modulation+of+the+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome.</a> Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDescostes%2C+N+%22R+package+version+1.2.1%22">R package version 1.2.1</a>. , (2019).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigWig+and+BigBed%3A+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li>
<li>UCSC Genome Browser Home. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu">https://genome.ucsc.edu</a> (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid%2C+Reversible%2C+and+Tunable+Method+to+Regulate+Protein+Function+in+Living+Cells+Using+Synthetic+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules.</a> Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).</li>
<li>Højfeldt, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+H3K27+methylation+can+be+established+de+novo+by+SUZ12-directed+PRC2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).</li>
</ol>

D.R. הוא שותף מייסד של קונסטליישן תרופות ו משען Therapeutics. מחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

גישה רבת עוצמה כלפי הבנת הפרטים המכניים במהלך היווצרות תחום כרומטין נתון, היא לשבש תחילה את התחום ולאחר מכן לעקוב אחר השיחזור שלה במהלך התאים. התהליך יכול להיות מושהה בכל עת במהלך השיקום כדי לנתח בפרוטרוט את האירועים המתבצעים. המחקרים הקודמים על תחומים כרומטין לא היו מסוגלים לפתור אירועים כאלה כפי שהם בוצעו בתנאים יציבים המצב (למשל, השוואת סוג פראי ונוקאאוט גן). כאן, אנו מתווה מערכת כדי להעריך את היווצרות דינמי של תחומים כרומטין, כפי שמסומן על ידי גיוס והפצת תחומים דכאניים PRC2 בתאים.
הצעד הקר...

הגנום eukaryotic הם מאורגנים מאוד ושינויים בנגישות כרומטין ישירות שולטת בתמלול גנים1. הגנום מכיל סוגים שונים של תחומים כרומטין, אשר מתאם עם הפעילות הטרנססקריפט ושכפול עיתוי2,3. תחומים אלה כרומותין טווח בגודל של קילוסים מספר (kb) ליותר מ 100 kb והם מאופיינים על ידי העשרה שינויים ברורים ההיסטון4. השאלות המרכזיות הן: כיצד נוצרים תחומים אלה וכיצד הם מופצים?
אחד מתחומי כרומטין המאופיינת ביותר הוא מאומץ באמצעות הפעילות של קומפלקס הדיכוי הרב פוליקומב 2 (PRC2). PRC2 הוא קומפלקס רב ממדי subunit המורכב מקבוצת משנה של קבוצת פולימסרק (pcg) של חלבונים5,6, ו לזרז את מונו-, di-ו טריתילציה של ליזין 27 של היסטון H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 משויכים למצב כרומטין דכאני, אך תפקידה של H3K27me1 אינו ברור6,11. אחד המרכיבים המרכזיים של PRC2, פיתוח אאקטודרם עובריים (שלוש), נקשר למוצר הסופי של PRC2 זרז, H3K27me3, דרך הכלוב הארומטי שלה ותכונה זו מביא לגירוי אלוסטריה של PRC212,13. הפעילות הPRC2 אנזימטית חיונית לשימור הזהות התאית במהלך הפיתוח כביטוי בלתי הולם של גנים מסוימים התפתחותיים, כי הם התווית עבור שושלת מסוימת, יהיה מזיק5,6 . לפיכך, להתיר את המנגנונים שבהם PRC2 מטפחת היווצרות של תחומים כרומטין דכאניים ביונקים היא בעלת חשיבות יסודית להבנת הזהות התאית.
כל המערכות הנסיוניות האחרונות שתוכננו לחקור היווצרות דומיין כרומטין כולל תחומים PRC2-תיווך כרומטין, בוצעו בתנאים יציבים, אשר אינם יכולים לעקוב אחר אירועי התפתחות של היווצרות תחום של כרומטין ב תאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מערכת סלולרית inducible העוקבת אחר גיוס והפצה ראשונית של תחומים כרומטין. באופן ספציפי, אנו מתמקדים מעקב אחר היווצרות של תחומים כרומטין PRC2 מתווכת המהווים H3K27me2/3. מערכת זו שיכולה ללכוד את הפרטים המכניים של היווצרות דומיין כרומטין, יכול להיות מותאם לשלב תחומים כרומטין אחרים, כגון תחומים למדו נרחב הכוללת או H2AK119ub או H3K9me. בשילוב עם טכנולוגיות גנומיקה והדמיה, לגישה זו יש את הפוטנציאל לטפל בהצלחה בשאלות מרכזיות שונות בביולוגיה כרומטין.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-הידרוקסיטאמוקסיפן (5 מ"ג)</td><td>סיגמא</td><td>H7904-5MG</td><td>לאינדוקציה של ביטוי EED</td></tr><tr><td>16% תמיסה מימית פרפורמלדהיד (10x10 מ"ל)מדעי</td> <td>מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>15710</td><td>לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985-023</td><td>לתרבית mESCs</td></tr><tr><td>2% תמיסת ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>G1393-100 מ"ל</td><td>עבור mESCs תרבית</td></tr><tr><td>Accutase 500 מ"ל</td><td>חדשני Cell Tech/FISHER</td><td>AT 104-500</td><td>עבור mESCs תרבית</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td> <td>Jackson immunoresaerch</td><td>711-585-152</td><td>עבור אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>Aqua-Mount הרכבה בינונית</td><td>FISHER/VWR</td><td>41799-008</td><td>עבור אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td><td>Fisher Sci</td><td>177445PK</td><td>לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד) - 10 מ"ג</td><td>Life Tech</td><td>D1306</td><td>למעכב ERK אימונופלואורסצנטי</td></tr>, <tr><td>PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>לתרבית mESCs</td></tr><tr><td>ESGRO עכבר רקומביננטי LIF חלבון</td><td>Millipore/Fisher</td><td>ESG1107</td><td>לתרבית mESCs</td></tr><tr><td>FBS תאי גזע מוסמכים</td><td>אטלנטה</td><td>S10250</td><td>לתרבית mESCs</td></tr><tr><td>גיבסון הרכבה מאסטר מיקס</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>לשיבוט תבנית תורם</td></tr><tr><td>מעכב GSK3, CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>לתרבית mESCs</td></tr><tr><td>H3K27me2 (D18C8) ארנב mAB</td><td>איתות תאי</td><td>9728S</td><td>נוגדן ל-ChIP-seq</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>איתות תאים</td><td>9733S</td><td>נוגדן ל-ChIP-seq</td></tr><tr><td>היסטון H2Av נוגדן (pAb)</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39715</td><td>בקרת ספייק אין עבור נוקאאוט ChIP-seq</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>לתרבית mESCs</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>לתרבית mESCs</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>LifeTech</td><td>11668019</td><td>לטרנספקציה</td></tr><tr><td>MangoTaq DNA פולימראז</td><td>ביולין</td><td>BIO-21079</td><td>לגנוטיפ PCR</td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל (10 מ"ל)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>לאימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא/רוש</td><td>P0781</td><td>לתרבית mESCs</td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>לשיבוט gRNA</td></tr><tr><td>תמיסת מיצוי DNA QuickExtract</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td>לגנוטיפ PCR</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שיבוט PCR אפס קהה</td><td>Thermo Fisher</td><td>K270020</td><td>לשיבוט תבניות תורם</td></tr> <tr><td>Primers/gBlocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-1</td><td></td><td></td><td>רצף: ctctggctactgtcaactag. gRNAs מתחברים ל-EED נוקאאוט ב-C57BL/6 ESCs עבור מערכות i-WT-r ו-i-MT-r.</td></tr><tr><td>רצף EED-KO-gRNA-2</td><td></td><td></td><td>: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. זוגות gRNAs לנוקאאוט EED ב-C57BL/6 ESCs עבור מערכות i-WT-r ו-i-MT-r.</td></tr><tr>רצף מושרה <td></td><td></td><td>EED-gRNA</td><td>: atggcaccccgaaattagaa. gRNA ותורם ליצירת מערכת i-WT-r ברקע EED-KO.</td></tr><tr><td>תורם</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA ותורם ליצירת מערכת i-WT-r ברקע EED-KO.</td></tr><tr>רצף מושרה <td></td><td></td><td>EED-gRNA</td><td>: atggcaccccgaaattagaa. gRNA ותורם ליצירת מערכת i-WT-r ברקע EED-KO.</td></tr><tr><td>i-MT-r תורם</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA ותורם ליצירת מערכת i-MT-r ברקע EED-KO.</td></tr><tr><td><פריימרים חזקים>גנוטיפיים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-FW-1</td><td></td><td></td><td>רצף: ctgtaggctgccatctgtga. אלל מסוג בר יפיק תוצר של 1.9 קילו-בייט. אלל נוקאאוט יפיק תוצר של 200 bp.</td></tr><tr><td>רצף Gnt-EED-KO-REV-1</td><td></td><td></td>: <td>agccagggctacacagagaa. אלל מסוג בר יפיק תוצר של 1.9 קילו-בייט. אלל נוקאאוט יפיק תוצר של 200 bp.</td></tr><tr><td>רצף Inducible_Genotype-FW-1</td><td></td><td></td><td>: tgcagtgaaacaaatttggaa. כאשר הקסטה מוכנסת, הפריימרים יפיקו 1863 bp. האלל מסוג הבר יפיק תוצר של ~200 bp.</td></tr><tr><td>רצף Inducible_Genotype-REV-1</td><td></td><td></td><td>: gagaggggtggcacttaaa. כאשר הקסטה מוכנסת, הפריימרים יפיקו 1863 bp. האלל מסוג הבר יפיק תוצר של ~200 bp.</td></tr><tr><td>רצף Inducible_Genotype-FW-2</td><td></td><td></td><td>: ccccctctctctctct. כאשר הקסטה מוכנסת, הפריימרים יפיקו 3200 bp. האלל מסוג הבר יפיק תוצר של 1560 bp.</td></tr><tr><td>רצף Inducible_Genotype-REV-2</td><td></td><td></td><td>: atgcctgggtgaatgaaaaaa. כאשר הקסטה מוכנסת, הפריימרים יפיקו 3200 bp. האלל מסוג הבר יפיק תוצר של 1560 bp.</td></tr></tbody></table>

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

הארגון והמבנה של תחומי כרומטין הם ייחודיים לתאי תאים נפרדים. הטעות שלהם עלולה לגרום לאובדן זהות תאית ו/או מחלה. למרות מאמצים עצומים, ההבנה שלנו על היווצרות והתפשטות של תחומים כרומטין עדיין מוגבלת. תחומים כרומטין נחקרו בתנאים יציבים, אשר אינם מסייעות לעקוב אחר האירועים הראשוניים במהלך הקמתה. כאן, אנו מציגים שיטה ליצור מחדש תחומים כרומטין לשחזר ולעקוב אחר היווצרות שלהם כפונקציה של זמן. למרות, לראשונה מיושם על המקרה של PRC2-תיווך כרומטין היווצרות התחום, זה יכול להיות מותאם בקלות לתחומים אחרים כרומטין. שינוי ו/או שילוב של שיטה זו עם טכנולוגיות גנומיקה והדמיה יספק כלים יקרי ערך ללמוד את הקמתה של תחומים כרומטין בפירוט רב. אנו מאמינים ששיטה זו מהפכה את ההבנה שלנו לגבי אופן הפעולה של תחומים כרומטין ואינטראקציה זה עם זה.

תוכנית כללית של מערכת ההצלה המותנית איור 1 מראה את התוכנית מיקוד כדי להציל באופן מותנה תאים מבוססי KO עם או WT או כלוב-המוטציות (Y365A) המתבטאת כי הוא מתבטא מתוך לוקוס מסוגני. לאחר הפסקת הפעולה של ה-PRC2, יחידת משנה של הליבה החיונית עבור היציבות והפעילות האנזימטית שלה, קלטת בתוך אינטרון בעקבות אקסון 9 של המערכת הציגה (איור 1). הקלטת כוללת את הרצף הנותר של שלוש שנות ה-Dna, בכיוון הפוך ביחס לרצף הגנטי האנדוגני.  הקלטת מוקף הטרוולוגי אתרים הפוכי...

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

אנו מתארים מערכת להערכת היווצרות דינמית של תחומי כרומטין. אנו משתמשים במערכת זו כדי לעקוב אחר הגיוס וההפצה של תחומי כרומטין מתווכת PRC2 בתאים. ניתן להשהות את התהליך בכל עת כדי לנתח את האירועים המתבצעים.מערכת זו יכולה להיות מכוונת לפקח על שינויים דינמיים בכל תהליך סלולרי נתון ולכן אינה מוגבלת למעקב אחר היווצרות תחום כרומטין. התחל על ידי עיצוב מדריך RNAs כדי למחוק exon 10 ו 11 של עותק אנדוגני של התפתחות אקטודרמה עוברית, או EED, בתאי גזע עובריים העכבר באמצעות כלי עיצוב CRISPR. לשכפל את המדריך RNAs לתוך CRISPR / Cas9 פלסמיד על פי הוראות כתב היד.בתבנית של שש בארות צלחת, לשנות 200, 000 תאי גזע עובריים עכבר, או mESCs, עם מיקרוגרם אחד של כל מדריך RNA באמצעות reagents transfection על פי הוראות היצרן. שנה את המדיה 24 שעות לאחר ההמרה. יומיים לאחר ההמרה, בודדו תאים חיוביים ל-GFP באמצעות FACS.יעילות ההשתנות נעה בין 10% ל-30% כך שהם ממפים כ-500,000 תאים כדי ללכוד מספיק תאים חיוביים ל-GFP עבור ציפוי. צלחות התאים החיוביים GFP מבודדים לתוך צלחות 15 ס"מ כי הם מצופים מראש עם 0.1% ג'לטין לקטוף המושבה. הגדל את התאים במדיום ESC במשך כשבוע עד שיוקם מושבות בודדות, הקפד לשנות את המדיה כל יומיים.בחר מינימום של 48 מושבות באמצעות קצה פיפט 20 מיקרוליטר לגרד מעל המושבה תוך כדי שאפה. מבלי לפרק את המושבה לתאים בודדים, להעביר אותו לצלחת Accutase המכילה 96 בארות. דגירה המושבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לנתק את התאים.לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיית ESC לכל באר עם פיפטה רב-ערוצית. מערבבים היטב ומכנסים את התאים לשתי צלחות נפרדות של 96 בארות. השתמש באחת הצלחות עבור genotyping, ולשמור על השני גדל עד genotyping הוא סיכם.לחלץ DNA מהצלחת באמצעות רייגנטים מסחריים בעקבות הוראות היצרן. השתמש פריימרים genotyping המשתרעים על פני האתר שנמחקו לבצע PCR genotyping עם פולימראז DNA Taq. שימו לב למוצר DNA של משקל מולקולרי נמוך יותר בתאים עם מחיקה הומוזיגנית ביחס לתאי הבר.מדריך עיצוב RNA כדי להציג חתך בתוך intron הבא exon 9 של EED באמצעות כלי עיצוב CRISPR, ולשכפל אותו לתוך CRISPR / Cas9 plasmid על פי הוראות כתב יד. עצבו דנ"א של תבנית תורם הכולל את רצף ה-CDNA של EED לאחר אקסון 9 ותג C-terminal Flag-HA במעלה הזרם של רצף T2A-GFP, והכל בכיוון הפוך ביחס לרצף הגנים האנדוגניים. מאגפים את הקלטת עם קבלן-splice ורצף polyadenylation מקונן בין אתרי loxP הפוכים הטרולוגיים, וכוללים לפחות 500 זוגות בסיס של זרועות homology מכל קצה.לפצל את תבנית התורם לשני מקטעים של שברי גנים gBlocks, ולהרכיב אותם לתוך וקטור קהה PCR באמצעות שיבוט גיבסון בעקבות הוראות היצרן. בפורמט של שש בארות צלחת, להתחלף 200, 000 mESCs עם מיקרוגרם אחד של RNA המדריך מיקרוגרם אחד של תבניות התורם. לאחר מכן בודד תאים חיוביים ל- GFP באמצעות FACS.לבודד מושבות בודדות עבור genotyping על פי הוראות כתב יד. השתמש ציטומטריה זרימה כדי לאשר כי mESCs אין ביטוי דולף של GFP, ואם הם עושים, לבודד תאים GFP שלילי על ידי FACS לפני תחילת הניסוי. הרחב את התאים לחמישה לוחות 15 ס"מ, וגרם לביטוי של EED מסוג פראי או מוטנט כלוב על ידי מתן 5 מיקרומולרי 4-hydroxytamoxifen במשך חמישה משכי זמן שונים החל אפס שעות עד שמונה ימים.לשנות את התקשורת לאחר 12 שעות לטיפולים שנמשך זמן רב יותר מזה. לבודד את התאים recombined בהצלחה על ידי FACS באמצעות GFP, ולבצע ChIP-seq עבור H3K27me2 ו H3K27me3 כדי לחקור את התצהיר הזמני שלהם כרומטין בתגובה לביטוי מחדש של סוג פראי או מוטציה בכלוב EED. כדי לאמת את מערכות ההצלה הפראיות הבלתי ניתנות לחיסון וההצלה המוטנטית הבלתי ניתנת לחיסון, הכתם המערבי בוצע על תמציות שלמות לאחר אינדוקציה של EED מסוג פראי או מוטציה בכלוב עם טיפול 4-הידרוקסיטאמוקסיפן.ניתוח ציטומטריית זרימה שימש כדי לאשר את היעילות של ביטוי T2A-GFP בתאי i-WT-r לפני ואחרי הטיפול 4-hydroxytamoxifen, אשר מדגים את היפוך מוצלח של קלטת הפוכה. ChIP-seq של H3K27me3 בוצע לאחר ביטוי מחדש של EED מסוג פראי או מוטנט כלוב. הופעתו של H3K27me3 נצפתה ב 12 שעות לאחר ביטוי EED מסוג פראי באתרי גרעין דיסקרטי ולאחר מכן ב 24 שעות באזורים רחוקים מאתרי הגרעין הראשוני.ChIP-seq שימש גם כדי לעקוב אחר התצהיר הזמני של H3K27me2, אשר נראה לפני תצהיר H3K27me3. מוקדי H3K27me3 וצמיחתם הודמיו גם עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר 12 שעות של ביטוי EED מסוג פראי, יש ראיות של היווצרות מוקדי H3K27me3.מוקדים אלה להגדיל את מספר וגודל על ידי 24 שעות ובסופו של דבר להתפשט לאזורים גדולים של הגרעין על ידי 36 שעות. התכנון המדויק של מבני הדנ"א חשוב מאוד ליצירת מערכת ההצלה הבלתי ניתנת לעיכול הרצויה. שיטה זו יכולה לספק שליטה זמנית ומיוחדת של מוטציות של חלבונים בעכברים.בדרך זו, ניתן לקבוע את ההשפעה של מוטציות ברקמה מסוימת או בשלב מסוים של התפתחות. אנו משתמשים כעת במערכת זו כדי לפקח על הקמה דינמית של תחום כרומטין אחר, קומפלקס דיכוי פוליקומב 1.

a-method-to-study-de-novo-formation-of-chromatin-domains

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לגזירת כרומטין באמצעות עיכול אנזימטי מיקרוקוקלי נוקלאז. גזירת כרומטין היא שלב חיוני בתהליך העבודה של Chromatin immunoprecipitation או ChIp, אשר מסייע לחקור אינטראקציה חלבון-DNA בתאי לוקמיה מיאלואידית כרונית אנושית. בפרוטוקול התכונה חיתוך כרומטין מבוצע באמצעות סוניקציה.

חיתוך כרומטין: שיטה ליצירת מקטעי כרומטין באמצעות עיכול אנזימטי

השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

אנו מציגים immunoprecipitation ששונה כרומטין יליד רצף (צ'יפ-seq) מתודולוגיה לדור של רצף datasets מתאים נוקלאוזום צפיפות שבב-seq מסגרת אנליטית שילוב נגישות נוקלאז micrococcal (MNase) עם מדידות שינוי היסטון.

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

הפלסטיות המדהימה של אדריכלות גרעיני נשלטת על ידי מנגנוני epigenetic דינאמי כולל ללא קידוד RNAs, DNA מתילציה, שינוי מיקום נוקלאוזום וכן היסטון הרכב השינוי. כאן נתאר פרוטוקול Formaldehyde-Assisted בידוד של הרגולציה אלמנטים (שלהם) אשר מאפשר קביעת כרומטין נגישות בצורה פשוטה, זולה הדירים.

בסיוע פורמלדהיד בידוד של אלמנטים הרגולציה על אמצעי נגישות כרומטין בתאים בתרבית

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

פרוטוקול זה מציג טכניקה למיפוי ברזולוציה גבוהה של אתרי שכפול בכרומטין שהשתמר מבנית במקום המשתמש בשילוב של תיוג EdU-streptavidin-Nanogold טרום הטמעה וכרוממט.

הדמיה תחומים משכפלים בכרומטין אולטרה מובנה על ידי טומוגרפיה אלקטרונית

פרוטוקול זה מתאר את שיטת Capture Hi-C המשמשת לאפיון הארגון התלת-ממדי של אזורים גנומיים ממוקדים בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה, כולל גבולות של תחומים משויכים טופולוגית (TADs) ואינטראקציות כרומטין ארוכות טווח בין אלמנטים רגולטוריים ורצפי DNA אחרים.

פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

כאן אנו מציגים בפירוט התאמה של טכניקת לכידת קונפורמציית הכרומוזומים (3C) עם דגש על מעורבות ולמידה לתואר ראשון.

קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

אנו מציגים פרוטוקול צביעה וניתוח מיקרוסקופ מיקום כרומטין חד-מולקולי (SMLM) בשלושה צבעים, המאפשר מיפוי שכפול של אאוכרומטין, הטרוכרומטין ו-RNAP II לניתוח מרחבי. פרוטוקול זה מאפשר תיוג רב-צבעוני יעיל בסביבות גרעיניות צפופות, כולל מטרות הקשורות לכרומטין, ומאפשר גילוי סימולטני אמין.

פרוטוקול מיקרוסקופ מיקום מולקולה בודדת רב-תוויות לחקר כרומטין בסביבה גרעינית צפופה

למד שיטה חישובית לניטור היווצרות דומיינים כרומטיניים מווסתי PRC2 בתאי גזע עובריים של עכברים באמצעות CRISPR/Cas9. השיטה מאפשרת עצירה זמנית לניתוח שינויים דינמיים בזמן אמת.

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

גלה סרטונים נוספים