המחשה מורפולוגיה באמצעות לוציפר ביוטופזיס צהוב

שיטה זו יכולה לשמש כדי להקל על הדמיה של תהליכי אסטרוציטים עדין מאוד להערכת אינטראקציות נוירונים אסטרוציטים בסינאפזה במהלך מחלה מצבים יציבים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם בכל מודל עכבר, אוכלוסיית תאים או אזור במוח. כדי להכין אלקטרודה חדה עם התנגדות מתאימה, משוך אלקטרודה חד חבית זכוכית borosilicate עם חוט על מושך micropipette.

אחסן את האלקטרודות שנמשכו במיכל סגור כדי למנוע מאבק להיכנס לטיפים ולשמור על האלקטרודות מוגבהות מתחתית הקופסה כדי למנוע מהטיפים להישבר. כדי למלא אלקטרודה בתתברית צבע צהובה לוציפר, מניחים אלקטרודה במיקום האנכי כשהטיפ פונה כלפי מטה, ואת פיפטה 1-2 מיקרוליטרים של תותב צהוב לוציפר בחלק האחורי של האלקטרודה. המתן חמש עד עשר דקות עד שהפתרון יעבור לקצה באמצעות פעולת נימים לפני שתאבטח בעדינות את האלקטרודה המלאה במחזיק אלקטרודה המחובר מניפולטור עם חוט הכסף של מחזיק האלקטרודה במגע עם צהוב לוציפר בתוך האלקטרודה.

לבדיקת פליטת הצבע, מניחים בעדינות פרוסת מוח קבועה קלות בצלחת תחתית זכוכית מלאה ב-PBS טוחן 0.1 בטמפרטורת החדר והחזיקו את הפרוסה במקום עם נבל פלטינה עם מיתרי ניילון. חבר את האלקטרודה למקור מתח והצב את האלקטרודה הקרקעית באמבטיה המכילה את פרוסת המוח. הזז את המטרה של מיקרוסקופ קונפוקל לאזור המוח של עניין ולהוריד את האלקטרודה לתוך הפתרון באמצעות עדשת טבילה במים 10X, הזזת האלקטרודה למרכז שדה המבט.

תחת תאורת שדה בהיר, בדוק את האלקטרודה בקפידה עם עדשת טבילת המים 40X כדי להבטיח כי האלקטרודה נראית ברורה וללא פסולת או בועות. עבור מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל עם לייזר 488 ננומטר. הפעל את המריצה ב 12 וולט כדי לבדוק את פליטת הצבע.

ענן צבע פלואורסצנטי גדול צריך להיות גלוי סביב קצה האלקטרודה. לאחר מכן, תחת שדה בהיר לאט להוריד את האלקטרודה לכיוון הפרוסה, לעצור ממש מעל פני השטח. כדי למלא אסטרוציטים מעניינים עם iontophoresis, השתמש בניגוד הפרעות דיפרנציאלי אינפרא אדום כדי לזהות אסטרוציטים עם סומטה מוארכת בצורת אליפסה על 10 מיקרומטר קוטר, 40 עד 50 מיקרומטר מתחת לפני השטח פרוסה.

זהו רדיאטום השכבה של ההיפוקמפוס ישירות מתחת לשכבת התא הפירמידלי. כאשר אנו נעים דרך הרקמה, אנו יכולים לראות כלי דם, נוירונים, אסטרוציטים וסוגי תאים אחרים. לאחר בחירת אסטרוציטים, הזז את התא למרכז שדה המבט והורד באיטיות את קצה האלקטרודה לפרוסה, תוך ניווט דרך הרקמה עד שהאלקטרודה נמצאת באותו מישור כמו גוף התא.

לאחר שגוף התא של האסטרוציטים נראה בבירור ומתוווה, לאט ובעדינות לקדם את האלקטרודה קדימה, הזזת האלקטרודה עד הקצה משכפל את סומא של התא. להזיז את המוקד של המטרה לאט למעלה ולמטה כדי לציין אם האלקטרודה היא בתוך soma. לאחר קצה האלקטרודה הוא בתוך התא, להפעיל את ממריצה ב 0.5 כדי וולט אחד כדי להוציא זרם ברציפות לתוך התא.

באמצעות מיקרוסקופ confocal, לצפות בסרט התא, להגדיל את הזום הדיגיטלי כדי לדמיין את הפרטים של התא כדי לוודא כי קצה האלקטרודה גלוי בתוך התא לפי הצורך. המתינו כ-15 דקות עד שיופיעו הענפים והתהליכים העדינים יותר לפני כיבוי המתח ונסיגה עדין של קצה האלקטרודה מהתא. כדי לדמיין את התא המלא, המתן 15 עד 20 דקות עד שהתא יחזור לצורתו המקורית לפני התאמת ההגדרה במיקרוסקופ הקונפוקל כדי לוודא שהענפים והתהליכים העדינים יותר יופיעו מוגדרים תחת המטרה 40X.

הגדר מחסנית Z בגודל צעד של 0.3 מיקרומטר, הזזת המטרה תוך הדמיה עד שלא יהיה אות מהתא והגדר שלב זה כראש. ואז להזיז את המטרה למטה, התמקדות דרך התא עד שאין אות ולהגדיר את הצעד הזה כמו התחתון. לאחר השלמת ההדמיה, בדוק את האלקטרודה עבור פליטת צבע.

אם מופיע ענן צבע גדול, ניתן להשתמש באלקטרודה לפרוסה הבאה. אחרת, החלף את האלקטרודה. על ידי יצירת הקרנה בעוצמה מקסימלית, ניתן לצפות בתצוגה מפורטת של מבנה האסטרוציטים בתחומו.

זום בעוצמה של 4 X לתוך האסטרוציטים חושף הקרנה בעוצמה מקסימלית של ענף מרכזי אחד, מספר ענפים משניים, והפצה של הענפים ועלונים שמסביב. כאן מוצגת התמונה המקורית של אסטרוציט CA1. גוף התא, הענפים העיקריים, התהליכים ונפח השטח המוקף על-ידי האסטרוציטים משוחזרים בתמונות הבאות.

לאחר יצירת השחזורים, כומתו כרכים של סומה, תא שלם וטריטוריה. ומספר הסניפים הגדולים נספר. כמו חלבון cytoskeletal כי תוויות ביניים סיספור אסטרוציטים בא לידי ביטוי סומא התא, ענפים מרכזיים, וכמה ענפי אסטרוציטים משניים, אבל לא בענפים ותהליכים עדינים.

בניתוח מייצג זה, לא נמצאו הבדלים משמעותיים במספר הענפים העיקריים המסווים על ידי חלבון חומצי פיברילית גליה ואלה לדמיין על ידי צהוב לוציפר. כמו כן, אזור התא ונפח האסטרוציטים המסומנים בחלבון חומצי פיבריל גליה היו קטנים משמעותית מהאזור והנפח המדמיין בצהוב לוציפר, מה שמוכיח כי חלבון חומצי פיברילי גליה הוא סמן אמין לתיוג ענפים מרכזיים אך אינו שימושי לקביעת השטח או הנפח הכוללים של התא. כמות הצבע המשתחררת מקצה האלקטרודה תלויה בהתנגדות האלקטרודה שחייבת להיות גבוהה מספיק כדי לאפשר פליטת זרם קבוע של צבע.

מחקרים עתידיים יכולים לבחון את המרכיבים השונים של מבנה אסטרוציטים על ידי מיקרוסקופ אור ברזולוציה סופר או על ידי ניתוח אימונוהיסטוכימי של הביטוי של חלבונים ספציפיים בתוך מבנה האסטרוציטים.