Name: שיטת האור המבוססת על ספוט לניתוח דרוזופילה זחל פוטומוניות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: למדו את שיטת מבחן כתם האור לניתוח התנהגות פוטוטקטית בזחלי Drosophila. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת הזחלים בתגובה לאור וזיהוי נוירונים אוקטופמינרגיים המעורבים בהתנהגות הימנעות מהאור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן המדע הטבעי של סין (31671074) וקרנות מחקר היסוד עבור האוניברסיטאות הפרובינציאלי ג'ה-ג'יאנג (2019XZZX003-12).

1. הכנת הזחלים מדרוזופילה
<ol><li>הכנת בינונית סטנדרטית המורכבת קמח תירס מבושל (73 g), אגר (5.6 g), ארוחה סויה (10 גרם), שמרים (17.3 g), סירופ (76 mL) ומים (1000 mL).</li>
	<li>מרימים את כל הזבובים ב-25 ° c על מדיום רגיל בחדר עם מחזור אור/12 h 12 שעות.</li>
</ol>2. הכנת צלחות אגר
<ol><li>להכין 1.0% הפתרון אגר. שוקלים 3 גרם של אגר בגביע 500 mL עם איזון, ואז להוסיף 300 mL של מים מזוקקים. מניחים נייר רדיד על המפסק כדי למנוע את המים מן התאדות. מחממים את הגביע במיקרוגל לרתיחה.</li>
	<li>קחו את הגביע ומערבבים היטב עם מוט זכוכית, ולאחר מכן החום במיקרוגל כדי לרתוח. חזור על הפעולה עד שהנוזל יהיה שקוף לחלוטין ונוזל. הערה: הפתרון הסופי אגר חם צריך להיות חופשי של בועות אוויר; אחרת, שפיכת אגר לתוך הצלחת יגרום משטח אחיד ומחוספס של הצלחת אגר, אשר ישפיע על בדיקה נוספת התנהגות זחל. הריכוז של הפתרון אגר לא צריך להיות גבוה מדי או נמוך. אם הריכוז גבוה מדי, השתקפות האור מפוזר על הצלחת אגר יהיה חזק להכפיש את הגבול אור/כהה. , אם הריכוז נמוך מדי. הזחלים ישאירו עקבות על הצלחת שתי שגיאות אלה להפריע עיבוד וידאו מאוחר יותר protcol.</li>
	<li>לאט לשפוך את הפתרון אגר חם לתוך צלחת פטרי (קוטר 15 ס מ) עד התחתון הוא מכוסה באופן שווה עם שכבה של אגר (~ 4 מ"מ עובי), קריר בטמפרטורת החדר (RT) עד הפתרון אגר מתחזק.</li>
	<li>לוחית אגר יש להשתמש כאשר הוא טרי מוכן. אם לא, יוצקים שכבה של מים על פני השטח ולאחסן אותו במקרר ב -4 ° c לשימוש מאוחר יותר.</li>
</ol>3. הגדרת מערכת גירוי חזותי
<ol><li>בחר את מקור אור ה-LED: נורית כחולה LED בשעה 470 ננומטר או אור לבן חם. הערה: ניתן להחליף את מקור האור באור LED של כל אורך גל אחר. בניסוי זה, נורית כחולה משמשת כדוגמה.</li>
	<li>מגלגלים פיסת נייר עבה ברדיד אלומיניום או קרטון שחור (להבטיח אטימות) כדי ליצור גליל פתוח של 12 ס מ אורך עם קוטר דומה לזה של נורית כחול LED עם קוטר של 3 ס"מ. הנח לקצה העליון של הצילינדר לכסות את הקצה הקדמי של נורית ה-LED הכחולה. לכסות את הקצה התחתון עם קרטון שחור עם חור עגול קטן (0.5 ס"מ קוטר) במרכז. זה מהווה את הגדרת מערכת מקור אור.</li>
	<li>תקן את מקור האור המוכן על מסגרת המגהץ באמצעות קליפ, וודא שתאורת ה-LED מוקרנת לכיוון שולחן העבודה. להטות את הצילינדר מעט. הזווית בין מישור הצילינדר למישור האנכי היא בערך 10 ° (ראה איור 1). חבר את האור הכחול 470 ננומטר לתקע "LED1" של מנהל ההתקן של נורית ההפעלה הגבוהה. הפעל את מנהל ההתקן, סובב את הידית בפינה הימנית העליונה של מנהל ההתקן כדי לבחור בערוץ 470 nmולאחר מכן לחץ על LED. לאחר מכן, כאשר המסך מציג "√", יופיע כתם אור כחול על שולחן העבודה. הערה: אם הגליל דולף אור בנוסף לחור העגול הקטן, מומלץ להשתמש בקלטת שחורה על החלקים הדולפת כדי לוודא שרק החור יכול להעביר אור דרך.</li>
	<li>לחץ על אישור וסובב את הידית כדי לכוונן את עוצמת האור. סובב את הכפתור לעוצמת אור גבוהה יותר של 50 mA. למדוד ולהקליט את הספקטרום של האור עם ספקטרומטר.</li>
	<li>הזז את מיקום מקור האור למעלה ולמטה כדי לכוונן את קוטר הנקודה הקלה ל-2 ס מ. שולחן העבודה צריך להיות שחור לאפקט ניגודיות טוב יותר.</li>
	<li>סובב את הכפתור כדי לבחור את עוצמת האור בהתאם לצרכים הניסיוניים. השתמש במסוף עם מד מתח קומפקטי עם חיישן כוח פוטודיודה סטנדרטי כדי למדוד את כוח האור המקסימלי והמינימלי במקום, להקליט אותו, למדוד שלוש פעמים, ולקחת את הערך הממוצע. הערה: מומלץ להשתמש בחיישן הכוח פוטודיודה כדי למדוד את עוצמת האור לאור של אורך גל ספציפי ולהשתמש בחיישן כוח תרמי כדי למדוד את עוצמת האור לאור לבן.</li>
	<li>לחשב את עוצמת האור במקום האור על ידי חלוקת כוח האור נמדד על ידי אזור החיישן. הערה: לדוגמה, אם כוח האור נמדד בשלב 2.6 הוא 20 pW והאזור של החיישן הוא 0.81 mm2, עוצמת האור היא 24.69 pw/mm2 (חילוק 20 pw על ידי 0.81 mm2).</li>
</ol>4. הגדרת מערכת ההדמיה
<ol><li>הצמד מצלמת אינטרנט ברזולוציה גבוהה עם סרטון ברזל, בערך 10 ס מ מעל לנקודת האור בשולחן העבודה (איור 1).</li>
	<li>כוונן את כיוון עדשת המצלמה לעבר שולחן העבודה. חבר את המצלמה למחשב באמצעות ממשק USB.</li>
	<li>מניחים צלחת אגר על שולחן העבודה ממש מתחת למצלמה.</li>
	<li>פתח את התוכנה "Amcap 9.22" במחשב עם Windows 7, ואת נקודת האור יוצג באופן אוטומטי בחלון של AMcap. הזז את המצלמה מעט שמאלה או ימינה כדי לוודא שנקודת האור נמצאת ליד מרכז החלון. ודא שהמצלמה אינה חוסמת את נתיב האור. הכתם האור צריך להיות שלם ועגול. הערה: ניתן למצוא את התוכנה ב-http://amcap.en.softonic.com/.</li>
	<li>תקן 850 ננומטר ± 3 להקה ננומטר לעבור מסנן עם קליפ ב 5-7 מ"מ ממש מתחת למצלמה. הערה: קוטרו של המסנן הוא כ-2.5 ס מ, ועדשת המצלמה קטנה מ-1 ס מ בקוטר, כך שהמסנן יכול לכסות את השדה החזותי של המצלמה. עם המסנן שמתחת למצלמה, אין לראות את נקודת האור בחלון AMcap.</li>
	<li>מקום שלוש נוריות אינפרא-אדום המייצרת (מרכזי גל = 850 ננומטר) באופן שווה סביב לוחית אגר. כל LED צריך להיות במרחק של 5 ס מ מהקצה של הצלחת אגר, ואת הפנים העדשה של LED צריך להיות בזווית כלפי מטה 70 ° לכיוון הצלחת אגר. חבר את הנוריות לחשמל באמצעות ממיר AC-to-DC. הערה: עדיף לתקן את המיקומים ואת הזוויות של נוריות האור אינפרא אדום כדי להבטיח עקביות של בהירות השדה בניסויים ניסיוני שונים ולהקל על עיבוד וידאו מאוחר יותר.</li>
	<li>שים לוח שחור בין המחשב וההתקן. הגדר את הבהירות של מסך המחשב כדי למנוע מנורית מסך המחשב להשפיע על הניסוי. הערה: שמור על הסביבה כהה כאשר מדידת אורך הגל או עוצמת האור.</li>
</ol>5. קביעת פרמטרים של הדמיה
<ol><li>בתפריט של תוכנת AMcap, בחרו ' אפשרויות ' | וידאו התקן | תבנית לכידה, ולהגדיר את גודל הפיקסל של וידאו שנתפסו כדי 800 x 600 ואת קצב המסגרות ל 60 fps.</li>
	<li>הסר את המסנן מתחת למצלמה, מקם סרגל מתחת למצלמה והתאם את מוקד המצלמה כדי להפוך את קו השינוי לבהיר ומקביל לרוחב של שדה הווידאו של התצוגה.</li>
	<li>לחץ על לכידת | התקין | לכידת וידאו כדי לבחור את נתיב השמירה, לחץ על התחל הקלטה, להקליט את המרחק בפועל המתאים ל 600 פיקסלים, ולחשב את היחס של כל פיקסל למרחק בפועל.</li>
</ol>6. הקלטת וידאו של הימנעות מאור התנהגות
<ol><li>שמרו על טמפרטורה של 25.5 ° c דרך כל הניסויים. בקרת טמפרטורת חדר עם מזגן אם נדרש. שמרו על הלחות כל הזמן ב 60% עם מכשיר לחות.</li>
	<li>צלם וידאו קצר של מיקום נקודת האור בשם "lightarea1". לאחר מכן, להעביר את 850 ננומטר ± 3 ננומטר מסנן בחזרה כדי לכסות את עדשת המצלמה. הערה: בעת הקלטת התנהגות זחל, עדשת המצלמה מכוסה על-ידי 850 nm ± 3 ננומטר מסנן, כך שנקודת האור אינה מוצגת בסרטון. ניתן לחזור לנקודת האור בקטעי וידאו עם זחלים מאוחר יותר עם Matlab. אין לשנות את מיקום המצלמה, ולהימנע משינוי היחס של כל אחד מהפיקסלים למרחק הממשי הנמדד בשלב 4.3.</li>
	<li>הדליקו אור (כלומר, אור בחדר) הרחק מהמכשיר הנסיוני. הפוך את האור לנמוך ככל האפשר, כל עוד הזחלים יכולים להיראות בבהירות עם העיניים. קחו את הזחלים מתוך מדיום התרבות עם כפית, בעדינות לבחור זחל שלישי, ולשטוף אותו נקי עם מים מזוקקים. היזהרו לשטוף זחל אחד בכל פעם כדי למנוע הפרעות מרעב. ניסוי בודד דורש. לפחות 20 זחלים</li>
	<li>להעביר את הזחל למרכז לוחית אגר ממוקם מתחת למצלמה במהלך שלב 3.3. להסיר בעדינות את המים העודפים מן הזחל עם מברשת או להשתמש בנייר כתמים כדי להסיר את המים מן הזחל כדי למנוע השתקפות של אור מתחת לעדשה. כבו את אור החדר והניחו לזחל להאקלים במשך 2 דקות בסביבה האפלה.</li>
	<li>הפעל את אור ה-LED כדי ליצור אור אינפרא-אדום, ומברשת בעדינות את הזחל למרכז הלוחית. כאשר הזחל מתחיל לזחול ישר, לסובב את הצלחת כדי להפוך את הזחל הראש לכיוון הנקודה האור. ודא שהוא זוחל היישר מההתחלה, או שהוא אינו יכול לקבל גישה לנקודת האור.</li>
	<li>לחץ על לכידת | התקין | לכידת וידאו כדי לבחור את נתיב השמירה ולאחר מכן לחץ על התחל הקלטה להקלטה. אפשר לזחל לזחול לכיוון נקודת האור, להזין את נקודת האור ולאחר מכן להשאיר את נקודת האור עד שהוא כמעט מחוץ לשדה התצוגה. לחץ על הפסק הקלטה. אם הזחל מתרחק מנקודת האור לפני שהוא מתקרב, לחץ ישירות על הפסק הקלטה.</li>
	<li>הזז את המסנן הרחק מהמצלמה. קח וידאו קצר של המיקום של מקום האור הקרוי "lightarea2" והשווה אותו ל-"lightarea1" כדי להבטיח שמיקום נקודת האור לא ישתנה. אם שינוי מיקום ברור נצפה, למחוק את הנתונים.</li>
</ol>7. ניתוח נתונים
<ol><li>השתמש ב-SOS17 כדי לחלץ מתאר גוף בעלי חיים ופרמטרים תנועה מסרטי וידאו באמצעות שיטות עיבוד תמונה כמתואר בעבר17. הערה: פרמטרים לרבות headSpeed (מהירות של ראש זחל), מהירות זנב (מהירות של זחל זנב), midSpeed (מהירות של זחל האמצע של קו השלד), ו cmSpeed (מהירות של זחל סנטאיד) שימשו למדידת מהירות התנועה זחל. פרמטרים כולל headTheta (הזווית בין הקווים של ראש האמצע והאמצע זנב) ו-Headtheta (המהירות המשתנה של headTheta) שימשו למדידת כיפוף גוף זחל ואת המהירות זוויתי של כיפוף.</li>
</ol>

<ol><li>Grossfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+distribution+and+light-dependent+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Geographic distribution and light-dependent behavior in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68, 2669(1971).</li>
<li>Godoy-Herrera, R. C. L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+Drosophila+melanogaster+larvae+during+pupation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">The behaviour of Drosophila melanogaster larvae during pupation.</a> Animal Behaviour. 37, (1989).</li>
<li>Busto, M., Iyengar, B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+behavior%3A+modulation+of+locomotion+by+light+in+the+Drosophila+melanogaster+larva+requires+genetically+distinct+visual+system+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of behavior: modulation of locomotion by light in the Drosophila melanogaster larva requires genetically distinct visual system functions.</a> Journal of Neuroscience. 19, 3337(1999).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293(2005).</li>
<li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> Journal of Neuroscience. 31, 6527(2011).</li>
<li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+photobehavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends in Neurosciences. 35, (2012).</li>
<li>Kane, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+structure+of+Drosophila+larva+phototaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, E3868(2013).</li>
<li>Humberg, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedicated+photoreceptor+pathways+in+Drosophila+larvae+mediate+navigation+by+processing+either+spatial+or+temporal+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications.+9%22%5BJournal%5D)">Dedicated photoreceptor pathways in Drosophila larvae mediate navigation by processing either spatial or temporal cues.</a> Nature Communications. 9. 1260, (2018).</li>
<li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+pairs+of+neurons+in+the+central+brain+control+Drosophila+innate+light+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two pairs of neurons in the central brain control Drosophila innate light preference.</a> Science. 330, (2010).</li>
<li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341, 1113(2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disinhibitory+mechanism+biases+Drosophila+innate+light+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A disinhibitory mechanism biases Drosophila innate light preference.</a> Nature Communications. 10, (2019).</li>
<li>Gong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Neuronal+Pathway+that+Commands+Deceleration+in+Drosophila+Larval+Light-Avoidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin.+Feb%22%5BJournal%5D)">A Neuronal Pathway that Commands Deceleration in Drosophila Larval Light-Avoidance.</a> Neuroscience Bulletin. Feb. 27, (2019).</li>
<li>Larderet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Drosophila+larval+visual+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Organization of the Drosophila larval visual circuit.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> Journal of Neurogenetics. 10, (1995).</li>
<li>Farca, L. A., von Essen, A. M., Widmer, Y. F., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+preference+assay+to+study+innate+and+circadian+regulated+photobehavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Light preference assay to study innate and circadian regulated photobehavior in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. 74 (74), e50237(2013).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921(2010).</li>
<li>Gomez-Marin, A., Partoune, N., Stephens, G. J., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tracking+of+animal+posture+and+movement+during+exploration+and+sensory+orientation+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated tracking of animal posture and movement during exploration and sensory orientation behaviors.</a> PLoS ONE. 7, e41642(2012).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה מציג את הגישה לנקודת האור כדי לבחון את היכולת של הזחלים של דרוזוהילה לברוח מהאור. היכולת הזאת מאפשרת מעקב אחר התנהגות הזחלים לפני הכניסה, במהלך המפגש, ולאחר השארת נקודת אור. פרטים על תנועת זחל ניתן ללכוד ולנתח. הכדאיות של נקודת האור היא פשוטה מאוד ובעלת יכולת מעשית חזקה. העלות של ההתקן כולו אינה גבוהה. בניסוי, אור LED משמש כמקור האור. ניתן להחליפו במקורות אור באורכי גל שונים, במידת הצורך. את עוצמת האור ניתן גם לכוונן על ידי כונן LED. עוצמת האור הנמוכה ביותר במקום יכולה להגיע ל-1.80 pW/mm2 ...

הזחלים של דרוזופילה מלוגסטר מציגים התנהגות ברורה של אור-הימנעות במהלך הבמה. דרוזופילה זחל פוטומוניות היה תחת חקירה, במיוחד בעבר 50 שנים1,2,3,4,5,6,7 ,8. בשנים האחרונות, למרות העובדה 1) נוירונים רבים מדיה הימנעות הזחל אור זוהו4,5,9,10,11,12 ו -2) החיבור המלא של מערכת הזחל ויזואלית ברזולוציה של הסינפסות הוקמה13, המנגנונים העצביים המשמשים את מוניות הזחל לא ברורים במידה רבה.
מספר התנהגות התנהגותית. שימשו ללימוד מוניות זחל הם יכולים להיות מחולקים במידה רבה לשני כיתות: אחד מעורב מעברי אור מרחבי המרחב והשני מעורבים מעברי אור זמני. עבור אור מרחבי מעבר הדרגתי, הזירה מחולקת למספר שווה של סעיפים באור ובחושך. הזירה ניתן לחלק לחצאים אור כהה2,4 או אור וכהה הרביעים14,15, או אפילו יכול להיות מופרד לאור חלופי ריבועים כהים כמו על לוח שחמט7. בדרך כלל, לוחות אגר משמשים לצורך במילוי מרחבי אור מרחבית, אבל צינורות המחולקים לאור חלופי ומקטעים אפלים יכולים לשמש גם10,14.
בגרסה ישנה יותר של הספר, תאורה אור מקורו בדרך כלל מתחת לזחלים. עם זאת, התאורה בגרסאות חדשות מקורו במידה רבה מלמעלה, מאז עיני הזחל (למשל, איברי הבולפאה הרגישים נמוך או בינוני בעוצמות האור16) כלולים בשלד cephalopharyngeal אטום עם פתחים לעבר חזית העליונה. זה הופך את הזחלים רגישים יותר לאור מכיוונים הקדמי העליון מאשר מתחת מאחורי הכיוונים7. עבור האור הזמני מעבר שאומר, עוצמת האור הוא אחיד ממדים בזירה, אבל האינטנסיביות שינויים לאורך זמן. בנוסף לאור מרובע הזמני גל (כלומר, מהבהב on/off או אור חזק/חלש3,7), אור שונים באופן זמני המתאים לשיפוע ליניארי בעוצמה משמש גם8 כדי למדוד את הרגישות של הזחלים שינוי זמני של גירוי באור.
סוג שלישי של שיטת הפוטומוניות הוא הניווט האור scape הכיוון, אשר מערבת תאורה מלמעלה בזווית של 45 °7. לפני העבודה של קיין ואח '7, רק פרמטרים גסים כגון מספר הזחלים באזורים האור והחשוך, תדירות המפנה, ואורך השבילים חושבו בזחל פוטומוניות assays. מאז עבודתה של אותה קבוצה, עם ניתוח של רקורד וידאו ברזולוציה גבוהה לזחל מוניות, דינמיקה מפורטת של תנועת זחל במהלך פוטומוניות (כלומר, מהירויות מיידיות של חלקים שונים של הזחל, כיוון הכותרת, מפנה זווית מהירות זוויתי המקביל) נותחו7. לפיכך, ניתן היה לגלות פרטים נוספים על התנהגות הזחל פוטופוטונית. באותם מספר, הזחלים נבדקים בקבוצות, כך שהשפעות הקבוצה לא ייכללו.
פרוטוקול זה מציג שיטת ספוט קלה לחקירת תגובות של זחל התנהגותי לגירוי קל בודדים. הערכה הניסיונית העיקרית מורכבת ממערכת גירוי חזותית ומערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום. במערכת הגירוי החזותי, מקור אור LED יוצר נקודת אור בקוטר 2 ס מ עגול על צלחת אגר, שם נבדק הזחל. ניתן לכוונן את עוצמת האור באמצעות מנהל התקן LED. מערכת ההדמיה כוללת מצלמת אינפרא אדום הלוכד את אופן הפעולה של הזחל בנוסף 3 850 הנוריות האינפרא-אדומות ננומטר לספק תאורה עבור המצלמה. העדשה של המצלמה מכוסה על ידי מסנן לעבור פס nm 850 ננומטר כדי לחסום את האור ממערכת גירוי חזותי מלהיכנס למצלמה, בעוד אור אינפרא אדום מותר להיכנס למצלמה. לפיכך, נמנעת הפרעה של גירוי חזותי בהדמיה. במסגרת זו, הפרטים ההתנהגותית של התגובות המהירות של הזחלים הבודדים בתקופה כולל לפני, במהלך, ולאחר הזנת האור מוקלטים ומנתחים.

<table><tbody><tr><td>850 ננומטר & מעבדות LED לייצור אור אינפרא אדום 3 ננומטר</td><td>, ארה"ב</td><td>חיישנים תואמי PM100A</td><td>: פוטודיודה וטווח הספק אופטי Thermal : 100 pW עד 200 W טווח אורך גל חיישן זמין: 185 ננומטר-25 &mu; m קצב רענון תצוגה: 20 הרץ רוחב פס: DC-100 קילו-הרץ טווח חיישן פוטודיודה: 50 nA-5 mA טווח חיישן תרמופיל: 1 mV-1 V</td></tr><tr><td>ממיר AC ל-DC</td><td>Thorlabs, ארה"ב</td><td>S120VC</td><td>גודל צמצם: &Oslash; 9.5 מ"מ טווח אורך גל: 200-1100 ננומטר טווח הספק: 50 nW-50 mW סוג גלאי: Si Photodiode (UV מורחב) ליניאריות: &plusmn; 0.5% אי ודאות מדידה: &plusmn; 3% (440-980 ננומטר), &plusmn; 5% (280-439 ננומטר), &plusmn; 7% (200-279 ננומטר, 981-1100 ננומטר)</td></tr> <tr><td>מסנן מעבר פס</td><td>Thorlabs, ארה"ב</td><td>DC2100</td><td>LED טווח זרם: 0-2 A LED רזולוציית זרם: 1 mA LED דיוק זרם: &plusmn; 20 mA LED מתח קדימה: 24 V טווח תדרי אפנון: 0-100 קילו-הרץ גל סינוס אפנון:</td></tr><tr><td>אור כחול LED קולימציה שרירותי&nbsp;</td><td>ELP, סין</td><td>USBFHD01M</td><td>מקסימום רזולוציה: 1920X1080 F6.0 מ"מ חיישן: 1/2.7 אינץ' CMOS OV2710</td></tr><tr><td>קונסולת מד כוח קומפקטית&nbsp;</td><td>אופטיקה אוקיינוס, ארה"ב</td><td>USB2000+(RAD)</td> <td>מידות: 89.1 מ"מ x 63.3 מ"מ x 34.4 מ"מ משקל: 190 גרם גלאי: Sony ILX511B (מערך CCD סיליקון ליניארי 2048 אלמנטים) טווח אורכי גל: 200-850 ננומטר זמן אינטגרציה: 1 ms &ndash; 65 שניות (20 שניות אופייניות) טווח דינמי: 8.5 x 10^7 (מערכת); 1300:1 לרכישה בודדת יחס אות לרעש: 250:1 (אות מלא) רעש כהה: 50 RMS counts סורג: 2 (250 &ndash; 800 ננומטר) חריץ: SLIT-50 עדשת איסוף גלאי: L2 מיון הזמנות: OFLV-200-850 רזולוציה אופטית: ~2.0 ננומטר FWHM אור תועה: < 0.05% ב-600 ננומטר; < 0.10% ב 435 ננומטר מחבר סיבים אופטיים: SMA 905 עד 0.22 צמצם מספרי סיב גדיל יחיד</td></tr><tr><td>דרייבר LED בעל הספק גבוה</td><td>Minhongshi, סין</td><td>MHS-48XY</td><td>מתח עבודה: DC12V אורך גל מרכזי: מצלמת אינטרנט ברזולוציה גבוהה 850 ננומטר</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs, ארה"ב</td><td>MWWHL4</td><td>צבע: לבן חם טמפרטורת צבע מתואמת: 3000 K זרם בדיקה עבור הספק LED טיפוסי: 1000 mA זרם מרבי (CW): 1000 mA רוחב פס (FWHM): N/A הספק חשמלי: 3000 mW זווית צפייה (זווית מלאה): 120 ? גודל פולט: 1 מ"מ x 1 מ"מ אורך חיים אופייני: >50 000 h טמפרטורת פעולה (ללא עיבוי): 0 עד 40 &deg; C טמפרטורת אחסון: -40 עד 70 & deg; C קבוצת סיכוןa: RG1 &ndash; קבוצת סיכון</td></tr><tr><td>נמוכה LED לבן</td><td>חם Mega-9, סין</td><td>BP850/22K</td><td>&Oslash; 25.4 (+0 ~ -0.1) מ"מ < > רוחב פס: 22 & plusmn; 3nm העברת שיא: 80% אורך גל מרכזי: 850nm &plusmn; 3 ננומטר&nbsp;</td></tr><tr><td>ספקטרומטר&nbsp;</td><td>נואל דנג'ו</td><td>אמקפאט9.22</td><td>AMCap&nbsp; הוא יישום לכידת סטילס ווידאו עם תכונות תצוגה מקדימה והקלטה מתקדמות. זהו יישום שולחן עבודה המיועד למחשבים עם Windows 7 SP1 ואילך. הכי הרבה&nbsp; וידאו ל-Windowsand&nbsp; התקנים תואמי DirectShow נתמכים בין אם מדובר במצלמות אינטרנט זולות או בכרטיסי לכידת וידאו מתקדמים.</td></tr><tr><td>חיישן הספק פוטו-דיודה סטנדרטי&nbsp;</td><td>סופר דרקון, סין</td><td>YGY-122000</td><td>כניסה: AC 100-240V ~ 50/60Hz 0.8A פלט: DC 12V 2A</td></tr><tr><td>חיישן כוח תרמי&nbsp;</td><td>Thorlabs, ארה"ב</td><td>M470L3-C1</td><td>צבע: כחול אורך גל נומינליa: 470 nm רוחב פס (FWHM): 25 nm זרם מרבי (CW): 1000 mA מתח קדימה: 3.2 V הספק חשמלי (מקסימום): 3200 mW גודל פולט: 1 מ"מ x 1 מ"מ אורך חיים אופייני: 100,000 שעות טמפרטורת פעולה (ללא עיבוי): 0 עד 40 &deg; C טמפרטורת אחסון: -40 עד 70 & deg; C קבוצת סיכוןb: RG2 &ndash; חיישן כוח תרמי לקבוצת סיכון בינונית</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thorlabs, ארה"ב</td><td>S401C</td><td>טווח אורכי גל: 190 ננומטר-20 &mu; m טווח הספק אופטי: 10 &mu; W-1 ואט (3 Wb) גודל צמצם כניסה: &Oslash; 10 מ"מ שטח גלאי פעיל: 10 מ"מ x 10 מ"מ צפיפות הספק אופטית מקסימלית: 500 W/cm2 (ממוצע) ליניאריות: &plusmn; 0.5%</td></tr></tbody></table>

שיטת האור המבוססת על ספוט לניתוח דרוזופילה זחל פוטומוניות

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

הזחלים של דרוזופילה מלוגסטר מציגים התנהגות ברורה של אור-הימנעות במהלך הבמה. דרוזופילה זחל פוטומוניות יכול לשמש כמודל לחקר התנהגות הימנעות מבעלי חיים. פרוטוקול זה מציג את התפקוד של נקודת האור כדי לחקור התנהגות של פוטוטקטיקה של זחל. הערכה הניסיונית כוללת שני חלקים עיקריים: מערכת גירוי חזותית היוצרת את נקודת האור, ומערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום הרושמת את תהליך ההימנעות מאור הזחל. הדבר מאפשר מעקב אחר אופן הפעולה של הזחל לפני הכניסה, במהלך המפגש, ולאחר עזיבת נקודת האור. פרטים על תנועת הזחל כולל האטה, הפסקה, הליהוק הראש, והפעלה ניתן ללכוד ולנתח באמצעות שיטה זו.

על פי הפרוטוקול, שימש השימוש בשיטת האור כדי לחקור את התנהגות ההתחמקות הקלה של הזחל השלישי שהועלו ב -25 ° c על המדיום הסטנדרטי בחדר עם מחזור אור/כהות של 12 שעות/12 שעות. אחד w1118 זחל נבדק באמצעות שיטת ספוט האור ב 25.5 ° c. עוצמת האור הממוצעת של מקום האור שנוצר על ידי LED nm 460 היה 0.59 μW/cm2. כל תהליך הזחל הנכנס והיציאה מהנקודה האור נרשם ונותח באמצעות תוכנות SOS וסקריפטים כתובים מותאמים אישית12,17. עקומות זמן של מהירות זנב, הגוף ...

פרוטוקול זה מציג שיטה בעלת מקום קל לחקור התנהגות של דרוזוהילה זחל פוטוטקטיקה. בשיטה זו, נקודת אור נוצרת כגירוי קל, והתהליך של התחמקות מאור הזחל נרשם על-ידי מערכת הדמיה מבוססת אור אינפרא-אדום.

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

באמצעות ההסטה של נקודת האור, ניתן לעקוב אחר ההתנהגות של הזחלים לפני, במהלך ואחרי הכניסה לאזור האור המאפשר לנתח את הפרטים של תנועת הזחל. בדיקה זו היא פשוטה וקלה לביצוע. תגובת האור נבדקת פעם אחת בלבד, כך שניתן לשלול כל השפעה אפשרית של התאמת האור.כדי להכין את צלחות אגר, לאט ובדרך שווה לכסות את החלק התחתון של צלחת פטרי 15 ס"מ עם שכבה בעובי של כארבעה מילימטר של חם 1% אגר. אפשר לצלחת להתקרר בטמפרטורת החדר עד שהגר יתמצה. כדי להגדיר את מערכת הגירוי החזותי, גזור מקור אור LED מוכן על מסגרת ברזל, תוך טיפול כי האור מקרין כלפי מטה לכיוון שולחן העבודה.להטות את הצילינדר מעט עד הזווית בין מישור הצילינדר לבין המישור האנכי הוא כ 10 מעלות. חבר את אור LED כחול 470 ננומטר לתקע LED אחד של מנהל ההתקן LED כוח גבוה ולהדליק את הנהג. סובב את הידית בפינה השמאלית העליונה של הנהג כדי לבחור ערוץ 470 ננומטר ולחץ על LED.כאשר המסך יציג בדיקה, תופיע נקודת אור כחולה בשולחן העבודה. לחץ על אישור וסובב את הידית כדי להתאים את עוצמת האור. הזז את מיקום מקור האור למעלה ולמטה כדי להתאים את קוטר נקודת האור לשני סנטימטרים.סובב את הידית כדי לבחור את עוצמת האור בהתאם לדרישות הניסוי. השתמש במסוף מד כוח קומפקטי עם חיישן כוח דיודה צילום סטנדרטי כדי למדוד את כוח האור המקסימלי והמינימלי במקום. כוח האור צריך להימדד בחושך בניסוי עצמו.ל

light-spot-based-assay-for-analysis-of-drosophila-larval-phototaxis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה וידאו, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בנייה של הדרגתיים odorant בגיאומטריות ויציב לשליטה. אנו בקצרה להמחיש כיצד הדרגתיים אלה יכולים לשמש מסך פגמים חוש הריח (תתרנות מלאה או חלקית) ו ללמוד תכונות מהותיות יותר של התנהגות chemotaxis.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

תסיסנית melanogaster היא מערכת גנטית התנהגותית מודל צייתן, שבו נעשה שימוש כדי להבין את הבסיס המולקולרי התאי של תהליכים ביולוגיים רבים חשובים יותר ממאה שנים 1. תסיסנית נוצלה היטב כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס הגנטי של ההתנהגות במהירות הבזק.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

זחלי דרוזופילה רגישים לאור ומגיבים לשינויים באור שמסביב. סרטון זה מתאר בדיקה הבדוקה את יכולתם להימנע מאור, הנקראת בדיקת נקודת האור. הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד להגדיר את התסעפות עם נורית אור כחול ומראה כיצד לתעד את התנהגות החיה בתגובה למפגש האור.

אור ספוט Assay: שיטה לחקור התנהגות פוטוטאקטית Drosophila

כאן אנו מתארים מבחן העדפת אור בחושך לזחל דרוזופילה. assay זה מספק מידע על רגולציה מולדת ויממה של photobehavior חישה ועיבוד אור.

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה.

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב דרוזופילה

דוח זה מתאר שיטה למדידת פעילות הזחלים של דרוזופילה באמצעות מוניטור פעילות הדרוזופילה TriKinetics. המכשיר משתמש בקרני אינפרא אדום כדי לזהות תנועות של עד 16 בעלי חיים בודדים. ניתן לנתח נתונים כדי לייצג פרמטרי תנועה כולל קצבים ומיקומי בעלי החיים בתוך תאי הבדיקה.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

פרוטוקול זה מתאר בדיקת תפוקה גבוהה לבדיקת העדפות הטלת ביצים של Drosophila melanogaster ברזולוציה של בעל חיים יחיד.  בדיקה זו מספקת פלטפורמה פשוטה, יעילה וניתנת להרחבה לזיהוי גנים ורכיבי מעגלים השולטים בתהליך קבלת החלטות פשוט.

Assay תפוקה גבוהה לבחינת העדפות הטלה של פרט<em&gt; תסיסנית</em

פרוטוקול זה מנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של נוירונים חוש הריח שלו. אור של 630 ננומטר אורך גל משמש כדי להפעיל את חוש הריח נוירונים בודדים לבטא של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ. תנועת הזחל מתבצע בו זמנית, רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות תוכנה מותאמת אישית-נכתב.

מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים

כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP

מאמר זה מציג שיטות למניפולציה אופטוגנטית ב-Drosophila melanogaster, תוך שימוש ב-CsChrimson ו-GtACR2 כדי להפעיל ולהשתיק נוירונים ספציפיים. ארבעה ניסויים מתוארים לשימוש באופטוגנטיקה כדי לחקור התנהגויות תרמוטקטיות וטעמיות, ומספקים תובנות לגבי המנגנונים העצביים הבסיסיים השולטים בתהליכים אלה.

מבחנים התנהגותיים למניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר

הפרוטוקול מציג שיטה בעלת תפוקה גבוהה וחסכונית להערכת רעילות עצבית בזבוב הפירות באמצעות כימות תפקוד לקומוטורי כחלופה למודלים מסורתיים של יונקים. מטרתו להעריך את ההשפעות הנוירוטוקסיות של תרכובות פרמצבטיות, גורמים סביבתיים או שינויים גנטיים באמצעות מודל רגיש, ניתן לשחזור וחיובי מבחינה אתית.

ניתוח התנהגותי של תפקוד לקומוטורי ב-Drosophila melanogaster כקריאה לרעילות עצבית

למדו את שיטת מבחן כתם האור לניתוח התנהגות פוטוטקטית בזחלי Drosophila. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תנועת הזחלים בתגובה לאור וזיהוי נוירונים אוקטופמינרגיים המעורבים בהתנהגות הימנעות מהאור.

שיטת האור המבוססת על ספוט לניתוח דרוזופילה זחל פוטומוניות

גלה סרטונים נוספים