Name: בידוד של גלגל שלם כדי להשיג רקמת פני השטח העינית אינטגרלי לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: למדו שיטת בידוד גלגל עין עכברים עם מבנים מצורפים לשימור רקמת פני השטח העינית לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימית. הפרוטוקול מועיל לחוקרים בתחום האופתלמולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לפרופסור רונג ג'ו על קריאה קריטית של כתב היד, וכל חברי המעבדה לסיוע טכני. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מן הארגון הלאומי למדעי הטבע של סין (NSFC: 31571077; בייג, סין), פרויקט החדשנות של מדעי העיר גואנגזו וטכנולוגיות (201707020009; גואנגג'ואו, מחוז גואנגדונג, סין), "100 אנשים תוכנית" מאוניברסיטת סון יאט-סן (8300-18821104; גואנגג'ואו, מחוז גואנגדונג, סין), ומימון מחקר מתוך המעבדה מפתח המדינה של רפואת עיניים במרכז דז'ונגשאן אופטלמולוגי (303060202400339; גואנגג'ואו, פרובינציית גואנג-דונג, סין).

כל ההליכים הכרוכים בשימוש בעכברים אושרו על-ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשימוש במרכז הבריאות של דז'ונגשאן, ודבקה בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים בחקר אופטלמולוגי וחזון.
1. חיתוך עין עם משטח עינית ועפעפיים שלמים
<ol><li>. לנתח את הראש<ol>
<li>המתת חסד יום לידה 10 (P10) ו P28 עכברים (לראות את הטבלה של חומרים עבור זנים העכבר) על ידי פריקה צוואר הרחם, לחתוך את הראש מהצוואר על ידי זוג של מספריים חדים.</li>
		<li>ראש bisect עם זוג מספריים ישרים לאורך קו האמצע משונן להתחיל את העצם הפנימי rostrally אל האף (איור 1a, B). הערה: עצם הגולגולת מתקשה עם הזדקנות העכבר, להיזהר לשמור את המספריים חיתוך לאורך קו האמצע ככל האפשר.</li>
		<li>מניחים כל חצי של הראש בצלחת פטרי נקייה, לחתוך את הלסת ואת הלשון תחילה באמצעות מספריים חדים. לשחרר את העצב האופטי על ידי חיתוך אותו מהמוח לפני מיקום הראייה האופטית, ולהסיר את כל רקמות המוח כולל הנורה הריח מוצמד לקיר הגולגולת.</li>
		<li>עכשיו את הרקמות הנותרות יהיו כל עצמות הגולגולת/מסלולית הקשורים העין (איור 1ג, ד). שטוף את החלק הנותר עם ה-PBS כדי לנקות את הדם ופסולת השיער.</li>
		<li>הקידומת של רקמות עם 4% פאראפורמלדהיד (התחתית, בתוך מלוחים פוספט באגירה [PBS], pH 7.4) בצינורית בטמפרטורה 50 mL בטמפרטורת החדר (RT) עם סיבוב. זמן הקיבעון המשוער הוא כדלקמן: ~ 10 דקות עבור P0 כדי P7; ~ 20 דקות עבור P8 כדי P28; ו ~ 30 דקות עבור P29 ומעלה. הערה: הקיבעון מציע קשיחות רקמות הפיכת הקרע שלאחר מכן קל יותר. בנוסף, קיבעון מראש נמנעת מהשארת רקמה טרייה שאינה קבועה זמן רב מדי לפני שהקרע יושלם. התראה: המטה מסוכן ויש לטפל בו בזהירות.</li>
	</ol></li>
	<li>להסיר עצמות הגולגולת/מסלולית.<ol>
<li>לאחר הקיבעון, לשטוף במהירות את הראש גזור ב PBS שלוש פעמים כדי לחסל את שערות שבורות ותיקונים כדי להמשיך בניתוח נוסף. התראה: חשיפה לתיקונים במהלך הניתוח עלולה להיות מזיק לבריאות.</li>
		<li>מניחים את הרקמה בצלחת פטרי בגודל 10 ס מ, חותכים את הגולגולת לשלושה חלקים לאורך המטוסים המצוינים באיור 1D, E. גלגל העין בשקע חבוי בחלק האמצעי של הגולגולת תחת העצמות הקדמית, חזיתית והלסת התיכונה (איור 1D, E).</li>
		<li>השתמש שני זוגות של מס ' 4 מלקחיים ישר כדי לקלף את העצם האטימוד כדי לחשוף במלואו את העצמות הקדמית והלסתהראשונה (איור 1F).</li>
		<li>לחלק את משטח הגולגולת (כולל הלסת הקדמית ועצמות המצח) לתוך 4 אזורים (איור 1F). הכנס את הקצה של מלקחיים מעוקלים אופקית לתוך כל אזור כדי להסיר עצמות הלסת הקדמית והחזיתית ברצף (איור 1F). הערה: עצמות הלסת השניה לא יכולות להיות מוסרות בו. בסבלנות לנתח אותם חלק אחרי חלק. העצם הקדמית מחוברת ישירות לעין דרך רקמות חיבור רכות. יש להיזהר כאשר מסירים אותו מן העין כדי למנוע מתיחה העין ולהזיק לחמית.</li>
		<li>לאחר ההסרה של עצם הלסת החלקית מקסימום ואת כל העצם הקדמית, העצמות המשמשות כבסיס ו jugal יהיה חשוף (איור 1G). הסר את שתי העצמות הקשורות השרירים התת עורית ושומנים סביב העין, לקצץ את גלגל העין עם העפעפיים והעור המצורפת לבלוק ריבוע קטן צורה להפחית את נפח הרקמה ולהקל על הרקמה בעת הטבעה (איור 1 H).</li>
		<li>הניחו את גלגל העין והרקמות המשויכות בחזרה ל -4% בכיוון ההפוך והמשיכו לתקן את הלילה ב -4 ° c. הרקמה הקבועה יכולה להישמר למשך חודש אחד לפחות ב-4 ° c ב-PBS עם תוספת של 0.02% נאן3. לחלופין, המשך לניתוח היסטולוגית באופן מיידי. הערה: אם הרקמה צריכה להיות מאוחסנת לתקופות ארוכות יותר, היא יכולה להיות מאוחסנת בקלות ב-70% אתנול.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ניתוח היסטולוגית
<ol><li>בחלק פרפין והמטאוקסילין ואאוזין (H & E) מכתים<ol>
<li>בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי המתואר במקומות אחרים9 לבצע הטבעה פרפין והסרת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אימונוהיסטוכימיה (IHC)<ol>
<li>Dewax את הפרפין סעיפים עם קסילן ו מחדש את הסעיפים באמצעות סדרת אלכוהול (100%, 95%, 80%) למים מזוקקים (dH2O).</li>
		<li>לבצע אחזור אנטיגן על ידי טיפול במיקרוגל של שקופיות רקמה ב 0.01 M חומצת לימון מאגר (3 גרם של trisodium ציטראט, 0.4 g לימון חומצה ל 1 L מזוקקים כפול H2O) בצנצנת שקופית זכוכית עם כוח נמוך (120 W). אנרגיה צריכה להיות מועברת לסירוגין עבור סך 5-10 דקות עם כל מרווח שנמשך כ 2 דקות. הערה: מיקרוגל בעל כוח גבוה או חימום עקבי יוביל לניתוק מקטעי רקמות מהשקופית.</li>
		<li>בחרו את השקופיות מצנצנת הזכוכית, נגבו בזהירות את הנוזל שיורית סביב כל מקטע באמצעות רקמות הפנים ומניחים אותם על מדף השקופיות בתיבה היסטולוגיה. צייר ריבוע סביב כל מקטע עם עט היסטולוגית עמיד למים. מקום 100 μL של חסימת מאגר (0.1% טריטון X-100 ו-10% בסרום חמור ב-1x PBS) על כל ריבוע, ו מודדת עבור 30 דקות ב RT.</li>
		<li>הסר בזהירות את הפתרון חסימה עם ואקום, להוסיף את הנוגדן העיקרי (לראות את הטבלה של חומרים) עם דילול הרצוי במאגר חסימת, ולהמשיך להסיר את השקופיות ב 4 ° c עבור 24 שעות או יותר. הערה: הריכוז של כל נוגדן ראשוני המשמש ל-IHC משתנה, וצריך להיבדק בניסויים בפיילוט.</li>
		<li>רוחצים שקופיות רקמה עם PBST (0.1% טריטון ב PBS) שלוש פעמים, עבור 10 דקות כל אחד. חזור על שלב 2.2.4 באמצעות הנוגדן המשני (ראה טבלת חומרים) יחד עם 4 ', 6-diamidino-2-פניינילינידול (dapi) החלפת מאגר חסימת. המשך לעבור לפחות 4 שעות או יותר בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>להסיר את הנוגדן המשני, לשטוף את מקטעי הרקמה עם הפתרון PBST שלוש פעמים, עבור 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן לשטוף עם PBS נקי עבור עוד 5 דקות.</li>
		<li>נגב את השאריות של PBS הסביבה מקטעים רקמות, הר שמיכות על סעיפים עם הרכבה בינונית. בצעו מיקרוסקופ פלורסנט לקבלת תמונות (ראו טבלת חומרים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).</li>
<li>Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Morphology+of+the+Lipid+Layer+of+the+Tear+Film%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film.</a> Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).</li>
<li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+immunology+of+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Immunology+and+Allergy%22%5BJournal%5D)">Anatomy and immunology of the ocular surface.</a> Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).</li>
<li>Mizoguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+alkali+injury+damages+meibomian+glands+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice.</a> The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).</li>
<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+of+the+conjunctiva%3A+A+review+of+recent+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).</li>
<li>Nowell, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+imposes+aberrant+cell+fate+in+regenerating+epithelia+through+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).</li>
<li>Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histochemical+study+of+the+development+of+premaxilla+and+maxilla+during+secondary+palate+formation+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Histology+and+Cytology%22%5BJournal%5D)">A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo.</a> Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+MEK+kinase+1+in+TGF-beta%2Factivin-induced+epithelium+movement+and+embryonic+eyelid+closure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure.</a> The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).</li>
<li>Sharov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+overexpression+inhibits+eyelid+opening+by+altering+epidermal+apoptosis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation.</a> The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).</li>
<li>Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+symptoms+are+increased+in+mice+deficient+in+phospholipid+transfer+protein+%28PLTP%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP).</a> The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mastermind-like+transcriptional+co-activator-mediated+Notch+signaling+is+indispensable+for+maintaining+conjunctival+epithelial+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity.</a> Development. 140 (3), 594-605 (2013).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signaling+inhibits+goblet+cell+differentiation+via+SPDEF+in+conjunctival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium.</a> Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

תזכורת קריטית אחת להכנת העין שלמה היא כי כל עצמות מסלולית יש להסיר לחלוטין, במיוחד juga ועצמות lacrimal, אשר קטנים ממוקם ליד החלק התחתון של שקע העין. כל עצמות שמאל-מעל עלול לסבך את היסטולוגיה שלאחר מכן. במקרה פיסת עצם זעיר לא הוסר לחלוטין מניתוח בטעות, ניתן לבחור מתוך לחסום פרפין הטבעה באמצעות זוג מלקחיים. החור שנותר מאחור צריך להתמלא. בפרפין לאחר ניתוח זה
יש לתרגל זהירות נוספת בעת טיפול בעדשה. פיסות העדשה השבורה מפוזרות בדרך כלל דרך החלק השלם. הדבר ישפיע במידה ניכרת על בחינת המיקרוסקופיה ועל ...

המשטח העינית מורכב גיליון רציף של האפיתל הקרקע כולל palpebral לחמית, בולבר לחמית ו קרנית1. מבנים רבים הבלוטות משויכים האפיתל המשטח העינית ויחד לייצר שכבה של הסרט דמעה הגנה על משטח קרנית מפני ייבוש והסביבה פלישות2. הפרעה של מערכת ההפעלה תוביל לדלקת, דלקת הלחמית או שניהם (keratoconjunctivitis הלחמית). שני הגורמים הגנטיים והגירויים הסביבתיים או האינטראקציות שלהם תורמים לשינויים פתולוגיים של מערכת ההפעלה3,4. בהתאם, מגוון של מודלים מהונדסים גנטית, פיזית או כימית המושרה שימשו לחקר תהליכי מחלות של מערכת ההפעלה האנושית.
המבנה והתפקוד של מערכת ההפעלה של העכבר דומה לזה של בני אדם במובנים רבים. מרכיבי הסרט הקרוע שמופרשים על ידי בלוטות העינית דומים גם לעכברים ולבני האדם. הרבה מחקרים נערכו באמצעות מודלים העכבר להסבר מנגנוני היכרויות של מחלות האדם מערכת ההפעלה5,6,7. בהזדמנויות רבות, חשוב לנתח את הגלובלי במקום שינויים מולקולאריים מקומיים של מערכת ההפעלה כדי להשיג מידע מקיף תחת אותו טיפול ניסיוני. לכן, הכנה לדוגמה עם יושר טוב נדרשת כדי להבטיח כל חלק של מערכת ההפעלה להיות מנותח בו.
העכבר מערכת ההפעלה מקורביו בחוזקה עם גלגל העין כי היה מוטבע שקע העין/מסלול (ספל גרמי עשוי מספר עצמות הגולגולת שונים) ומתחבר אליו דרך רקמות חיבור דק. קיימים אתגרים עצומים לניתוח משטח העינית כולו מבלי לפגוע בpalpebral או בולבר לחמית. אתגרים אלה יורדים מ: (אני) מערכת ההפעלה היא רכה ורזה ומודבקת לתוך פיזית להפריד העפעפיים עדיין מטלטלין ועין, ולכן פגיע עיוות ונזק; ו-(ii) המרחב המוגבל בין עצמות המסלול לבין העין מגבילים את פעולות החיתוך. האתגרים הם הרבה יותר גדול עבור העכבר המבוגר. בתוך העכבר העובריים, ההתקשות עצם מסלולית אינו שלם והרקמות המקיפות הם יחסית רופף8. הראש ניתן להסיר ומנוכר, ולאחר מכן באופן ישיר בקיבוע של פאראפורמלדהיד (בשיא) קיבעון והטבעה9. לעומת זאת, העצמות לפני הלידה והעכבר למבוגרים הופכים להתקשות באופן מלא עם רקמות מסביב עבה, מה שהופך את החדירה של fixatives פחות יעיל. יתר על כן, עצמות מסלולית/הגולגולת הם קשים ושבירים, שבור בקלות כאשר מנציב אותם תרכובות הטבעה רכה כגון פרפין. פיסות עצמות שבורות יהיה פה אחד לקרוע את הרקמות הסמוכות וכתוצאה מכך מורפולוגיה רקמות נחות.
מחקרים רבים שפורסמו לעתים קרובות הראו משטח עינית חלקי, אשר עשוי להספיק למטרות מחקר מסוימות שלהם10,11. בדיקה ברוטו של הספרות מצאו רק מחקרים מראים את כל פני השטח העינית שלם הפגינו ללא תיאור מפורט של פרוטוקולי הניתוח12,13. בפרוטוקול זה, אנו מפורטים שיטת הניתוח להשגת משטח בלתי נפרד לאחר לידה העין, שבו מסלולית עצמות הגולגולת היו מסודרת הוסר, השארת משטח העינית ללא שינוי יחד עם העין והעפעפיים, למזער את הנזקים הפיזיים. בדקנו בהמשך את מערכת ההפעלה היסטולוגיה וביצעו אימונוהיסטוכימיה באמצעות מקטעי הרקמה שהוכנו על-ידי פרוטוקול זה.

<table><tbody><tr><td>1 ופעמים; תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>FG701-01</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td></td><td></td> שקופיות מיקרוסקופ דבק קורנינג 430829 <td></td></tr><tr><td>שונות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td>ריכוז מומלץ 1:500 - 1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12380</td><td>ריכוז מומלץ 1:500 - 1,000</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-K12</td><td>Abcam</td><td>ab124975</td><td>ריכוז מומלץ 1:1,000</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-K14</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>ריכוז מומלץ 1:800</td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td></td> שקופיות כיסוי שונות <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> מלקחיים מעוקלים שונים <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>מכשירי</td> <td>דיוק עולמיים14127</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ.</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי</td><td></td> מיקרוסקופ פלורסנט שונים <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G מדיה הרכבה</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו חיתוך-להב ישר</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td></td></tr><tr><td>תנורי מיקרוגל</td><td>Galanz</td><td>זני עכבר P70D20TL-D4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C57/BL6 ו-Sv129 מעורב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מס' 4 מלקחיים ישרים</td><td>World Precision Instruments</td><td>501978-6</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td></td> פרפורמלדהיד שונים <td></td><td></td></tr><tr><td>(PFA)</td> <td>שונים</td><td></td><td>הכן תמיסה של 4% ב-1 ופעמים; PBS ומסנן עם 0.45&mu; m מסנן קרום</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות</td><td>שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריסודיום ציטראט</td><td>שונים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SLBW6818</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של גלגל שלם כדי להשיג רקמת פני השטח העינית אינטגרלי לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

משטח עינית (OS) מורכב גיליון אפיתל עם שלושה חלקים מחוברים: palpebral לחמית, בולבר לחמית האפיתל הקרנית. הפרעה של מערכת ההפעלה תוביל לדלקת, דלקת הלחמית או שניהם (keratoconjunctivitis הלחמית). ב מודלים בעלי חיים ניסיוניים עם שינויים גנטיים מסוימים או פעולות מלאכותיות, זה שימושי כדי לבחון את כל חלקי מערכת האפיתל של OS להערכת השינויים הפתולוגית היחסיים של כל חלק במקביל. עם זאת, ניתוח של רקמות מערכת ההפעלה כמכלול ללא עיוות או נזק כבר מאתגרת, בעיקר בשל רכות והתיקמות של מערכת ההפעלה המוצמדת פיזית להפריד העפעפיים עדיין והעין. בנוסף, שקע העין העמוק שנוצר על ידי עצמות הגולגולת/מסלולית קשה מאוכלס לגמרי על ידי גלגל העין עוזב מקום מוגבל לניתוח הפעלה. כתוצאה מכך, הניתוח הישיר של גלגל העין עם רקמות מערכת ההפעלה המשויכת מהצד הפנים לעתים קרובות להוביל לנזקי רקמות, במיוחד palpebral ו בולבר לחמית. בפרוטוקול זה, תיארנו שיטה להסיר את הגולגולת ואת עצמות מסלולית ברציפות מראש עכבר מנוכר, עוזב את העפעפיים, משטח העינית, עדשה הרשתית לגמרי בחתיכה אחת. השלמות של גיליון מערכת ההפעלה השתמר היטב, וניתן היה לבחון אותו על ידי היסטולוגיה או חיסוני בסעיף אחד.

עצמות הגולגולת הגדולות הנצפים מזוויות שונות היו מאוירים באיור 1א-E, עם צבעים המציין עצמות שונות. השתמשנו בחיה בת ארבעה שבועות להדגמה של תהליכי הניתוח. בעקבות צעדים לחיתוך 1.1.1-1.1.3 וקיבעון קצר (שלב 1.1.4), גלגל העין עם עצמות הפנים המשויכים מומחש 1E. קיצוץ נוסף כדי להסיר הקדמי (האף והלסת הקדמית) והאחורי (למשל, הקודקודית) כמו גם העצמות המוכבקות לחסום רקמה עם עצמות הלסת הקדמית בעיקר מקסימום על גבי...

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד של גלגל העין של העכבר עם עפעף, משטח עינית, מקטעים קדמי ואחורי במצב לא תקין יחסית.

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

המעבדה שלנו מתמקדת בהתפתחות העין והמחלות. פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרת הגולגולת ועצמות המסלול ברצף מראש עכבר נותק. השארת עפעפיים, משטח העין, עדשה, ואת הרשתית כולם יחד בחתיכה אחת. הפרוטוקול יועיל רופאי עיניים המעוניינים דידקטיקה פני השטח העין. אני דיאנל גואו, לספר את הטכניקה עם מאבק סביר כאשר מנסים למנוע את נזקי גלגל העין, תוך ניתוח עצמות הפנים. היתרון העיקרי של חומר ניתוח זה הוא כי השלמות של גיליון אפיתל פני העין נשמר היטב ואת החלקים השונים של פני השטח העין ניתן לבחון על ידי היסטולוגיה או immunostaining בחלק אחד בודד. הקפד לחתוך את כל העצמות הקטנות ופסולת של הרקמות הרכות. הסיבה, זה יגרום סימני צלקת על סעיף רקמות אחרת. לאחר המתת חיטוי העכבר, השתמש בזוג מספריים ישרים כדי לחתוך את הראש וחצה אותו לאורך קו האמצע הסגיטלי החל מעצם תוך-לידתית לעצם האף. מניחים כל חצי מהראש החוצה לתוך צלחת פטרי נקייה ולהשתמש במספריים חדים כדי לחתוך את הלסת והלשון. לשחרר את עצב הראייה על ידי חיתוך אותו מהמוח לפני מיקום chiasm אופטי. ולהסיר את כל רקמות המוח כולל נורת הריח, אשר מחובר לקיר הגולגולת. עכשיו לכל הרקמות הנותרות יהיו את כל עצמות הגולגולת והמסלול הקשורות לעין. לשטוף את החלקים הנותרים עם PBS כדי לנקות את כל פסולת דם ושיער. תקן מראש את הרקמות על ידי הצבתן בצינור של 50 מיליליטר המכיל 4% paraformaldehyde ומסובב אותן בטמפרטורת החדר. לאחר השלמת הקידומת, שטפו במהירות את הראש המנותח ב- PBS שלוש פעמים כדי לחסל עוד יותר את השערות השבורות ואת התיקונים. מניחים את הרקמה לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ וחותכים את הגולגולת לשלושה חלקים לאורך המטוסים המצוין דמות אחת של פרוטוקול הטקסט. גלגל העין והשקע מוסתרים בחלק האמצעי של הגולגולת תחת עצמות אתמואידיות, חזיתיות ומקסיליות. השתמש בשני זוגות של מטלות מספר ארבע רצופות כדי לקלף את עצם האתמואיד ולחשוף באופן מלא את העצמות הקדמיות והמקסינריות. לאחר מכן, גיאוגרפית לחלק את פני השטח של הגולגולת לארבעה אזורים. הכנס את קצה המדפים המעוקלים אופקית לכל אזור כדי להסיר את העצמות המקסילינריות והחזיתיות ברצף. לאחר מכן, העצמות הארגמן והמג'יגאל הבסיסיות ייחשפו. הסר את שתי העצמות ואת השרירים התת עוריים הקשורים ושומנים המקיפים את גלגל העין. חותכים את גלגל העין עם עפעפיים מחוברים ועור לתוך בלוק קטן, בצורת ריבוע כדי להפחית את נפח הרקמה להקל על התמצאות הרקמה בעת הטבעה. הנח את גלגל העין ואת הרקמות הקשורות בחזרה לתוך 4%paraformaldehyde ולהמשיך לתקן לילה ב 4

isolation-intact-eyeball-to-obtain-integral-ocular-surface-tissue-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

העיתון מתאר שיטה פשוטה כדי הקרנית בלו וכדי להוציא את העקר רקמות רשתית העין מן העולם של תורמים גווייה אדם. הטכניקה המתוארת כאן יעזור ובלו רקמות באיכות טובה כדי לשמש להשתלה, למטרות מחקר או ניתוח מבלי לפגוע ברקמות אחרות של הגלובוס העין.

טכניקה פשוטה עבור<em&gt; באתרו</em&gt; כריתת של הקרנית ואת הוצאת הקרביים של רקמת רשתית מ גלוב Ocular האדם

סרטון זה מדגים שיטה לגרימת דלקת בפני השטח של העין ותפקוד לקוי של בלוטת המייבומיאן במודל מורין. גירוי המערכת החיסונית של העכבר באמצעות אימונוגן ולאחר מכן רסטימולציה עם אותו אימונוגן מקדם דלקת פני העין, הגורמת לסתימת הפרשת בלוטת המייבומיאן דרך aggNET המיוצר על ידי נויטרופילים ומובילה למחלת עין יבשה.

שיטה לגרימת דלקת פני העין במודל מורין

מטרת פרוטוקול זה היא להראות טכניקה יעילה לבידוד ליבת הזגוגית וקליפת המוח השלמה והשלמה מעיני חזיר שעברו גרעין לאחר המוות.

כל הזגוגיות ההומור Dissection לניתוח Vitreodynamic

משטח העין הרגיל שנחשף מורכב קרנית ו הלחמית. תאי אפיתל, תאי גביע ותאי חיסון נמצאים בחניך. הנה, לא פולשנית, טכניקה של cytology הופעת מתואר באמצעות מכשיר cytology הרושם cytometry זרימה לנתח את תאי החיסון ב הלחמית.

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

מטרת פרוטוקול זה היא לאפיין מודל חדשני של ניוון עצבי גלאוקומטי המבוסס על צריבה תרמית של 360° של מקלעת כלי הדם הלימבלית, הגורמת ליתר לחץ דם עיני תת-חריף.

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

מאמר זה מציג פרוטוקול למיקרו-דיסקציה עינית במכרסמים. התהליך כולל את האינקולציה של גלגל העין יחד עם הממברנה הניקטיבית (כלומר, העפעף השלישי). לאחר מכן מתבצעת הפרדה של המשקפיים האחוריים והקדמיים.

מיקרודיסקציה של עין המכרסם

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להשגה וטיפוח של תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים (RPE) מעיניים חזיריות ממקור מקומי. תאים אלו מהווים חלופה איכותית לתאי גזע ומתאימים למחקר רשתית במבחנה .

בידוד תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזיריים ראשוניים למידול חוץ גופי

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גליית הרשתית מעיני עכבר. הפרוטוקול מתחיל באינקולציה ודיסקציה של עיני עכבר, ואחריו בידוד, זריעה וטיפוח של תאי מולר.

בידוד תאי גליית גליה ראשוניים ברשתית העכבר

חתך יסודי וסטנדרטי של גלובוס לא ניאופלסטי חשוב להשגת חתכים היסטופתולוגיים איכותיים הניתנים לשחזור. הנחיות להכנסה סטנדרטית של גלובוס לא ניאופלסטי למבוגרים ועוברים ניתנות כאן. אפשרויות שונות לחיתוך כדור הארץ מודגמות ונדונות, כולל קריטריונים לקבלת החלטות מבוססות מקרה.

ברוטו של גלובוס לא ניאופלסטי, כולל עיני עובר

מחקר זה מציג מתודולוגיה להעברת טיפולים לרשתית ולעצבי הראייה של החולדה הבוגרת. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לאחזור רקמות לאיסוף מלמעלה למטה של עצב הראייה והרשתית בחולדה בוגרת.

מתן טיפולי בעיניים ושליפת רקמות מתקדמת בחולדות בוגרות

למדו שיטת בידוד גלגל עין עכברים עם מבנים מצורפים לשימור רקמת פני השטח העינית לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימית. הפרוטוקול מועיל לחוקרים בתחום האופתלמולוגיה.

בידוד של גלגל שלם כדי להשיג רקמת פני השטח העינית אינטגרלי לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה

גלה סרטונים נוספים