Name: הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למדו ליצור שינויים גנומיים מוגדרים באמצעות CRISPR-Cas9 בתאי גזע pluripotent אנושיים. שיטה זו מאפשרת יצירת קווים איזוגניים עם מוטציות ספציפיות לחקר פונקציית גנים ומחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מימון של הלב הלאומי, הריאות, ובדם המכון (NHLBI), המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענקים U01HL099656 (מ. פ. D.L.F.) ו U01HL134696 (למעלה ו D.L.F.).

1. עיצוב ובנייה של מדריך RNA (gRNA)
הערה: כל gRNA מורכב של 2 60 בסיס זוג (bp) oligונוגראודים, כי הם מוגלים כדי ליצור 100 bp כפול תקוע (ds) oligונואוטייד (איור 1א-ג). ציר הזמן עבור העיצוב gRNA, הדור, ויעילות חיתוך בדיקות הוא כ 2 שבועות (איור 2).
<ol><li>בחר את אזור ה-DNA של עניין להיות הגנום נערך ולזהות 3-4 23 הרצפים bp להתאים את הפורמט, 5 '-G (N19) ngg-3 '. רצפים אלה צריך להיות ממוקם בתוך 20 bp של אזור הריבית. הערה: ניתן לבצע את המיקוד במובן או בחוט האנטי-חוש.</li>
	<li>הערכת רצפי gRNA עבור יתירות גנומית והסתברות מחוץ ליעד באמצעות משאב כגון CRISPOR (http://crispor.tefor.net).</li>
	<li>שילוב רצף היעד של 20 bp (למעט מוטיב הסמוך פרוטומונט או פאם) לתוך 2 60-מאמר oligונומטר מוצג (רצפים הם 5 ' כדי 3 "ו אדום ירוק הם משלים הפוכה כפי שמוצג באיור 1ג).</li>
	<li>להזמין את ה2 60. לאחר החלת החמצן מתקבלים, להשעות כל אחד לריכוז הסופי של 100 μM ב ddH2O. לעשות מלאי עובד של 10 μm.</li>
	<li>מייצרים את שני החומרים המגנטיים ויוצרים מקטע 100 bp dsDNA באמצעות דנ א פולימראז (טבלת חומרים). לשלב 5 μL של 10 μM קדימה olig, הגאות ו-5 μL של 10 μM הפוכה הפוך בתגובת שרשרת פולימראז (PCR) שפופרת הרצועה והדגירה ב 95 ° c עבור 5 דקות. קריר התגובה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>הגדר את ה-PCR כפי שמתואר בטבלה 1. בצע הגברה של ה-PCR בציקלייר תרמי באמצעות הפרמטרים המתוארים בטבלה 2.</li>
	<li>המחש את מוצרי ה-PCR ב-1.5% (w/v) אתידיום ברומיד (EtBr) agarose ג'ל אלקטרופורםב 80-100 V עבור 40 דקות. בלו את הלהקה bp ה100 (איור 3a), דמיינו על תיבת אור LED, מן הג באמצעות להב תער ולטהר באמצעות ג'ל ערכת חילוץ (רשימת חומרים).</li>
</ol>2. עיצוב התחל של ה-PCR להקרנה
<ol><li>בצע הקרנה של ה-DNA שנערך באמצעות מקדימה והפוכה PCR התחל אשר נועדו במיוחד כדי להגביר את אזור bp 400-500 של הגן של עניין (שולחן 2). השתמש ב-DNA בודד מכל שליטה ipsc קו כדי לאשר אמפליקון נקי בעת ביצוע ההקרנה PCR.</li>
	<li>הדמיה PCR מוצרים על 1.5% (w/v) ג'ל לאחר האלקטרופורזה ב 80-100 V עבור 1 h. הערה: רצף של שיבוטים שנערכו מבוצע באמצעות פריימר מקונן המתוכנן לאחר אישור של מערכת ההקרנה להגדיר. . הדגימות נשלחות למקור מסחרי לרצף</li>
</ol>3. הכנת פלgRNA_cloning וקטורי
<ol><li>כדי לעבור שיבוט וקטור השיבוט, לקחת שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL ולהוסיף 1-5 μg של ה-DNA של וקטור gRNA_cloning יחד עם 4 μL של הגבלה Aflii מאגר אנזים ו 1.5 μl של האנזים aflii הגבלה. העלה את התגובה ל 24 μL של ddH2O. לערבב את התגובה על ידי ליטוף למעלה ולמטה. מודטה ב 37 ° c ללילה (O/N).</li>
	<li>אלקטרופורסה על 1% העלה ג'ל ב 80-100 V עבור 1 h ולהקות בלו (גודל הלהקה צפוי הוא ~ 3519 bp).</li>
	<li>לחלץ ולטהר כמו בשלב 1.6.</li>
</ol>4. הרכבת וקטור gRNA
<ol><li>להגדיר את התגובות ולהרכיב קטעי DNA באמצעות ערכת ההרכבה (טבלה של חומרים) ב 1:5 היחס של aflII מתעכל grna שיבוט וקטור 100 bp ג'ל מטוהרים להוסיף, כפי שמתואר בטבלה 3.</li>
	<li>דגירה את התגובה ב 50 ° c עבור 15 דקות. לדלל את התגובה 1:3 ddH2O ולהשתמש 3 μl לשינוי חיידקי, לפי הוראות היצרן (טבלת חומרים). תאי צלחת על קנאמיסינ ליברות/לוחות אגר.</li>
	<li>לבחור 3-5 מושבות לכל gRNA. האיחסן כל מושבה ב 4 מ ל של LB ולצמוח O/N ב 37 ° c בתוך החממה לרעוד מסלולית.</li>
	<li>לטהר את ה-DNA באמצעות ערכת הבידוד miniprep, והרצף כל gRNA באמצעות התחל הבאים כדי להבטיח שיבוט מוצלחת: קדימה: GTACAאאאכאגאג; הפוך: TGCCAACTT.</li>
</ol>5. הבדיקה gRNA חיתוך יעילות
<ol><li>צלחת hESCs על לקרינה עובריים מורנה מורטין (MEFs) בצלחת 6-באר, כפי שתוארה בעבר21. כאשר התאים מגיעים ל-70-80% שליטה, הכינו את המיקס הראשי של התרגום המתואר בטבלה 4.</li>
	<li>מערבבים על ידי ליטוף ו-דגירה ב-RT עבור 15 דקות. הוסף dropwise לתאים ו-דגירה ב 37 ° c עבור 48 h (עם שינוי מדיה לאחר 24 שעות).</li>
	<li>הקציר תאים למיון לאחר 48 h.<ol>
<li>הסר (טבלת חומרים) באמצעות דגירה של 3 דקות.</li>
		<li>לשטוף תאים 1x עם hESC בינונית (שולחן 5) ולגרד לתוך hesc בינונית + 10 Μm Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון (טבלת חומרים).</li>
		<li>כדוריות התאים ב 300 x g עבור 3 דקות ו-resuspend ב 0.5 ML של hesc בינונית + 10 Μm Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון.</li>
		<li>מסנן לתוך צינור 5 מ ל באמצעות כובע מסננת תאים 35 יקרומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>באמצעות מיון תא המופעל על ידי זריחה (FACS), שער על תאים חיים ולמיין חלבון פלורסנט ירוק (GFP) תאים חיוביים.</li>
	<li>העברת מקסימום של 1.5 x 104 תאים ממוינים ישירות לתוך 10 ס מ2 צלחת מצופה עם 1:3 מטריקס קרוםהמרתף (טבלה של חומרים) ו-Mefs הקרינה ב hesc בינונית (שולחן 5) המכיל Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון.</li>
	<li>שינוי בינוני מדי יום באמצעות hESC בינונית (שולחן 5) ללא Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון ולבחור שיבוטים באופן ידני לאחר 10-15 ימים, כאשר המושבות הם ~ 1 מ"מ קוטר.<ol>
<li>באמצעות פיפטה P200 ומיקרוסקופ, בזהירות לגרד שיבוט יחיד לצייר תאים לתוך הפיפטה.</li>
		<li>לפזר את התאים על ידי ליטוף בעדינות 3-4x ב 96 צלחת היטב בינונית שצוירה עם המושבה.</li>
		<li>מוותר לצינורות הסרט PCR להקרנה ולגלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות. לבחור 20 מושבות לכל grna.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. הקרנת שיבוט
<ol><li>בודד ה-DNA על ידי הדגירה כדורי תא ב 20 μL של מאגר פרוטטינואז K (שולחן 5) (1 h ב 55 ° צ' ו 10 דקות ב 95 ° c) ו מערבולת במרץ. צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 5 דקות ולאסוף את סופרנטאנט.</li>
	<li>לבצע הקרנה PCR (סעיף 2) בנפח הכולל של 20 μL באמצעות מיקס הורים כולל תחל שנועד להגביר את האזור של ריבית 5 μL של התקציר הפרוטאינאז K. השתמש ב-DNA גנומית מבודדים מקו התא שהיה גן שנערך כפקד.</li>
	<li>הערכת שינויי גודל של מוצרי PCR לאחר 1 h אלקטרופורזה ב 70-90 V על 2.5% (w/V) agarose ג'ל (איור 3ב, ג). כל הבדל גודל מעיד על המחשוף.</li>
</ol>7. הגנום המדויק עריכת בתאי גזע pluriפוטנטי באמצעות ה-DNA בודד סטרנד oligo (ssODNs)
<ol><li>עיצוב 100 bp ssODNs ממורכז סביב רצף gRNA היעיל ביותר נחוש לקבל את יעילות הגזירה הטובה ביותר.</li>
	<li>למנוע המחשוף מחדש של ODN משולב על ידי החדרת מוטציות שתיקה ברצף gRNA. מוטציה שתיקה אחת ברצף פאם הוא מספיק, אבל אם לא אפשרי, 3-4 מוטציות שתיקה יעבוד. הערה: כדי להקל על ההקרנה של שיבוטים ממוקד, המבוא של אתר הגבלה בתוך ~ 20 bp של רצף gRNA הוא אידיאלי.</li>
	<li>עיצוב ODN אחד עם שינוי הבסיס הרצוי כדי ליצור את מוטציה של ריבית ו-ODN אחד ללא שינוי בסיס (ים). הערה: שינויים אלה צריכים להיות לא יותר מ-~ 20 bp מהאתר החזוי CRISPR/CAS9, כמו שילוב מחדש יורד באופן משמעותי במרחקים גדולים.</li>
	<li>להזמין את שני ssODNs מן הספק של בחירה להשעות מחדש במים לעשות 1 μg/μL מניות. חנות מניות ב-20 ° c.</li>
</ol>8. התקנת מעבר החצייה
<ol><li>כדי לעבור החוצה את ssODN ו-CRISPR-CAS9 ds, הצלחת קו התא היעד בצלחת 6-טוב על הקרינה הוקרן כדי להגיע 70-80% שליטה לאחר הדגירה O/N.</li>
	<li>הגדר את תגובת המשגר כמתואר בטבלה 6. מערבבים את התגובה על ידי ליטוף ו-דגירה עבור 15 דקות ב-RT. הוסף את התערובת תגובת העברה התגובה לתאים.</li>
	<li>לאחר 48 h, הכן את התאים למיון התא כמתואר בסעיף 5.3.</li>
	<li>לבחור מושבות ~ 10 ימים לאחר ציפוי תאים בודדים באמצעות הפיפטה 200 μL. העברת 100 μL של תאים אחד טוב של 24 או 48 צלחת הבאר בעבר מצופה בג ו MEFs לקרינה בינונית hESC עם Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון. השתמש בשאר 100 μL עבור בידוד DNA כמתואר בסעיף 6.</li>
</ol>9. בדיקת מוטציות במושבות יחיד
<ol><li>כדי לבדוק שילוב מוצלח של ssODN, לקחת 5 μL של דנ א מבודדים מכל מושבה כדי לבצע PCR באמצעות ההקרנה התחל המתוכנן בסעיף 2. לטהר את מוצרי ה-PCR (טבלת חומרים) ולהכין את מגבלת העיכול באמצעות אתר האנזים הייחודי שנוצר ב-ssODN. הערה: עיכול זה כולל גם את מאגר האנזים ההגבלה ואת הריכוז המומלץ של היצרן של אנזים ההגבלה בנפח של 40 μL.</li>
	<li>מערבבים את התגובה על ידי ליטוף ו-דגירה בטמפרטורה המומלצת של היצרן עבור 1-3 h.</li>
	<li>המחש את מוצרי ה-PCR המתעכל ב-1.5% (w/v) EtBr agarose ג'ל אלקטרופורםב 80-100 V עבור 40 דקות. אם שילוב מוצלח של ה-ssODN התרחש, רצף מוטציות ספציפיות באמצעות תחל מקונן.</li>
</ol>

<ol><li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations%3A+Lessons+from+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li>
<li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm%2C+Development+of+the+Pancreas%2C+and+Functionality+of+Pancreatic+%CE%B2+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li>
<li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR%2FCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

בפרוטוקול זה, את השימוש CRISPR-CAS9 יחד עם שני ssODN לתקן תבניות כדי לייצר heterozygous מסוימים או שינויים הגנום homozygous מוצג בתאי גזע האדם pluriפוטנטי. שיטה זו הביאה את הדור המצליח של קווי התא isogenic המבטא heterozygous גנומית שינויים עם יעילות קרוב ל 10%. פרוטוקול זה כבר אופטימיזציה עבור ESCs האנושית ו iPSCs גדל על MEFs הקרינה התומכת הצמיחה והישרדות התא לאחר תאים culturing בצפיפות נמוכה לאחר מיון התא. מוות תאים ניתן למזער על ידי שמירה על תאים עם 10 ng/mL bFGF ו-Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון. ייתכן שפרוטוקול זה מותאם למז...

האדם תאים גזע עובריים (hESCs) והמושרה תאים גזע pluriפוטנטי (iPSCs) הם כלים יקרי ערך למידול מחלות האדם בשל יכולתם להתחדשות, תוך שמירה על היכולת ליצור סוגי תאים של שונות לושלות1,2 ,3,4. מודלים אלה לפתוח את האפשרות לחקור פונקציה גנטית, ולהבין כיצד מוטציות ספציפיות פנוטיפים קשורים מחלות שונות5,6. עם זאת, כדי להבין כיצד שינוי מסוים מקושר לפנוטיפ מסוים, שימוש בפקד איזוגניים משויך ובקווי תא של מוטציה חשוב לשלוט בשורה לשונות שורה7,8. תמלול activator כמו נוקלאוסיס (TALENs) והנוקלאוסים אצבע אבץ שימשו כדי ליצור הוספה או מחיקה (indels) מוטציות במודלים גנטיים מגוונים, כולל תאים ראשוניים; אבל הנוקלאוסים האלה יכולים להיות מסורבל לשימוש ויקר9,10,11,12,13,14. הגילוי של באשכולות באופן קבוע הכולל מרווחים לחזור קצר palindromic (crispr)-CAS9 נוקלאז יש מהפכה בשדה בשל יעילות היווצרות indel כמעט בכל אזור של הגנום, פשטות השימוש, וצמצום עלות15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , . בן 19
אתגר בשימוש crispr-CAS9 מבוסס הגנום לעריכת הטכנולוגיה כבר הדור או תיקון של מוטציות ספציפיות אלל אחד בלי ליצור מוטציה indel ב אלל השני20. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להתגבר על האתגר הזה על ידי שימוש בשני משתמשים בעלי התקן בודד ומבודד (ssODN) תיקון תבניות כדי להפחית את היווצרות indel ב allele השני. שני ssODNs נועדו להכיל מוטציות שתיקה כדי למנוע חיתוך מחדש על ידי CAS9 nuclease, אבל רק אחד מכיל שינוי של עניין. שיטה זו מגבירה את היעילות של יצירת שינוי גנטי מסוים heterozygous מבלי לגרימת היווצרות indel ב allele השני. באמצעות פרוטוקול זה, הניסויים בעריכת גנים בשישה מיקומים גנומית עצמאית להפגין את המבוא המדויק של שינוי גנומית הרצוי באחד אלל ללא היווצרות indel ב אלל השני ומתרחשת עם יעילות כוללת של ~ 10%. הפרוטוקול המתואר הותאם מ מגווייר ואח '21.

<table><tbody><tr><td>צינור פוליסטירן תחתון עגול 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים</td><td>קורנינג</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות פוליסטירן 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>אנדונוקלאז הגבלת AflII</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 בינוני</td><td>ThermoFisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr>מכשיר <td></td><td></td><td></td><td>סדרן תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS)</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Gibson ערכת הרכבה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>LB לוחות אגר המכילים 50 &mu; גרם/מ"ל מגיב גזע ליפופקטמין קנמיצין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>תרמופישר</td><td>(STEM00001)</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה מטריג'ל מופחת (GFR)</td><td>קורנינג</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיצוי ג'ל נוקלאוספין וערכת ניקוי PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור טלטול אורביטלי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>וקטור pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>צינורות רצועת PCR</td><td>ארה"ב Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase ו-5 פעמים; מאגר Phusion</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM ערכת מיני-הכנה מהירה פלסמיד</td><td>Invitrogen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen 19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM תאי Escherichia coli מוכשרים חשמלית</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>SOC בינוני</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE אקספרס אנזים</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 מעכב דיהידרוכלוריד/ROCK (ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות crispr-cas9 בתאי גזע האדם pluripotent

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

תאי גזע האדם בעלי עוצמה מציעים מערכת חזקה כדי לחקור את תפקוד הגנים ואת המודל מוטציות ספציפיות הרלוונטיות למחלה. הדור של שינויים גנטיים heterozygous מדויק מאתגר בשל CRISPR-CAS9 מתווך indel היווצרות ב allele השני. כאן, אנו להדגים פרוטוקול כדי לסייע להתגבר על הקושי הזה באמצעות שתי תבניות תיקון שבו רק אחד מבטא את שינוי הרצף הרצוי, בעוד שתי התבניות מכילות מוטציות שקטות כדי למנוע גזירה מחדש ומבנה indel. מתודולוגיה זו היא היתרון היעיל ביותר עבור הקוד לעריכת גנים באזורים של DNA כדי ליצור שליטה איזוגניים וקווי גזע האדם האנושי ללמוד מחלות אנושיות וביולוגיה. בנוסף, אופטימיזציה של העברת החצייה ומתודולוגיות ההקרנה בוצעו כדי להפחית את העבודה והעלות של ניסוי בעריכת גנים. בסך הכל, הפרוטוקול הזה הוא ישים נרחב לעריכת הגנום רבים באמצעות המודל האנושי pluriפוטנטי.

דור של gRNAs והקרנה עבור אינדלים
כל gRNA ישוכפל לתוך וקטור פלמיד וביטא באמצעות מקדם U6. האנזים AflII הגבלה משמש כדי לאתר את הפלסמיד (addgene #41824) והוא ממוקם לאחר מקדם U6. הלהקה 100 bp שנוצר לאחר הריפוי של 2 60 bp oligos משוכפל לתוך הביטוי gRNA ביטוי באמצעות הרכבה DNA. לאחר הפקת פלמידים של gRNA, הם מhESCs לתוך הiPSCs ולאחר מכן עם CRISPS-CAS9 GFP בינוני (addgene #44719). התאים GFP + ממוינים לאחר 2 ימים כדי להעשיר עבור תאים מזוהמים מצופה (ראה סעיף 5). לאחר 10-14 ימים,...

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

המחקר של תפקוד גנים ומחלות מעוכבים על ידי הטבע החיצוני של האוכלוסייה האנושית. הרקעים הגנטיים השונים של קווי תאי iPS ספציפיים למטופל ושליטה יכולים להשפיע על יעילות ההידול ועל פנוטיפים שנמצאו בהקשה תפקודית נתונה. השימוש בקווים זהים גנטית או isogenic שבו ההבדל היחיד הוא מוטציה מסוימת של עניין הוא קריטי כדי להתגבר על נושאים אלה.מחלות אנושיות רבות נגרמות על ידי מוטציות הטרוזיגיות, אשר יכול להיות קשה ליצור עם מערכת CRISPR-Cas9. זאת בשל הדור של מוטציות indel ב allele לא ממוקד שיכול להתרחש בתדירות גבוהה מאוד. הטכניקה שלנו מתגברת על בעיה זו באמצעות שתי תבניות תיקון שרק אחת מהן מטפחת את המוטציה של עניין.כל חוקר שמנסה טכניקה זו צריך להיות מיומן בתרבות תאי גזע פלוריפוטנטית אנושית. הדגמת וידאו של קטיף המושבה יהיה מועיל להראות גודל נכון מורפולוגיה, כמו גם טכניקה המשמשת לקטוף הקרנה. הוכחת הליך זה יהיה ליאו קרדנס.כדי להתחיל, צלחת ESCs אנושי על MEFs מוקרן בצלחת 6-well. הכינו את תערובת המאסטר של ההטרמפים. מערבבים על ידי צינורות ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.כאשר התאים מגיעים 70 עד 80%confluency, ולאחר מכן, מוסיפים את תערובת מאסטר transfection טיפה חכם לכל באר עם תאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לשנות את המדיה כל 24 שעות. כדי לקצור את התאים, הראשון, דגירה התאים עם טריפל E במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר MEFs אנזימטית.הוסף 0.5 מיליליטר של מדיום HESC עם 10 מעכבי רוק מיקרומולר. תאי גלולה ב 300 פעמים g במשך שלוש דקות ולהשעות מחדש 0.5 מיליליטר של מדיום ESC אנושי עם 10 מעכבי רוק micromolar. לסנן את ההשעיה התא לתוך צינור חמישה מיליליטר דרך כובע מסננת תא 35 מיקרון.באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, שער על תאים חיים ומיין את התאים הירוקים פלורסנט חלבון חיובי. לאחר מכן, להעביר מקסימום של 1.5 פעמים 10 לארבעת התאים ממוינים ישירות לתוך צלחת 10 ס"מ מצופה מטריצת קרום מרתף אחד עד שלושה MEFs מוקרן ומדיום ESC אנושי המכיל מעכבי רוק. שינוי בינוני מדי יום באמצעות מדיום ESC האנושי ללא מעכבי ROCK.לאחר 10 עד 15 ימים, המושבות הן בקוטר של מילימטר עד שני מילימטרים בקירוב. תחת מיקרוסקופ, השתמש פיפטה P200 כדי לגרד בזהירות שיבוט יחיד ולמשוך תאים לתוך פיפטה. מפזרים את התאים באר של צלחת 96 באר על ידי צינור בעדינות שלוש עד ארבע פעמים במדיום נערך עם המושבה.לאחר מכן, לבחור 20 מושבות עבור כל מדריך RNA ולחלק לתוך צינורות פס PCR להקרנה. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות. עכשיו, כדורי תא דגירה ב20 microliters של חיץ Proteinase K לבודד DNA ומערבולת במרץ.צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר מכן, בצע הקרנת PCR של ה-DNA הערוך. הוסיפו לצינורות 20 מיקרוליטרים של תערובת אב, כולל פריימרים קדמיים והפוךים, שנועדו להגביר את אזור העניין, כמו גם חמישה מיקרוליטרים של תקציר Proteinase K.השתמש ב- DNA גנומי מבודד מהקו iPSC הבקרה כדי לאשר אמפייקון נקי בעת ביצוע PCR ההקרנה. להעריך את שינויי הגודל של מוצרי PCR לאחר שעה אחת של אלקטרופורזה ב 70 עד 90 וולט על 2.5% משקל לפי נפח אגרוז ג'ל. כל הבדל גודל מעיד על מחשוף.כדי לשנות את הדנ"א של אוליגו הגדיל הבודד ואת פלסמיד CRISPR-Cas9, צלחת קו תא היעד בצלחת 6 באר על MEFs מוקרן להגיע 70 עד 80% confluency לאחר יותר מדי דגירה לילה. הגדר את תגובת ההמרה כמתואר. מערבבים את התגובה על ידי צינורות ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, מוסיפים את תערובת התגובה transfection טיפה חכם לתאים. לאחר 48 שעות, הכן את התאים למיון תאים כבעבר. כ-10 ימים לאחר ציפוי תאים בודדים, השתמשו בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לקטוף מושבות בצינורות פס PCR ולתוך באר של צלחת של 12 בארות מצופה מראש בג'לטין ו- MEFs.להעביר 100 microliters של התאים לכל באר של צלחת 24 או 48 באר, מצופה בעבר עם ג'לטין ו MEFs מוקרן במדיום ESC אנושי עם מעכבי רוק. השתמש ב-100 המיקרוליטרים הנותרים לבידוד דנ"א. כדי לבדוק אינטגרציה מוצלחת של ה-DNA אוליגו גדיל יחיד, לקחת חמישה microliters של DNA מבודד מכל מושבה לבצע PCR באמצעות פריימרים ההקרנה תוכנן בעבר.לטהר את מוצרי PCR ולהכין את 40 microliters של עיכול אנזים הגבלה באמצעות אתר האנזים הייחודי שנוצר ב- DNA אוליגו גדיל יחיד. מערבבים את התגובה על ידי צינורות ודגירה בטמפרטורה המומלצת של היצרן במשך שעה עד שלוש שעות. לאחר מכן, לדמיין את מוצרי PCR מתעכל הוסיף עם צבע טעינה על 1.5% משקל לפי נפח אתידיום ברומיד אגרוז ג'ל, אלקטרופורזה ב 80 כדי 100 וולט במשך 40 דקות.אם אינטגרציה מוצלחת של הדנ"א אוליגו גדיל יחיד התרחשה, רצף מוטציות ספציפיות באמצעות פריימר מקונן. במחקר זה, לבניית RNA מדריך, רצועת זוג בסיס 100 הוצאה מג'ל אגרוז 1.5%. לאחר החיתוך התאי, אימות של חיתוך RNA מדריך היה חזותי באמצעות ג'ל 2.5%agarose.מוצר PCR של זוג בסיס 180 הראה בקרה לא חתוכות ושכפולים שונים עם משמרות פס המציינות היווצרות indel. למדריך שונה RNAs היו יעילות חיתוך שונה. כדי למנוע חיתוך מחדש של CRISPR-Cas9 של אללים ערוכים, רצף PAM שונה באמצעות מוטציה G ל- A שקטה.מוטציה שקטה ברצף PAM יצרה אתר הגבלה ייחודי, המסייע לסנן שילוב מוצלח לאלל אחד או שניים. ניתן להשתמש בקווי תאי גזע ערוכים בגנום בהבינות במורד הזרם ובמסיונות תפקודיים כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה נתונה על ההתפתחות האנושית והמחלות. מתודולוגיה זו מאפשרת לדור של קווי תאים איזוגניים עם מוטציות הטרוזיגיות או הומוזיגיות ספציפיות, המעורבות במגוון רחב של מחלות אנושיות.מודלים אלה של מחלות סוללים את הדרך לפיתוח טיפולים תאיים חדשים, כמו גם מציעים פלטפורמות לגילוי תרופות.

generation-defined-genomic-modifications-using-crispr-cas9-human

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

סרטון זה מדגים טכניקה של עריכת גנום מבוסס נוקלאז באצבעות אבץ בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). מכיוון שניתן להתמיין לתאי גזעי עוברי אורח לסוגי תאים שונים, טכנולוגיה זו מועילה למחקרים פתולוגיים ופרמקולוגיים במבחנה באופן ספציפי למטופל.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: טכניקה לשינוי גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי מנגנון תיקון תלוי הומולוגיה דו-גדילי

כלי עריכת גנום כגון מערכת CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) שיפרו מאוד את יעילות מיקוד הגנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs). כתב יד זה מתאר פרוטוקול ליצירת מדווח hiPSC ספציפי לשושלת באמצעות רקומבינציה הומולוגית בסיוע מערכת CRISPR/Cas.

דור יעיל של כתבים במכות ספציפיים Lineage hiPSC עצבי באמצעות CRISPR / Cas9 ומערכת Nickase זוגי Cas9

עריכת גנום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולה להיעשות במהירות וביעילות. מוצג כאן הליך ניסיוני חזק להנדסה גנטית של hPSCs כפי שמודגם על ידי עריכת מיקום נמל המבטחים AAVS1 כדי לבטא EGFP ולהציג עמידות לאנטיביוטיקה.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

זה הפרוטוקול מתאר בפירוט הדור של תאי גזע pluripotent המושרה ללא טביעת רגל (iPSCs) מתאי הלבלב האנושי בתנאים ללא מזין, ואחריו עריכה באמצעות ribonucleoproteins CRISPR/Cas9 ואפיון שונה תא בודד שיבוטים.

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

המתוארים כאן הוא פרוטוקול עבור תיוג endogenously לידי ביטוי חלבונים עם תגי פלורסנט בתאי גזע pluripotent המושרה האנושי באמצעות CRISPR/Cas9. תאים putatively הערוך מועשרים ידי קרינה פלואורסצנטית מופעל מיון תא, שורות תאים המשובטים נוצרים.

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas היא טכנולוגיה רבת עוצמה להנדס הגנום מורכבים של צמחים ובעלי חיים. כאן, אנחנו פירוט נוהל לעריכת ביעילות הגנום האנושי באמצעות endonucleases רשויות אישורים שונים. אנחנו מדגישים שיקולים חשובים ופרמטרים עיצוב כדי למטב את יעילות העריכה.

הגנום עריכה בשורות תאים בתרבית של שימוש CRISPR-Cas

כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לעריכת גנים חלקה בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות פלסמיד תורם מבוסס piggyBac ומוטנט ניקאז Cas9. שתי מוטציות נקודתיות הוכנסו לאקסון 8 של לוקוס הגורם הגרעיני הפטוציטים 4 אלפא (HNF4α) בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs).

החדרת מוטציות נקודתיות לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות עריכת גנום חלקה

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

הפרוטוקול מתאר שיטות לעריכת אפיגנום מבוססת Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) בקווי תאים אנושיים באמצעות טרנספקציה של DNA פלסמיד ונוקלאופקציה של mRNA.

עריכת אפיגנום CRISPR בתאים אנושיים באמצעות טרנספקציה של DNA פלסמיד והעברת נוקלאופקציה של mRNA

למדו ליצור שינויים גנומיים מוגדרים באמצעות CRISPR-Cas9 בתאי גזע pluripotent אנושיים. שיטה זו מאפשרת יצירת קווים איזוגניים עם מוטציות ספציפיות לחקר פונקציית גנים ומחלות.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

גלה סרטונים נוספים