Name: טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: למדו שיטת טיהור לחלבון S100A12 האנושי ואוליגומרים הנגרמים מיונים לשימוש בגירוי מונוציטים. הפרוטוקול מספק תוצאה גבוהה וחלבון נקי מאנדוטוקסין למחקרים ביוכימיים וחיסוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מתוך תוכנית המחקר הרפואי חדשני של אוניברסיטת Muenster הפקולטה לרפואה (KE121201 ל-ק. ק.) וקרן המחקר הגרמני (DFG, Fo354/3-1 כדי D.F.).

<ol><li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li>
<li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation%3A+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li>
<li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron%28ii%29+binding+to+human+calprotectin%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+the+human+%28S100A8%2FS100A9%292+heterotetramer%2C+calprotectin%2C+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Ca2%2B+and+Zn2%2B+are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11(2009).</li>
<li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha%2C+S100a+%28alpha+beta%29%2C+and+S100b+%28beta+beta%29+protein%3A+Zn2%2B+regulates+Ca2%2B+binding+on+S100b+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li>
<li>Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C%2C+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li>
<li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li>
<li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis%3A+a+central+cell+surface+receptor+for+S100%2Fcalgranulin+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li>
<li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li>
<li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li>
<li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells%3A+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li>
<li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Strategies+for+Protein+Purification.+Handbook%22">Strategies for Protein Purification. Handbook</a>. , Freiburg, Germany. (2010).</li>
<li>Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+Purification%2C+and+Antimicrobial+Activity+of+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).</li>
<li>Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+S100+Protein-Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).</li>
<li>Magalhaes, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li>
<li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+removal+from+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li>
<li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li>
<li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+Ca2%2B-bound+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li>
<li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+-+Sartorius+Stedim+Biotech%22">Application Note - Sartorius Stedim Biotech</a>. , (2010).</li>
<li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li>
<li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha%2FNF-kappa+B+and+ERK1%2F2+pathways+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li>
<li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

בפרוטוקול זה, אנו מתארים ביטוי בקטריאלי ללא תג של S100A12 האדם ואת הטיהור שלה, כמו גם הפרדה לתוך שונים המושרה יון oligomers הנגרמת על ידי גירוי תא החיסון. בהשוואה לספרות שפורסמה על טיהור חלבון S100A128,23,24, השימוש גבוה cacl2 (25 מ"מ) ב הידרופובי-אינטראקציה כרומטוגרפיה היא לידע שלנו ייחודי. פרוטוקולים מספר החלת ריכוזים מ 1 עד 5 מ"מ לייצר חלבון טהור, ובכל זאת הבחנו בתשואה גבוהה מספר פעמים בעקבות הגישה שלנו באמצעות ה-2...

S100A12 הוא חלבון מחייב סידן אשר מופק בעיקר על ידי האדם גרנולוציטים. החלבון הוא ביטוי מוגזם במהלך (מערכתי) דלקת רמות הסרום שלה, במיוחד (אוטומטי) מחלות דלקתיות כגון דלקת מפרקים אידיופטית מערכתית (sJIA), קדחת ים תיכונית משפחתית (FMF) או מחלת קווסאקי (KD) יכול להודיע על פעילות מחלה ותגובה לטיפול. בהתאם לקולטני זיהוי תבניות (PRRs) כגון קולטנים למספרי חיוג (TLRs), מערכת החיסון הטבועה יכולה להיות מופעלת על-ידי תבניות מולקולריות הקשורות לפתוגן (PAMPs) כמו ליפופולפידים (LPS) או נזק דפוסי מולקולרי הקשורים (DAMPs; נקרא גם ' מדאיג '. DAMPs הם מולקולות אנדוגני כגון חלבונים סלולריים, שומנים או חומצות גרעין1. לח-פונקציות מתוארות היטב עבור חברי משפחת החלבון calgranulin, S100A8/A9 ו S100A122, אשר מדווחים גם לפעול כמו מתכת יון-הכלג1 פפטידים מיקרוביאלית3,4, 5,6. בהתאם ל-ion הזמין S100A12 יכול, כמו חברים אחרים של משפחת S100, לסדר לתוך הומומרים שונים עד לאחרונה ההשפעה של S100A12-oligomerisation התאמה על PRR-אינטראקציה, במיוחד TLR4, לא היה ידוע.
טופס monomeric של חלבון (92 חומצות אמינו, 10.2 kDa) מורכב משני מבנים EF-לולאה-סליל הסליל מחובר על ידי מקשר גמיש. C-טרמינל ef-יד מכיל את המוטיב הקלאסי של Ca2 +-מחייב בעוד N-טרמינל ef-יד המוצגים S100 חלבון-מבנה ספציפי לולאה מורחבת ("פסאודו-EF-יד") ומגלה Ca מופחת2 +-אהדה. Ca2 +-קשירה על ידי S100A12 יכול לגרום לשינוי הגדול ביותר של החלבונים ' C-הטרמינוס, אשר גורמת לחשיפה של תיקון הידרופובי על כל מונומר וצורות ממשק dimerization. כך, בתנאים פיסיולוגיים, המבנה הרבעוני הקטן ביותר שנוצר על ידי S100A12 הוא דיימר לא-חד-ממדי (כ -21 kda) שבו מונמרים בודדים נמצאים בכיוון אנטי מקבילי. כאשר מסודרים כמו dimer, S100A12 מדווחת Zn 2 + כמו גם יוני מתכתדיאטתיים אחרים, למשל, Cu2 + עם אהדה גבוהה7. היונים הללו מתואמים בממשק S100A12 דימר על ידי חומצות אמינו H15 וD25 של יחידת משנה אחת וH85, כמו גם H89 של משנה אנטי מקבילים השני8,9,10. בעוד מחקרים מוקדם יותר להציע zn2 +-טעון S100A12 עשוי לגרום לארגון של חלבון לתוך הומו-טטרמרס (44 kda) וכתוצאה מכך מוגברת Ca2 +-אהדה11,12, טיטור מתכת לאחרונה מחקרים6 מציעים Ca2 +-מחייב על ידי S100A12 כדי להגביר את הזיקה של חלבון zn2 +. לאחר S100A12 EF-הידיים מאוכלס באופן מלא על ידי Ca2 +, ca נוסף2 + הוא חשב לאגד בין dimers, מפעיל היווצרות הבוחנים (כ 63 kda). הארכיטקטורה של המבנה האפארי של ההקאמארה שונה בבירור מזו של הטטרמר. הוא הציע כי ממשק הטטרמר משתבש כדי לתת עלייה ממשקי dimer החדש, אשר מועילה היווצרות הבוחנים10. S100A12 מתבטא כמעט באופן בלעדי על ידי הגרנולוציטים האדם שבו הוא מהווה כ 5% חלבון ציטוסולג13. בפונקציה לח שלה S100A12 היה מתואר היסטורית כמו אגוניסט של multi-ליגציה עבור גליקטיון מתקדם מוצרי הקצה (זעם), ולאחר מכן כינה מוצרים שזוהו לאחרונה חלבון כריכת זעם (EN-זעם)14. אף על פי שדווחו קודם לכן כS100A12 ביוכימיים לזעם ולTLR415, הדגמנו לאחרונה מונוציטים אנושיים כדי להגיב לגירוי S100A12באופןהתלוי בTLR4. זה דורש הסדר של S100A12 לתוך Ca שלה2 +/zn2 +-המושרה מבנה הקסעון הרבע16.
כאן אנו מתארים הליך טיהור עבור רקומביננטי S100A12 האנושי ואת oligomers יון המושרה שלה לגירוי תא החיסון16,17. זה מבוסס על אסטרטגיה בעלת שני שלבים כרומטוגרפיה, אשר כוללת בתחילה טור anion-exchange כדי לבודד ולרכז את החלבון ולהסיר זהום בצובר (למשל, אנטוקסינים/ליפופוליסכרידים)18. לחילופין, כרומטוגרפיה שרפים חלבונים נפרדים על בסיס של חיובים שונים של פני השטח נטו. עבור חלבונים חומציים כמו S100A12 (נקודת איזואלקטריים של 5.81), מערכת מאגר עם pH של 8.5 ו שרף anion-exchange חזק מוביל הפרדה טובה. חלבונים מאוגדים הובלו עם מעבר מבריק של מאגר מלח גבוה. עם עלייה של יוני יוני שלילי החוזק במאגר להתחרות עם חלבונים עבור חיובים על פני השטח של שרף. חלבונים בנפרד elute בהתאם לחיוב הנטו שלהם וכתוצאה מכך, המאגרים המתוארים כאן מאפשרים לבודד ולרכז את החלבון S100A12 ביטוי יתר. בשל קבוצות טעונה שלילית ליפופוליסכדים, מולקולות אלה גם לאגד anion-exchange שרפים. עם זאת, החיוב הנטו הגבוה יותר שלהם מביא להאצלת מאוחר יותר את מעבר הצבע הגבוה של המלח. השלב השני של תהליך הטיהור הוצג לצורך הליטוש. זה עושה שימוש ביכולת כריכת הסידן של S100A12 ומסיר את הנותרים זיהומים על העמוד אינטראקציה הידרופובי. כריכת סידן של S100A12 מוביל לשינוי הקונפורמציה וחשיפה של טלאים הידרופובי על פני השטח של החלבון. במצב זה, S100A12 מקיים אינטראקציה עם משטח ההידרופובי של השרף. על ידי הסידן-מכלפת על ידי EDTA, אינטראקציה זו היא הפוכה. בנוכחות יונים, במיוחד סידן ואבץ, S100A12 מארגן לתוך הומומרים oligomers. כדי לחקור את מבנה היחסים בתפקוד של oligomers שונים, אנו התייצב dimeric, tetrameric ו hexameric רקומביננטי S100A12 עם מקשר כימי והפרידו את התסביכים על עמוד בגודל כרומטוגרפיה הדרה. לבסוף, כדי לנתח את הפונקציונליות ואת הפעילות הביולוגית של החלבון מטוהרים ואת oligomers המושרה היונים שלה, שחרור cy, S100A12 ו-LPS גירוי מונוציט ניתן להשוות.
שיטות שונות לטיהור S100A12 תוארו עד כה. ג'קסון ואח '19, למשל, פרסם פרוטוקול עם טיהור באמצעות עמודת anion-exchange וכרומטוגרפיה שלאחר הרחקה מהגודל. הליטוש טיהור על עמודה בעלת הגבלת גודל מוביל לתוצאות טובות, אך-בגלל לדוגמה לאמצעי אחסון מוגבלים בטעינה-הוא גמיש פחות במדרגיות. גישה שונה, שפורסם על ידי נשיקה ואח '20, מתאר טיהור של חלבון מתויג דרך Ni2 + טור אהדה כצעד הטיהור הראשון, ואחריו מחשוף אנזימטי כדי להסיר את התג ועוד שלבי הטיהור. בניגוד למחקרים שנערכו במהלך הלימודים19,20, החלבון המיוצר כפי שמתואר בפרוטוקול זה נקבע לניסויים על תאים חיסוניים. לכן, שארית זיהום אנטוקסין מהתרבות החיידקית היא אתגר. למרות שגישות שונות להסרת שורש הסרת רעלן כבר תוארו עד כה, אין שיטה אחידה הפועלת באותה מידה גם עבור כל פתרון חלבון נתון21,22.
לסיכום, הפרוטוקול שלנו משלב את היתרונות של ביטוי ללא תגית במערכת חיידקית עם הסרת אנטוקסין יעיל ותשואה גבוהה של חלבון טהור.

<table><tbody><tr><td>וקטור pET11b</td><td>Novagen</td><td>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td>BL21(DE3) מוסמך E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527</td><td>&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td><td><חזק>&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td>100x חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Merck</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>25% HCl</td><td>Carl Roth</td><td>X897.1</td><td></td></tr><tr><td>4& 20% ג'ל חלבון Mini-PROTEAN TGX</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין מלח</td><td>נתרן קארל רוט</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (ביס(סולפוסוקסינימידיל)סובראט) - 50 מ"ג</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט</td><td>קארל רוט</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 תמיסת עיכוב</td><td>BioRad</td><td>1610438</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 תמיסת צביעה</td><td>BioRad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ערכת העשרת מונוציטים אנושיים</td><td>תא גזע</td><td>19059</td><td>ערכת בידוד תאים שליליים מגנטיים</td></tr><tr><td>EDTA מלח דיסודיום דיהידרט</td><td>קארל רוט</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>קארל רוט</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>EndoLISA</td><td>Hyglos</td><td>609033</td><td>זיהוי אנדוטוקסין בדיקת</td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד ללא אנדוטוקסין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-011-A</td><td>מים טהורים במיוחד להכנת בופר נטול אנדוטוקסין</td></tr><tr><td>EndoTrap אדום</td><td>Hyglos</td><td>321063</td><td>שרף להסרת אנדוטוקסין</td></tr><tr><td>FBS (מנוטרל בחום)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Carl Roth</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (אשך אנדוטוקסין באיכות גבוהה)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td><td>BD</td><td>555212</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropyl-&szlig;-D-thiogalactopyranosid)</td><td>Carl Roth</td><td>CN08.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 מ"מ)</td><td>Merck</td><td>K 0282</td><td></td></tr><tr><td>LB-בינוני</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים מE. coli O55:B5</td><td>Merck</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, תמיסת</td> הפרדה <td>PAN</td> אנושית <td>Biotech P04-60500</td><td>(צנטריפוגה בשיפוע צפיפות)</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (10.000 U/mL)</td><td>Merck</td><td>A 2212</td><td></td></tr><tr><td>פניל ספרוז ביצועים גבוהים</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1082-01</td><td>שרף עבור כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופובית</td></tr><tr><td>Polymyxin B</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pmb</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>שרף לכרומטוגרפיה של חילופי אניונים</td></tr><tr><td>מאגר RoboSep</td><td>Stemcell</td><td>20104</td><td>מאגר הפרדת תאים (סעיף 5.1.4)</td></tr> <tr><td>RPMI 1640 בינוני</td><td>Merck</td><td>F 1215</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>קארל רוט</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>קארל רוט</td><td>P031.1</td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס</td><td>קארל רוט</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>אבץ כלוריד</td><td>קרל רוט</td><td>T887</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><חזק>מעבדה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 ומיקרו; m מסנן מזרק</td><td>Merck</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>14 מ"ל צינורות תחתונים עגולים</td><td>BD</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>2 ליטר בקבוק ארלנמאייר</td><td>קרל רוט</td><td>LY98.1</td><td></td></tr><tr><td>24 באר לוחות מתלים</td><td>גריינר</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>5 ליטר מדידה</td><td>קארל רוט</td><td>CKN3.1</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>קורנינג</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה מהירים 50 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>3,01,22,178</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 יחידת מסנן צנטריפוגלי MWCO 3 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 יחידת מסנן צנטריפוגלי MWCO 50 kDa</td><td>Merck</td><td>צלחת תרבות UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>(100 מ"מ)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרום</td><td>סגירת צינורות דיאליזה</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>מגנט EasySep 'The Big Easy'Stemcell</td><td></td> <td>18001</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אספן שברים 5 מ"ל</td><td>גריינר</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>סרט Lumox, 25 ומיקרו; מ', 305 מ"מ x 40 מ'</td><td>Sarstedt</td><td>94,60,77,316</td><td>סרט ללוחות תרבית מונוציטים</td></tr><tr><td>קרום דיאליזה ספקטרה/פור (3.5 kDa)</td><td>ספקטרום</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>יחידת מסנן סטריטופ</td><td>Merck</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 & deg; חממת C (עם טלטול)</td><td>ניו ברונסוויק סיינטיפיק</td><td>אינובה 42</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; מטהר KTA UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC System</td></tr><tr><td>אספן שברים</td> צנטריפוגה <td>GE Healthcare</td><td>Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>(עם רוטור A-4-81)</td> <td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>רוטור זווית קבועה</td><td>Eppendorf</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Brandelin</td><td>UW2070</td><td></td></tr><tr><td>קורא פלואורסצנטי</td><td>Tecan</td><td>אינסופי M200PRO</td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>Knick</td><td>765</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור של האדם s100a12 ואת היונים שלה הנגרמת oligomers עבור גירוי תא החיסון

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה כדי לטהר את החלבון האנושי מחייב S100A12 החלבונים ואת oligomers המושרה שלה מפני es, המנוכיה קולי התרבות לגירוי התא החיסונית. פרוטוקול זה מבוסס על אסטרטגיה בעלת שני שלבים כרומטוגרפיה, הכוללת את החלבון הטרום-טיהור בטור כרומטוגרפיה של anion-exchange וצעד נוסף ליטוש בטור של אינטראקציה הידרופובי. אסטרטגיה זו מייצרת חלבון S100A12 של טוהר גבוהה ותשואה על עלויות לניהול. עבור מוסר פונקציונלי על התאים החיסוניים בסופו של דבר שארית זיהום אנדוטוקסין דורש ניטור זהיר ועוד לנקות את הצעדים כדי להשיג חלבון אנדוטוקסין ללא. רוב זהום אנדוטוקסין יכול להיות מנשלל על ידי האניב-exchange כרומטוגרפיה. כדי לרוקן זהום שיורית, פרוטוקול זה מתאר שלב ההסרה עם מסננים צנטריפוגליים. בהתאם לS100A12 של כוח היון הזמין יכול לארגן הומוגוטיימרים שונים. כדי לחקור את הקשר בין מבנה לפונקציה, פרוטוקול זה מתאר עוד את יון-הטיפול של חלבון S100A12 ואחריו כימיים המקשרים לייצב S100A12 oligomers והפרדה הבאים שלהם לפי גודל-להדרה כרומטוגרפיה. לבסוף, אנו מתארים שיטת תא המאשרת את הפעילות הביולוגית של החלבון הטהור ומאשרת הכנה ל-LPS ללא תשלום.

בעקבות טיהור מראש בעמודת AIEX (איור 1א-ג) והבאים התלויים בסידן hic (איור 2א, ב), חלבון טהור מאוד הושג (איור 2c). בנוסף, מדידות של אנדוטוקסין חשף הסרת LPS מוצלחת. תוכן ה-LPS שלאחר AIEX נמדד בדילול 1:10 מעל למגבלת זיהוי ה, כלומר, מעל 500 האיחוד האירופי/mL. לאחר הסינון הראשון באמצעות יחידת סינון kDa 50, התוכן LPS הופחת ל-1 EU/mL. בעקבות ריכוז 3 kDa מסנן יחידת סינון נוסף דרך 50 kDa, זיהום LPS נמדד היה 0...

פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור ל-רקומביננטי הסידן מחייב חלבון בחינם S100A12 והוא המושרה היונים שלה עבור גירוי מונוציט אנושי.

טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

פרוטוקול זה מתאר הליך טיהור מלא עבור חלבון מחייב סידן אנושי, S100A12, ובמיוחד, עבור אוליגומרים שונים הנגרמים על ידי יונים עבור השלכות מחקר במורד הזרם. עם טכניקה זו, אנו מסוגלים לשמור על תשואה גבוהה של חלבון טהור מאוד נטול אנדוטוקסין. הצלבה כימית והפרדה בעמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל היא שיטה משכנעת ליצירת חלבונים הומו-אוליגומריים להמשך בדיקות תפקודיות.הטכניקה שלנו מאפשרת לנו היבטים מכניים של S100A12 כמו ליגנד קולטן זיהוי דפוס ומידע אמנות באופן אידיאלי לפתח התערבויות ממוקדות חדשות ולשפר בדיקות אבחון. בנוסף לצפייה בסרטון זה, אנו ממליצים על קריאה זהירה של הפרוטוקול, כפי שאנו מתארים הליך מורכב ורב שלב. כדי להתחיל, לחתוך צינורות דיאליזה לאורך המתאים, סביב 30 ס"מ, עם מקום נוסף לאוויר.משרים את הממברנה במים deionized במשך 15 עד 30 דקות כדי להסיר גליצרול. כדי להפחית את צמיגותו של פתרון החלבון המטוהר, לדלל את הפתרון עם 25 מיליליטר של חיץ AIEX A.Attach הסגירה הראשונה על הצינור. טוענים את הדגימה לתוך הממברנה ומצרפים את הסגירה השנייה לפחות סנטימטר אחד מהחלק העליון של הצינור.בחדר מקורר בארבע מעלות צלזיוס, מניחים את המיכל עם חיץ AIEX A על צלחת ערבוב, מוסיפים בר ערבוב, ואת הממברנה מלאה בתתברית חלבון. כוונן את המהירות כדי לסובב את הדגימה כך שלא תהיה הפרעה לסופת הסטייה המסתובבת. דיאליזה במשך 12 עד 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס ואז להחליף את החיץ דיאליזה עם חיץ מקורר מראש חינם A ולהמשיך לפחות ארבע שעות נוספות.מעבירים את תותב החלבון הדיאליזי מהצינור לצינור של 50 מיליליטר דרך יחידת סינון של 0.45 מיקרון. הפעל את FPLC עם תחזוקה כללית. חיבור מאגרי עמודות AIEX A ו- AIEX B לשסתומי מאגר ושף חילופי אניון המכילים עמודה ליציאות העמודות של FPLC.התאם את הפרמטרים הכרומטוגרפיים הכלליים בהתאם. הפעל את תוכנית AIEX בתוכנת FPLC ובחר את אמצעי האחסון לשווי משקל עבור מאגר A.לאחר מכן, לטעון את המדגם על העמודה ולהשתיק את החלבונים עם הדרגתי ליניארי מ 0% עד 100% מאגר מלח גבוה. לאסוף שני שברים מיליליטר במהלך elution.נתח את השברים האלמותיים לאחר סיום הריצה. לשם כך, לטעון 10 microliters של כל שבר על דף קומאסי מוכתם 15%SDS ולזהות שברים המכילים S100A12. בריכה אלה S100A12 המכיל שברים עבור דיאליזה לתוך מלוחים במאגר TRIS.כדי להמשיך את טיהור החלבון, לאחר דיאליזה חלבון, להוסיף סידן כלורי לדגימה לריכוז סופי של 25 מילימולר, אשר יקל על קשירה של S100A12 אלשרף בשלב הבא. לאחר מכן, לסנן את המדגם דרך מסנן עם גודל לשפוך של 0.45 מיקרון. לצייד מאגרי HIC ודגימות לארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, חבר את מאגרי העמודות HIC A ו- B ואת העמודה למערכת והתאם את הפרמטרים. התחל את השיטה כדי לצייד את העמודה עם אחד עד שני אמצעי אחסון עמודה של מאגר HIC A טען את המדגם ואת בלוק מדגם לא מאוגד לשטוף עם אות UV מגיע לרמה הבסיסית שוב. ואז להתחיל אלוטיון עם כלטור סידן המכיל חיץ EDTA.לאסוף שני מיליליטר של שברי שיא במהלך elution. לאחר ניתוח 10 מיקרוליטרים של כל שבר בעמוד קומאסי מוכתם 15%SDS לזהות שברי S100A12 טהורים. בריכה שברים אלה דיאליזה נגד HBS.ראשית, לטעון 15 מיליליטר של מדגם על יחידת סינון צנטריפוגלי 50 קילודלטון. צנטריפוגה ב 3200 פעמים גרם ב 10 מעלות צלזיוס במשך כ 10 דקות. מעבירים את הזרימה הסינון לתוך כלי טרי, על קרח.עכשיו, להשתמש מיליליטר אחד של HBS לשטוף את קרום המסנן לדילול של הפתרון מרוכז בקצה המסנן. צנטריפוגה שוב כדי לשחזר חלבון רב ככל האפשר בזרימה דרך. כדי לסנן את הפתרון, חזור על הטעינה והצנטריפוגה לדוגמה בתדירות הנדרשת.לאחר מכן, כדי לרכז את S100A12 המכיל זרימה דרך, לטעון אותו לתוך מסנן צנטריפוגלי שלושה קילודלטון צנטריפוגה ב 3200 פעמים g, 10 מעלות צלזיוס במשך כ 30 דקות. כעת עוצמת הקול מצטמצמת ל- 1/5 עד 1/10 מנפח הטעינה הראשוני. מעבירים את הפתרון המרוכז לצינור חדש.חזור על שלב הריכוז לעתים קרובות ככל הנדרש. לאחר הצלבה כימית, על פי כתב היד, לבצע כרומטוגרפיה הדרת גודל. לצייד את העמודה ב- HBS, לטעון את המדגם, ולאסוף שברי שיא של אחד עד שני מיליליטר במהלך הריצה.לאחר ניתוח שברים אלה בדף SDS הדרגתי של 4 עד 20%, שברי מאגר עם רצועות עיקריות של תסביך החלבון הרצוי. ואז לרכז את הפתרונות כפי שנעשה בעבר. כדי לבודד מונוציטים ממעילים אנושיים על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות, יש לצייד תחילה את פתרון ההפרדה לטמפרטורת החדר.מעבירים 20 מיליליטר ל-15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר, שני צינורות לכל מעיל באפי. לדלל את הדם מן מעיל באפי אנושי עם HBSS לנפח כולל של 60 מיליליטר ושכבה 30 מיליליטר של תערובת זו בזהירות על גבי מדיום ההפרדה. צנטריפוגה ב 550 פעמים g במשך 35 דקות בטמפרטורת החדר.כבה את הבלם של הצנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה, תאי הדם ההיקפיים המונונוקלאואריים ממוקמים ישירות על גבי מדיום ההפרדה. עם פיפטה, העבר את התאים האלה לצינור צנטריפוגה טרי ב-50 מיליליטר.ממלאים את הצינור עם HBSS ל 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב 170 פעמים g במשך 10 דקות. שאף את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולת התא בנפח קטן של HBSS על-ידי צינורות. לאחר מכן, למלא את הצינור עד 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב 290 פעמים g במשך 10 דקות.שאף שוב את העל-טבעי. תן שימוש חוזר בתאים ב-50 מיליליטר של HBSS וצנטריפוגה פי 170 למשך 10 דקות. שאפו את העל-טבעי והתינו מחדש את גלולת התא בנפח קטן של מיליליטר אחד של מאגר ההפרדה, ספורו את התאים והוסיפו חיץ לריכוז של פי 5 מ-10 לשבעת התאים למיליליטר.לבידוד מונוציטים מתאי דם היקפיים מונונוקלאריים, השתמש בערכת בידוד תאים שליליים מגנטיים ופעל בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש ב מונה תאים אוטומטי כדי לספור את המונוציטים ולתלות מחדש במדיום מונוציטים לריכוז של פי 2 10 עד ששת התאים למיליליטר. כדי לתרבות מונוציטים, לפרוס צלחת תרבות התא עם גז הידרופובי חדיר הסרט מתאים לתאים תלויים.מניחים את הצלחות תחת אור UV במשך כ 30 דקות עבור עיקור. מעבירים 15 עד 25 מיליליטר של ההשעיה התא לצלחות תרבות אלה ולתת להם לנוח לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר טרום טיהור בעמודת AIEX ו- HIC תלוי סידן לאחר מכן, הושג חלבון טהור מאוד.כבקרה נוספת, מונוציטים אנושיים היו מגורים עם LPS וייצרו חלבון מסוג בר. חשיפה לחלבון ליונים שונים גורמת לסידור של אוליגומרים שונים מסוג S100A12. הגדלת ריכוזי האבץ גורמת לסידור של S100A12 לתוך טטרם והקסמרים עם ההפרדה בדף SDS מוכתם בארבעה עד 20%.כאשר עודף של יונים הוחל לפני הצלבה, זה גרם לשינוי בולט של שיווי המשקל אוליגומרי. S100A12 היה מקושר צולבת בנוכחות סידן 25 מילימולר או סידן 25 מילימולר ואבץ מילימולר אחד. לאחר קישור צולב במאגר HBS עם 25 מילימולר סידן כלורי ואחד מילימולר אבץ כלורי, הקסמר וטרמר הופרדו.טטרמר ודימר הופרדו במאגר HBS עם 25 מילימולר סידן כלורי. דוגמה לאוליגומרים מרוכזים ומרוכזים לאחר ההפרדה בעמוד SDS מוכתם בקומאסי המוכתם בארבעה עד 15% מציגה עמעום, טטרמר והקסמר. גירוי מונוציטים עם S100A12 הקסדציטי הביא לשחרור אלפא TNF מבוטא.לאחר הסרת אנדוטוקסין, חשוב לא להציג מחדש את הזיהום לתוך הדגימות במהלך הדור הבא וטיהור של אוליגומרים. ניתוח במורד הזרם של כל תהליך הקשור אוליגומריזציה S100A12 הוא מתקבל על הדעת. באופן דומה, ניתן לנתח חומצות אמינו ותנאי יונים המשפיעים על תהליך האוליגומריזציה עצמו.אנו משתמשים כעת אוליגומרים S100A12 מופרדים על פי הפרוטוקול המתואר לפתח ליגנדים פפטיד ספציפיים ונוגדנים כדי לחסום את האיתות של החלבון באמצעות TLF4 ולפתח ולשפר בדיקות אבחון.

purification-human-s100a12-its-ion-induced-oligomers-for-immune-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקת כרומטוגרפיה של חילופי אניונים לטיהור S100A12 חלבון קושר סידן אנושי בהתבסס על מטען פני השטח נטו של החלבון מתרבית Escherichia coli.

טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה של Anion-Exchange: טכניקת הפרדה לבידוד חלבון מעניין מליזט חיידקי על בסיס מטען נטו

בסרטון זה, אנו מדגימים את הטיהור של חלבון קושר סידן מליזט תאי באמצעות כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית תלוית סידן. החלבונים קושרי הסידן חושפים אזור הידרופובי בעת קשירה לסידן, מה שמקל על אינטראקציה עם קבוצה הידרופובית על שרף. מאוחר יותר חלבונים אלה מדוללים באמצעות סידן chelator EDTA שהופך את האינטראקציה.

כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית תלוית סידן: טכניקה לטיהור חלבונים קושרי סידן המבוססים על אינטראקציות הידרופוביות

כאן, אנו מציגים שיטה להביע ולטהר S100A12 (calgranulin C). אנו מתארים פרוטוקול למדידת פעילות אנטי מיקרוביאלית שלו נגד הפתוגן האנושי H. pylori .

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

MALT1 מסדיר מולדת חסינות אך איך זה מתרחש נשאר מעורפל. השתמשנו החומר המדכא paracaspase סלקטיבית MALT1 הטכנולוגי-827 לפענח את התרומה של MALT1 איתות מולדת במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי כמו אגרה או C-type, הוכחת MALT1 מסדיר את הייצור של תאים מיאלואידים ציטוקינים, ויוצאת של קולטני לקטין דמוי C-type, באופן סלקטיבי.

תאים מיאלואידים מולדת איתות לשביל רגולציה על-ידי פעילות Paracaspase MALT1

במחקר זה, אנו מציגים הרומן ונוהל יעיל הבידוד של לימפוציטים מ טלאים של פייה (PPs), בו ניתן להשתמש לאחר מכן ב- vivo ו- in vitro לקשרי מבחני פונקציונלי, כמו גם מחקרים cytometric זרימה של הזקיקים T עוזר, מרכז נבטי B תאים.

שחקני המפתח unraveling Humoral חסינות: מתקדם וממוטב לימפוציט בידוד פרוטוקול טלאים מאתר של Peyer

אנו מתארים מודל הפטיטיס חיסון in vivo בעכברי BALB/c שניתן להשתמש בו כדי לחקור את הפתוגנזה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות, כולל הבדלי מין שנראו במחלה זו. נתאר כיצד מודל זה מדגים ניתוחים הניתנים לשחזור באמצעות טכניקות ניסיוניות in vivo ו- in vitro.

אינדוקציה של הפטיטיס אוטואימונית הנגרמת על ידי תרופות בעכברי BALB/c לחקר המנגנונים הפתוגניים שלה

שיטה מפורטת מסופקת כאן ומתארת את הטיהור, הקיפול והאפיון של חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית (סאפאנס) לשימוש בפיתוח החיסונים.

ייצור של E. coli-הביע עצמית הרכבה חלקיקי חלבון עבור חיסונים הדורשים Trimeric אפירופה מצגת

אנו מציגים פרוטוקול פשוט לבידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי מדם שלם המתקבל מחולים שאובחנו עם תסמונת סזארי, ולאחר מכן בחירה של תאי CD4+ T, הגירוי שלהם עם phorbol12-myristate13-acetate ו-A23187 ionophore, והכנת RNA ליצירת פרופיל שעתוק.

בידוד תאים חד-גרעיניים של דם היקפי אנושי ותאי T מסוג CD4+ מחולי תסמונת סזארי לצורך פרופיל תעתיק

הפרוטוקול מציג שיטות מפורטות להערכה אם ננו-אמולסיה אופיופוגונין D אדג'ובנט מקדם תגובות חיסוניות תאיות יעילות.

במבחנה הערכת פעילות תאית של חיסון ננו-אמולסיה אדג'ובנט אופיופוגונין D

מוצג פרוטוקול ייחודי ומקיף ליצירת תאים דנדריטיים אנושיים שמקורם במונוציטים אנושיים (mo-DCs) מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים (PBMCs) באמצעות טיפול בסיאלידאז. יתר על כן, מתוארות שיטות להערכת האפיון הפנוטיפי והפונקציונלי של mo-DCs ולהעריך כיצד טיפול בסיאלידאז משפר את רמת ההתבגרות של mo-DCs.

יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים עם פנוטיפים סיליליים שונים

למדו שיטת טיהור לחלבון S100A12 האנושי ואוליגומרים הנגרמים מיונים לשימוש בגירוי מונוציטים. הפרוטוקול מספק תוצאה גבוהה וחלבון נקי מאנדוטוקסין למחקרים ביוכימיים וחיסוניים.

טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון

גלה סרטונים נוספים