Name: מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למדו כיצד למדוד מקצבי אוטופאגיה ופעילות פרוטאסום בכבד עכברים באמצעות הזרקות תוך בטניות ואנליזת ווסטרן בלוט. שיטה זו מאפשרת זיהוי שונות צירקדית בקטבוליזם חלבונים ומתאימה למחקר מטבוליזם ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו ממומנת על ידי RO1HL135846 ומענק מכון לפיתוח ילדים (PD-II-2016-529).

הפרוטוקול המתואר כאן אושר על ידי אוניברסיטת וושינגטון בכנסיית סנט לואיס בעלי חיים והוועדה השימוש (IACUC).
1. מגורי העכבר ותכנון ניסיוני
<ol><li>כדי לזהות מקצבים יומיים במחזור החלבונים, עכברים בבית (זכר או נקבה C57BL/6J, 4-8 שבוע בן, 20 עד 25 גרם) תחת סטנדרטי 12 h מחזורי אור/כהה עם מזון סיפק ad libitum. כדי להימנע מלהלחיץ את בעלי החיים, עכברים לפחות שבוע אחד במתקן לפני השימוש ולהימנע דיור יחיד. על מנת להוכיח כי המקצבים בקטוליזם החלבונים הם באמת אחראי (כלומר, מונע על ידי השעון הביולוגי הפנימי של בעל החיים), עכברים בבית תחת תנאים כהים מתמדת, מטפל כדי למנוע חשיפת העכברים לאור אקסוגני. הערה: לפרטים על מגורים העכבר לניסויים בקצב מעגלי ראה את ההפניה הבאה11.</li>
	<li>עבור כל נקודת זמן, להקצות שלושה עכברים כמו שולטת המזויף לפחות שלושה עכברים עבור כל סוג של מעכבי פרוטאז בשימוש (leupeptin עבור השטף האוטומטי ובורטזומב עבור מדידות השטף פרוטאסאואל). תכנון 6 נקודות זמן באופן שווה במרווחים של 4 שעות לאורך היום/לילה מחזור להשיג דגימות רקמות. הערה: A 24 h, 6 נקודת זמן ניסוי עם מלוחים באגירה פוספט (PBS), leupeptin, ו bortezomib יברות ידרוש סך של 54 עכברים (3 לכל טיפול x 3 טיפולים x 6 נקודות זמן).</li>
</ol>2. הכנת תמיסת הומוגון, פתרונות מלאי מעכב ומבחנות לאוסף כבד העכבר
<ol><li>להכין מאגר הומוגון טרי (HB) ולשמור על הקרח: 10 mM טריס-HCl pH 7.5, 250 mM סוכות, 5 mM EDTA pH 8.0, ו 1 מעכב פרוטאז לוח לכל 100 mL. הערה: כ 10 מ ל של HB נדרש לכל עכבר.</li>
	<li>עבור עיבוד במורד הזרם של דגימות ביולוגיות, כל מדגם מחייב 15 מ ל שפופרת חרוט להחזיק את המגון גולמי, 15 מ"ל צינור להחזיק את supernatant פוסט גרעיני, שני 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות להחזיק את 3,000 x g ו 20,000 x g מפלטד חומר, בהתאמה, ושפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL להחזיק את השבר cytoplasmic. הוסיפו 7 מ ל של HB הצטננות לכל צינורית המיועדת להומוגון גסה ושמרו על קרח.</li>
	<li>להכין פתרון 2 מ"ג/mL של מלאי של leupeptin המי-סולפט ב-PBS סטרילי. כמו כן להכין פתרון 50 mg/mL של בורטזומב diמתיל סולפוקסיד (DMSO). הקליקו ואחסנו את הפתרונות ב-80 ° c.</li>
</ol>3. מינהל מעכבי פרוטאז
<ol><li>הפשרת לוקיטין (2 מ"ג/mL) ובורטזומלי (50 מ"ג/mL) פתרונות מניות לטמפרטורת החדר 15 דקות לפני כל נקודת זמן. . מלאי הלופטין מוכן לזריקה לדלל את הבורזומב ב-PBS סטרילי כדי להניב פתרון מ50 μg/mL עובד. הערה: בוריזומאיב היא רגישה באור, ולכן להגן על מלאי העבודה מפני האור עד השימוש.</li>
	<li>שוקלים עכברים ולבצע זריקות הצפק של "שם" PBS (0.5 mL), leupeptin (40 מ"ג/ק"ג), או bortezomib או (1.6 μg/ק"ג). החזר עכברים לכלובים המסומנים כהלכה המקובצים לפי סוג הזריקה שהם קיבלו. תעד את הזמן שבו העכברים מטופלים או מניפולציות בטבלה סטנדרטית (ראה קובץ משלים "מדגם נתונים"). הערה: מחשבון מינון כלול כסיוע בקובץ משלים "לדוגמה נתונים". חשוב לבצע זריקות בזריזות ובאותו סדר מ-timepoint לנקודת זמן כדי למזער את השונות.</li>
</ol>4. רכישת רקמות ואחסון
<ol><li>שעתיים לאחר ההזרקה, המתת החסד של עכברים אחד בכל פעם, בהתאם לפרוטוקול IACUC מאושר מבחינה מבצעית. לדוגמה, עכברים מורדם ולאחר מכן המתת חסד על ידי פריקה צוואר הרחם. המשך לשלב הניתוח מיד. לאחר המתת החסד הערה: להבטיח הרדמה מלאה לפני פריקה צוואר הרחם על ידי כפות הקדמיות צובט ללא רפלקס הנצפה.</li>
	<li>הסר את האונה השמאלית של הכבד על ידי ביצוע 1.5 כדי 2.0 ס"מ חתך עם מספריים Metzenbaum על הבטן הגגבית של העכבר. להחצין את האונה השמאלית של הכבד ולבלו אותו עם מספריים כירורגיים. יש לטבול את דגימת הכבד ב -7 מ ל בתוך שפופרת הקרח הקרה בעלת תווית של 15 מ"ל. שמור את המדגם על הקרח במהלך העיבוד. הערה: ניתן לשמור את הדגימות בקרח או ב -4 ° c בלילה לפני שממשיכים. אם סמנים סטנדרטיים של הפעילות מאקרואוטומטית ו-פרוטאספאל הם הקריאות המיועדות רק, דגימות הכבד יכול להיות מוקפא בחנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 ° c לעיבוד מאוחר יותר. כדי לבחון מטרות אחרות של השפלה (למשל, באמצעות פרוטאומניקס), לעבד את הדגימות בלי לקפוא.</li>
	<li>המשך להרוג ולנתח את העכבר הבא עד שכל הדגימות נרכשים. לעבד עכברים באותה הסדר קבוצתי שהם הזריקו ולהקליט את המשך של שלב זה (ראה קובץ משלים "לדוגמה נתונים"). כל עכבר צריך להיות מעובד תחת 5 דקות כדי להגביל את ההפרש בזמני חשיפה עבור מעכבי מוזרק.</li>
</ol>5. שבירה ביוכימית של דגימות כבד
הערה: איור 1B מציג את סכימת השבר.
<ol><li>העבר כל דגימת כבד ו-7 מ ל של HB לתוך 15 mL בקיבולת הומוגנידצר. המגון לסדר את המדגם עם 10 משיכות של בוכנה רופף 15 משיכות של בוכנה הדוקה. החזר את המגון הגולמי הנוצר לצינור החרוט של 15 מ ל שמקורו. אני חוזר עד שכל דגימות. הכבד הומוגניים</li>
	<li>ספין גולמי המגון בדגימות ב 700 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי גרעיני גלולה ופסולת. העבר את החלק העליון 4 מ ל של supernatant שלאחר הגרעין (S1) לצינור מחדש של 15 מ ל חרוט.</li>
	<li>קבע את ריכוז החלבון של שבר S1 באמצעות ברדפורד או החומצה הבינוגית (bca) בחני על פי הוראות היצרן. הבא להשוות את הריכוזים של כל הדגימות כדי 2.1 mg/mL או לריכוז הרצוי על ידי הוספת HB החדש כדי S1 במידת הצורך. הדגימות המנורמלות הן שבר "סה כ חלבון" (עד). למטרות אנליטיות במורד הזרם ושיפור איכות, סדרת מחלקים 500 μl של שבר עד וחנות ב-80 ° c.</li>
	<li>העברת 1.5 mL של שבריר שארית לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה ספין ב 3,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. העבר 1 mL של התוצאה supernatant (S2) לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ולהגדיר על קרח.</li>
	<li>ולשטוף את הסופרנטאנט הנותרים ולרחוץ את 3,000 x גלולה (3KP) פעמיים עם 1.5 ML של הקרים HB. 3KP גלולה ניתן לאחסן יבש ב-80 ° צ' אם המטה הפרוטמרים צפויים. אם רק לחסום מערבי צפוי, להשעות מחדש את 3KP גלולה ב-200 μl של נתרן dodecyl סולפט אלקטרופורזה ג'ל טפלון (sds-PAGE) לדוגמה מאגר (טבלת חומרים) ו לרתוח ב 95 ° צ' עבור 5 דקות.</li>
	<li>ספין את השבר S2 ב 20,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. העבר את התוצאה (S3) לשפופרת מיקרוצנטריפוגה טרייה. S3 היא השבר cytoplasmic (cyto). עבור SDS-עמוד, לשלב 150 μL של Cyto שבר עם 50 μl של 4X sds-מאגר לדוגמה עמוד ולרתוח ב 95 ° צ' עבור 5 דקות.</li>
	<li>מ20KP את הסופרנטאנט הנותרים מתוך כדור ה20,000 x g (משחק) ולשטוף פעמיים עם 1.5 mL של הקרים HB. 20KP גלולה ניתן לאחסן יבש ב-80 ° צ' אם המטה הפרוטמרים צפויים. אם רק לחסום מערבי צפוי, להשעות מחדש את 20KP גלולה ב-100 μl של sds-מאגר לדוגמה עמוד ולרתוח ב 95 ° צ' עבור 5 דקות.</li>
</ol>6. הבלוג המערבי
<ol><li>על מנת לכמת את השטף המקרו-אוטומטיים והפרוטאספאל באמצעות בלוק מערבי, להלחין פתרון מניות של GT מטוהרים-LC3b (2 μg/mL), p62-שלו6 (2 μg/ml), ו-Lys48 מקושרים polyubiquitin (K48-וכד, 50 μg/ml) ב 1x sds- לאחר רתיחה ב 95 ° c עבור 5 דקות, סדרת מחלקים ו חנות ב-80 ° צ' לשימוש עתידי.</li>
	<li>בזמן ה-SDS-PAGE, צור עיקול סטנדרטי של 6 נקודות של תערובת החלבון הסטנדרטי על-ידי דילול מ1:3 במאגר של 1x SDS-עמוד לדוגמה. טען 10 μL של כל מדגם עקום רגיל על 26 טוב 4-12% SDS-עמוד midi-ג'ל, ואחריו תקני חלבון מוכתם (טבלת חומרים), תקן מולקולרי מולקולרית משקל.</li>
	<li>למדידת השטף האוטומטי, טען 12 μL של 3KP לתוך כל טוב. הערה: בהנחה התחזות, בורטזומב, וטיפולים לוקיטין נעשו ובהנחה 3 עכברים לכל טיפול, כל נקודת זמן צריכה להכיל 9 דגימות. לכן, כל midi-ג'ל יכול להכיל 2 נקודות זמן בתוספת עקומת הרגיל ואת הניסוי סדרת זמן אופייני ידרוש 3 midi-ג'לים עבור הבדיקה.</li>
	<li>למדידת השטף פרוטאספאל, טען 12 μL של Cyto שבר לתוך כל טוב.</li>
	<li>הפרדה בין דגימות חלבון באמצעות SDS-PAGE והעברה ל-polyvinylidene פלואוריד (PVDF) ממברנות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. אם מLC3b מערבי צפוי, להעביר ג'לים באמצעות 20% מתנול המכיל מאגר העברה. אחרת, השתמש ב-10% מתנול המכיל מאגר העברה מאחר שפעולה זו תאפשר העברה יעילה יותר של מינים מולקולריים גבוהים של חלבון משקל.</li>
	<li>בצע בלוק מערבי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. לניתוח שטף מאקרומי, ממברנות כתמי המכילים 3KP דגימות עם אנטי p62 או Anti-LC3b נוגדנים (1:1000) לילה ב 4 ° c. לניתוח השטף פרוטאספאל, ממברנות כתמי המכיל Cyto דגימות עם Anti-Lys48 ספציפי polyubiquitin (1:1000) לילה ב 4 ° c.</li>
	<li>תמונה הכלים מערבי באמצעות נוגדנים משני סטנדרטיים התקנים הדמיה. התמונה כל ממברנות המהווים ניסוי סדרת זמן נתון יחד.</li>
</ol>7. ניתוח נתונים
הערה: ראה קובץ משלים "נתונים לדוגמה".
<ol><li>כדי לבצע הדסילנסה על דגימות כתמי מערביות, השתמש בתוכנה גרפית סטנדרטית, בסטודיו תמונה או לחילופין imagej.</li>
	<li>ביצוע מדידות דנסיטומטריות על להקות התעניינות הן בעקומת התקן והן בדגימות הניסוי. בסטודיו תמונה, באמצעות p62 כדוגמה, לצייר מלבן ארוך המקיף מונומר חלבון בתחתית והארכת לחלק העליון של קרום. העתק, הדבק והזז את המלבן לדגימות הנותרות. חשוב לשמור על המלבן המשמש לכימות העקביות בין דגימות.</li>
	<li>שמור את הקוונפיקציה לגיליון אלקטרוני על-ידי הקשה על דוח ושיגור גיליון אלקטרוני בחלק הימני התחתון של חלון הניתוח.</li>
	<li>צור עקומת התקן densi, עם גיליון אלקטרוני באמצעות מדגם סטנדרטי מדולל באופן סדרתי ולהשתמש ברגרסיה לינארית או פולינומיאלית כדי לקבל משוואה עקומה רגילה המתאימה ביותר. באמצעות משוואה זו, לשער את כמות p62, LC3b-II או ליס48-פולי רוב בדגימות ניסיוני.</li>
	<li>כדי להשיג את מדידות השטף, להפחית את כמות החלבון שיעור של כל מעכב מטופל מתוך הערך הממוצע של דגימות PBS מאותו נקודת זמן (ראה קובץ משלים "לדוגמה נתונים").</li>
	<li>הערכת המשמעות הסטטיסטית של וריאציה טמפורלית במחזור החלבונים באמצעות ANOVA בדרך אחת. ניתן לעשות זאת באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני רגיל.</li>
</ol>

<ol><li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meter+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li>
<li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li>
<li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li>
<li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li>
<li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+protein+degradation%3A+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li>
<li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Logic+of+the+26S+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li>
<li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
<li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li>
<li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפרוטוקול שלנו מתאר אמצעי מבחינה טכנית פשוטה למדידת מקצבים ביולוגיים במחזור החלבונים בעכברים באמצעות ציוד מולקולרי זמין נפוץ בביולוגיה. בגלל המשך הניסויים בסדרת הזמן ומספר הדגימות הביולוגי המעורבות, חשוב להיות עקבי לאורך כל הניסוי בנוגע לאופן הזרקת העכברים, התזמון של רכישת רקמות והעיבוד הביוכימי של דגימות. הזריקה, המתת החסד ושלבי הפריקה הצווארי עשויים לדרוש תרגול מפעיל לפני התחלת ניסוי בקנה מידה מלא. זה הטוב ביותר עבור מפעיל יחיד כדי לבצע את כל הניתוח הרקמה מאז אנשים שונים לנתח במהירויות שונות, אבל אם זה בלתי אפשרי זה עש...

מקצבים circadian מתייחסים היום, וריאציות צפויות בתפקוד הביולוגי הגלויים ברחבי הטבע. הם קיימים בכל קנה מידה ביולוגי, מהתנהגויות מאקרוסקופיות כמו מחזורי התעוררות לשינה, לתופעות מולקולריות כמו השפע הקצבי של biomolecules. בשנים האחרונות, המחקר לתוך מקצבים מעגליות השתנה על ידי גילוי של "גנים שעון" כי הם קריטיים ליצירת קצב מעגלי. מחקרים בשעון גנים הסתרה עכברים חשפו תפקיד מרכזי עבור מקצבים מעגליות באופן זמני ארגון תהליכים סלולאריים ליבה כגון חילוף החומרים1. בין הדרכים מקצבים מעגליות לגרום לזה לקרות הוא על ידי הקניית מבנה זמני לקטוליזם חלבון.
מספר קבוצות כולל שלנו הראו כי שתי השדרות הגדולות לקטאבליזם חלבונים סלולריים, התצוגה האוטומטית של מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין, הם כפופים מקצבים יומי2,3,4,5. הבחירה האוטומטית מייצגת את הזרוע התלוית-ליקיה של קטאבוליזם חלבונים, שבה חלבונים מעניינים מועברים לdegradative זה או דרך הבנייה של שלפוחית הרומן (מאקרואוטומטית) או באמצעות טרנסלוקציה ישירה למרות ש ערוץ (שלווה אוטומטית מתווכת)6. מערכת אוביקוויב-פרוטסאין היא מסלול הראשי ללא-ליזוזומלית, שם חלבונים הם פולי-אוביקוויל ולאחר מכן ניזונים לתוך פרוטאסדום, מכונת macromolecular degradative שנמצאו ברחבי הציטופלסמה וגרעין7,8. המקצבים בפעילות האוטומטית והפרוטאספראל הם חשובים מכיוון שהם נוטים לשחק תפקיד במשק הבית הסלולרי. כתוצאה מכך, זה חשוב שיש הליך מתוקננת שיכול לזהות תנודות יומיות של קטאבוליזם חלבונים התואמים עם מודלים טרום קליניים מחלות.
כאן, אנו מספקים את הפרוטוקול שלנו כדי לכמת וריאציות יומי השטף האוטומטי בכבד העכבר, אשר שימש כבסיס לעבודה במעבדה שלנו3,9. השיטה שלנו מסווגת "שיטת מחזור"10, גישה המשמשת על ידי קבוצות רבות כדי למדוד פעילות פרוטחרדה (או שטף). בגישה זו, מעכבי פרוטאז ספציפיים לlysosomes או פרוטאסמס ניתנת לעכברים ולאחר מכן דגימות רקמות מתקבלים לאחר מרווח זמן קבוע. במקביל, דגימות רקמות מתקבלות מעכברים נתון זריקות מזויף. דגימות רקמות הם הומוגניים ולאחר מכן ביולוגי הופרדו כדי לקבל את השברים lysosome מועשר, cytoplasmic. שברים אלה מנותח לאחר מכן במקביל דרך הכתמים המערביים באמצעות נוגדנים ספציפיים סמנים macroLC3b hagy (ו-p62) או מצעים פרוטאספאל (חלבון פולי-אוביקטים). במשך הזמן, חיות מוזרק עם מעכבי פרוטאז לצבור חלבונים שהיו בדרך כלל היה ממוחזר. כתוצאה מכך, שיעור המחזור משתמעת על ידי השוואת השפע של חלבונים סמן בדגימות פרוטאז-מעכב הטיפול לדגימות מטופל המזויף. על-ידי חזרה על שיטה זו במרווחי זמן קבועים לאורך היום, ניתן לשחזר וריאציות מעגליות ב-פרוטפוליזיס (איור 1A).

<table><tbody><tr><td>4x SDS PAGE מאגר מדגם</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>EMD Millipore</td><td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LICOR</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF ממברנה 0.45 מיקרון</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>Cat# IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>K48-linkage ספציפי פוליוביקוויטין (D9D5)</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td> ארנב mAb <td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td><td></td></tr><tr><td>LC3a</td><td>בוסטון ביוכימיה</td><td>Cat# UL-430</td><td></td></tr><tr><td>LC3b נוגדן</td><td>נובוס</td><td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td><td></td></tr><tr><td>LC3b נוגדנים</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td><td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>סיגמא חתול#</td><td>L2884; CAS: 103476-89-7</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi ג'ל חלבון</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# WG1403BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS מאגר דגימה (4x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NP0007</td><td></td></tr><tr><td>P62-his</td><td>Novus</td><td>Cat# NBP1-44490</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# 1610373</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-p62/SQSTM1</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td><td></td></tr><tr><td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td><td>Boston Biochem</td><td>Cat# UC-230</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE ג'לים בגודל Midi</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# WG1403</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST טבליות מעכב פרוטאז</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Cat# S8830</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

תאים מעסיקים מספר שיטות למיחזור חלבונים בלתי רצויים וחומרים אחרים, כולל ליזוזומיום ושבילים לא-ליסוזומ. המסלול העיקרי התלוי למטה מכונה באופן אוטומטי, ואילו השיטה העיקרית שאינה ליסוזומלית עבור קטאבוליזם חלבונים היא מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין. מחקרים שנעשו לאחרונה במודל אורגניזמים מצביעים על כך שהפעילות של שני הדגמים האוטומטיים ומערכת אוביקוויב-פרוטאסאין אינה קבועה לאורך היום, אך במקום זאת משתנה בהתאם לקצב היומי (circadian). היכולת למדוד מקצבים ביולוגיים במחזור החלבונים חשוב להבין כיצד מושגת בקרת איכות סלולרית ולהבנת הדינמיקה של חלבונים ספציפיים המעניינים אותך. כאן אנו מציגים פרוטוקול מתוקננת עבור ככמת השטף האוטומטי ו הפרוטאסאואל בvivo כי לוכדת את רכיב האחראי של מחזור החלבון. הפרוטוקול שלנו כולל פרטים על הטיפול בעכבר, רקמת עיבוד, משבר, וכימות השטף האוטומטית באמצעות הכבד של העכבר כמו החומר ההתחלתי.

נתונים מייצגים מוצגים באיור 2א, ב, והקוונפיקציה של נתונים אלה מסופקים באיור 2C, D (ראה גם קובץ משלים "מדגם נתונים"). למען הפשטות, לא מתוארת הטענת שולטת באיור 2 אך יש להשיג זאת במקביל. בדרך כלל, בלוטים מערביים נגד β-actin משמשים למטרה זו, אך כתם חלבון מוחלט (כגון פוננסו S) יספיק. הבדיקה העיקרית עבור שטף המוזרם האוטומטי בכל נקודת זמן נתון הוא ההבדל בכמות הסמנים הספציפיים מאקרואוטומטית...

אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו למדידת מקצבים ביולוגיים בקטוליזם חלבונים באמצעות הוראות משוב ושוב בכבד העכבר.

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר מדידה של קצב פעילות אוטופגיה ופרוטאסומאלית ברקמות העכבר והוא רגיש מספיק כדי לזהות וריאציות סביבה בתוך פעילויות אלה. טכניקה זו יכולה לשמש vivo כדי להעריך קטבוליזם חלבון בתאים ורקמות ואת החומרים הנדרשים הם נמוכים יחסית טק ונגיש לכל מעבדה ביולוגיה מולקולרית. מדגים את ההליך יהיה מיכאיל Ryzhikov, פוסט דוקטורט מהמעבדה שלי.במשך רבע שעה לפני כל נקודת זמן, לחמם את פתרונות מלאי leupeptin ו bortezomib לטמפרטורת החדר לדלל את bortezomib מופשר PBS סטרילי להניב פתרון עבודה 50 מיליגרם למיליליטר. עבור ניהול מעכבי פרוטאז, להזריק תוך-אפית 40 מיליגרם לקילוגרם של leupeptin או 1.6 מיקרוגרם לקילוגרם של bortezomib לתוך כל חיה ניסיונית. עבור שליטה שלילית, להזריק עכברים עם 0.5 מיליליטר של PBS.להחזיר כל עכבר לכלובים מקובצים לפי סוג הטיפול המתקבל כפי שהם מוזרקים ולתזמן את הזמן כי העכברים מטופלים או מניפולציה בטבלה מתוקנת. שעתיים לאחר ההזרקה, להטביע את האונה הכבד השמאלי שנקטפו מכל חיה ניסיונית מוקרבת בשבעה מיליליטר של חיץ הומוגניזציה קר קרח כראוי שכותרתו 15 צינורות חרוט מיליליטר על קרח. כאשר כל הדגימות נרכשו, להעביר את המדגם הראשון ואת כל נפח של חיץ הומוגניזציה לתוך קיבולת 15 מיליליטר Dounce homogenizer הומוגניזציה המדגם עם 10 משיכות של בוכנה רופפת 15 משיכות של הבוכנה הדוק.להחזיר את הומוגנ

measuring-diurnal-rhythms-in-autophagic-and-proteasomal-flux

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים כיצד למדוד את פעילות הפרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים של האמיגדלה הצידית ממוחות של חולדות מותני פחד ולשלוט בהם באמצעות בדיקת פפטיד פלואורוגני. הפרוטאזום חותך את המצע הפפטידי הפלואורוגני, ומשחרר מולקולות פלואורסצנטיות, אשר מכומתות באמצעות קורא לוחות כדי להעריך את פעילות הפרוטאזום בשברים של חלבון גרעיני וסינפטי. פעילות גרעינית מוגברת מצביעה על שינויים בביטוי גנים, בעוד שפעילות סינפטית מופחתת מצביעה על ייצוב חלבונים הנחוץ לתחזוקת הזיכרון לטווח ארוך.

מדידת פעילות פרוטאזום בתאים תת-תאיים שונים במוח החולדה

Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

מיקרוסקופיה זמן לשגות של סמני autophagy כותרתו fluorescently מאפשרת ניטור של תגובת autophagy הדינמית עם רזולוציה גבוהה זמנית. שימוש autophagy ספציפית וסמני אברון בשילוב של 3 צבעים שונים, אנו יכולים לעקוב אחר תרומתו של חלבון להיווצרות autophagosome בהקשר מרחב ובזמן חזק.

לחיות תא הדמיה של אירועי autophagy מוקדמים: Omegasomes ומעבר

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

כאן מתואר פרוטוקול המאומת היטב ופשוט למדידת נפח פעילות פחמיות autophagic בתרבית של תאים. השיטה מבוססת על לכימות שחלקן של לקטט דהידרוגנאז (LDH) בחלקים תא sedimentable, לעומת סה כ רמות LDH הסלולר.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

Mitophagy, השפלה סלקטיבי של המיטוכונדריה, היה מעורב הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי, הוא deregulated למחלות אנושיות שונות. עם זאת, שיטות נסיוניות נוח למדידת פעילות mitophagy מוגבלים מאוד. כאן, אנו מספקים וזמינותו רגיש למדידת פעילות mitophagy באמצעות cytometry זרימה.

מדידה רגיש של Mitophagy מאת Flow Cytometry באמצעות תלויי-pH הכתב פלורסנט mt-Keima

פרוטוקול זה נועד ביעילות לכמת אוביקוויב-פרוטאסדום מערכת (UPS) פעילות בתאים סלולריים שונים של המוח מכרסם. משתמשים יכולים לבחון את התפקוד UPS בתוך שברים גרעיניים, cytoplasmic וסינפטית באותו בעל חיים, הפחתת כמות הזמן ומספר בעלי החיים הדרושים כדי לבצע ניתוחים אלה מורכבים.

בדיקת כימות משנית אוביקוויאין-פעילות פרוטאסדום במוח מכרסם

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה לתיוג מטבולי של תאים סניסנטיים ולא מתחלקים עם SILAC פועם, ניתוח ספקטרומטריית מסה לא ממוקדת וחישוב יעיל של זמן מחצית חיים של חלבונים.

מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בתאי תרבית סנסנטיים ולא מתחלקים באמצעות תיוג מטבולי וספקטרומטריית מסה

אנו מתארים פרוטוקולים הדרגתיים המודדים את הנשימה המיטוכונדריאלית של נויטרופילים עכבריים ואנושיים ותאי HL60 באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי מטבולי.

מדידה בזמן אמת של הפרופיל הביו-אנרגטי המיטוכונדריאלי של נויטרופילים

פרופיל איזוטופים יציבים ידי ניתוח כרומטוגרפיה מסת הגז spectrometric של השטף מטבולית מתווך מתואר...

פרופיל איזוטופים יציבים של שטף מטבולית מתווך בשלב פיתוח למבוגרים Caenorhabditis elegans</em

למדו כיצד למדוד מקצבי אוטופאגיה ופעילות פרוטאסום בכבד עכברים באמצעות הזרקות תוך בטניות ואנליזת ווסטרן בלוט. שיטה זו מאפשרת זיהוי שונות צירקדית בקטבוליזם חלבונים ומתאימה למחקר מטבוליזם ביולוגי.

מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

גלה סרטונים נוספים