שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

אנו מתארים מערכת להערכת היווצרות דינמית של תחומי כרומטין. אנו משתמשים במערכת זו כדי לעקוב אחר הגיוס וההפצה של תחומי כרומטין מתווכת PRC2 בתאים. ניתן להשהות את התהליך בכל עת כדי לנתח את האירועים המתבצעים.

מערכת זו יכולה להיות מכוונת לפקח על שינויים דינמיים בכל תהליך סלולרי נתון ולכן אינה מוגבלת למעקב אחר היווצרות תחום כרומטין. התחל על ידי עיצוב מדריך RNAs כדי למחוק exon 10 ו 11 של עותק אנדוגני של התפתחות אקטודרמה עוברית, או EED, בתאי גזע עובריים העכבר באמצעות כלי עיצוב CRISPR. לשכפל את המדריך RNAs לתוך CRISPR / Cas9 פלסמיד על פי הוראות כתב היד.

בתבנית של שש בארות צלחת, לשנות 200, 000 תאי גזע עובריים עכבר, או mESCs, עם מיקרוגרם אחד של כל מדריך RNA באמצעות reagents transfection על פי הוראות היצרן. שנה את המדיה 24 שעות לאחר ההמרה. יומיים לאחר ההמרה, בודדו תאים חיוביים ל-GFP באמצעות FACS.

יעילות ההשתנות נעה בין 10% ל-30% כך שהם ממפים כ-500,000 תאים כדי ללכוד מספיק תאים חיוביים ל-GFP עבור ציפוי. צלחות התאים החיוביים GFP מבודדים לתוך צלחות 15 ס"מ כי הם מצופים מראש עם 0.1% ג'לטין לקטוף המושבה. הגדל את התאים במדיום ESC במשך כשבוע עד שיוקם מושבות בודדות, הקפד לשנות את המדיה כל יומיים.

בחר מינימום של 48 מושבות באמצעות קצה פיפט 20 מיקרוליטר לגרד מעל המושבה תוך כדי שאפה. מבלי לפרק את המושבה לתאים בודדים, להעביר אותו לצלחת Accutase המכילה 96 בארות. דגירה המושבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לנתק את התאים.

לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיית ESC לכל באר עם פיפטה רב-ערוצית. מערבבים היטב ומכנסים את התאים לשתי צלחות נפרדות של 96 בארות. השתמש באחת הצלחות עבור genotyping, ולשמור על השני גדל עד genotyping הוא סיכם.

לחלץ DNA מהצלחת באמצעות רייגנטים מסחריים בעקבות הוראות היצרן. השתמש פריימרים genotyping המשתרעים על פני האתר שנמחקו לבצע PCR genotyping עם פולימראז DNA Taq. שימו לב למוצר DNA של משקל מולקולרי נמוך יותר בתאים עם מחיקה הומוזיגנית ביחס לתאי הבר.

מדריך עיצוב RNA כדי להציג חתך בתוך intron הבא exon 9 של EED באמצעות כלי עיצוב CRISPR, ולשכפל אותו לתוך CRISPR / Cas9 plasmid על פי הוראות כתב יד. עצבו דנ"א של תבנית תורם הכולל את רצף ה-CDNA של EED לאחר אקסון 9 ותג C-terminal Flag-HA במעלה הזרם של רצף T2A-GFP, והכל בכיוון הפוך ביחס לרצף הגנים האנדוגניים. מאגפים את הקלטת עם קבלן-splice ורצף polyadenylation מקונן בין אתרי loxP הפוכים הטרולוגיים, וכוללים לפחות 500 זוגות בסיס של זרועות homology מכל קצה.

לפצל את תבנית התורם לשני מקטעים של שברי גנים gBlocks, ולהרכיב אותם לתוך וקטור קהה PCR באמצעות שיבוט גיבסון בעקבות הוראות היצרן. בפורמט של שש בארות צלחת, להתחלף 200, 000 mESCs עם מיקרוגרם אחד של RNA המדריך מיקרוגרם אחד של תבניות התורם. לאחר מכן בודד תאים חיוביים ל- GFP באמצעות FACS.

לבודד מושבות בודדות עבור genotyping על פי הוראות כתב יד. השתמש ציטומטריה זרימה כדי לאשר כי mESCs אין ביטוי דולף של GFP, ואם הם עושים, לבודד תאים GFP שלילי על ידי FACS לפני תחילת הניסוי. הרחב את התאים לחמישה לוחות 15 ס"מ, וגרם לביטוי של EED מסוג פראי או מוטנט כלוב על ידי מתן 5 מיקרומולרי 4-hydroxytamoxifen במשך חמישה משכי זמן שונים החל אפס שעות עד שמונה ימים.

לשנות את התקשורת לאחר 12 שעות לטיפולים שנמשך זמן רב יותר מזה. לבודד את התאים recombined בהצלחה על ידי FACS באמצעות GFP, ולבצע ChIP-seq עבור H3K27me2 ו H3K27me3 כדי לחקור את התצהיר הזמני שלהם כרומטין בתגובה לביטוי מחדש של סוג פראי או מוטציה בכלוב EED. כדי לאמת את מערכות ההצלה הפראיות הבלתי ניתנות לחיסון וההצלה המוטנטית הבלתי ניתנת לחיסון, הכתם המערבי בוצע על תמציות שלמות לאחר אינדוקציה של EED מסוג פראי או מוטציה בכלוב עם טיפול 4-הידרוקסיטאמוקסיפן.

ניתוח ציטומטריית זרימה שימש כדי לאשר את היעילות של ביטוי T2A-GFP בתאי i-WT-r לפני ואחרי הטיפול 4-hydroxytamoxifen, אשר מדגים את היפוך מוצלח של קלטת הפוכה. ChIP-seq של H3K27me3 בוצע לאחר ביטוי מחדש של EED מסוג פראי או מוטנט כלוב. הופעתו של H3K27me3 נצפתה ב 12 שעות לאחר ביטוי EED מסוג פראי באתרי גרעין דיסקרטי ולאחר מכן ב 24 שעות באזורים רחוקים מאתרי הגרעין הראשוני.

ChIP-seq שימש גם כדי לעקוב אחר התצהיר הזמני של H3K27me2, אשר נראה לפני תצהיר H3K27me3. מוקדי H3K27me3 וצמיחתם הודמיו גם עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר 12 שעות של ביטוי EED מסוג פראי, יש ראיות של היווצרות מוקדי H3K27me3.

מוקדים אלה להגדיל את מספר וגודל על ידי 24 שעות ובסופו של דבר להתפשט לאזורים גדולים של הגרעין על ידי 36 שעות. התכנון המדויק של מבני הדנ"א חשוב מאוד ליצירת מערכת ההצלה הבלתי ניתנת לעיכול הרצויה. שיטה זו יכולה לספק שליטה זמנית ומיוחדת של מוטציות של חלבונים בעכברים.

בדרך זו, ניתן לקבוע את ההשפעה של מוטציות ברקמה מסוימת או בשלב מסוים של התפתחות. אנו משתמשים כעת במערכת זו כדי לפקח על הקמה דינמית של תחום כרומטין אחר, קומפלקס דיכוי פוליקומב 1.