Name: בצובר Droplet ויטריפיקציה עבור שימור ההירופציט הראשי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: למד שיטת ויטריפיקציה בטיפות גדולות לשימור כמות גדולה של הפטוציטים ראשוניים מעכברים. שיטה זו משתמשת בריכוזים נמוכים של סוכני הגנה מקפיאים ומייעלת את התוצאות להשתלת תאי כבד ויישומים קליניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון ממוסדות הבריאות הלאומיים של ארה ב (R01DK096075, R01DK107875, R01DK114506) ומשרד ההגנה של ארה ב (משרד הבטחון RTRP W81XWH-17-1-0680) מודה מאוד.

החרופציט העיקרי עבור פרוטוקול זה בוצעו על-ידי ליבת משאבי התא (CRC) בבית החולים הכללי של מסצ, בוסטון, מסצ, ארה ב. פרוטוקול החיות (#2011N000111) אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של בית החולים הכללי של מסצ.
1. droplet גורפת ויטריפיקציה
<ol><li>הכינו את הפתרונות הויטריפיקציה.
	<ol>
<li>הוסף 40 מ"ג של סרום של שור (BSA) כדי 17.0 mL של הפתרון של אוניברסיטת ויסקונסין (UW) כדי להפוך פתרון ויטריפיקציה 1 (V1). המסנן הסטרילי מסנן את הפתרון V1 באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר ואחסן ב-4 ° c. הערה: UW הוא פתרון נפוץ לשימור איברים. הוא מכיל 50 g/L הידרוקסיל עמילן, 35.83 g/L חומצה lactoביונית, 3.4 g/L אשלגן פוספט monobasic, 1.23 g/L מגנזיום סולפט הצמח, 17.83 g/L רפפינז הקרב, 1.34 g/L אדנוזין, 0.136 g/L allopurinol, 0.992 g/l סה כ גלוטתיון, 5.61 g /L אשלגן הידרוקסיד, ו הידרוקסיד הנתרן כדי לכוונן את ה-pH ל 7.4.</li>
		<li>לשלב 7.0 mL של UW, 6.5 mL של DMSO, 6.5 mL של אתילן גליקול (EG), 40 mg של BSA, ו-5.48 g של סוכרוז להפוך פתרון ויטריפיקציה 2 (V2). מסנן סטרילי הפתרון V2 באמצעות מסנן 0.22 יקרומטר. טעינת 3.5 mL של פתרון מסוננים מסונן ב 3 מ"ל וחנות ב 4 ° c. הערה: כדי להקל על המסת ה-CPAs, הפתרונות מוכנים בכמויות גדולות מהנדרש.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן את מנגנון ה-droplet ויטריפיקציה בצובר.
	<ol>
<li>כדי להכין את המחט ערבוב, לחתוך הראשון לאורך צד אחד של השרוול החיצוני של המחט ערבוב, ולאחר מכן לכופף את השרוול פתוח כדי להסיר אותו ממחט ערבוב.</li>
		<li>שקופית 2 25 mm צינורות סיליקון מקטעים על האינלטס של המחט ערבוב ולאבטח את עמדתם עם דבק (איור 1א).</li>
		<li>חותכים את המחט לאורך של 20 מ"מ (כלומר, אורך סליל ערבוב פנימי) כפי שמוצג באיור 1א. הערה: אורך המחט ערבוב פרופורציונלי לנפח בתוך המחט ולכן ניתן לשנות כדי לשלוט על זמן חשיפה של hepatocytes לפתרון הריכוז הגבוה CPA.</li>
		<li>הכנס את משקע הקיצוץ של המחט ערבוב לתוך מזרק 20 G הזרקה (איור 1B). הערה: גודל מחט ההזרקה משפיע על גודל ה-droplet.</li>
		<li>לחטא את מכלול המחט הערבוב על ידי אוטוקלינג.</li>
		<li>מלאו מלחמה סטרילית. עם חנקן נוזלי לחטא את החלק החיצוני של Dewar עם איזופנול לפני הצבת Dewar במכסה התרבות של תאי זרימה סטרילית למינארי. הערה: זיהום הוא שיקול חשוב במהלך חשיפה ישירה של טיפות לחנקן נוזלי. למרות שלא היה זיהום באמצעות חנקן נוזלי לא מעוקר בפרוטוקול הנוכחי, חנקן נוזלי ניתן לסנן או לקרינה כדי להבטיח עקרות אם הצורך16.</li>
		<li>הכנס משפך עם אותו קוטר חיצוני כמו הקוטר הפנימי של החנקן הנוזלי dewar לתוך שפופרת חרוט 50 mL ליצירת מכשיר אוסף droplet (איור 1C-E).</li>
		<li>להטביע את המכשיר droplet בחנקן נוזלי על ידי לחיצה איטית למטה במיקום האנכי הסופי שלה באמצעות מלקחיים גדולים. ודא שצינור החרוט מונח בתנוחה אנכית בתחתית הדמלחמה (איור 1ד-י). הערה: על המשפך להישאר מוכנס ולנוח בצינור החרוט. רמת החנקן הנוזלי צריכה להיות 1 ס מ מתחת לגובה המיפרץ של המשפך, כפי שמוצג באיור 1D.</li>
		<li>הר משאבת מזרק בעמדה אנכית על הקיר של כובע תרבות התא על ידי קשירת מחרוזת מכפות הרגליים של משאבת מזרק לברגים בולטות מן הקיר תרבות תא כיפה.</li>
		<li>מניחים את החנקן נוזלי Dewar עם מכשיר ה-droplet אוסף תחת משאבת מזרק אנכית נטען (איור 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>טרום הדגירה עם CPAs.
	<ol>
<li>לאחר קבלת החולדה מבודדת העכבר הבודד, לספור את הריכוז מניות על ידי טרילון כחול הדרה ולקחת 40,000,000 hepatocytes קיימא. הערה: טיפול עדין בהפטציטים בהשעיה הוא קריטי למניעת מוות תאי.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 50 x g עבור 5 דקות ללא בלם.</li>
		<li>ומחדש את ההפטציטים ב-3.4 mL של הפתרון V1.</li>
		<li>דגירה על הקרח 3 דקות.</li>
		<li>הוסף 150 μL של DMSO ו 150 μL של EG ל-hepatocytes ומערבבים בעדינות.</li>
		<li>דגירה על הקרח 3 דקות.</li>
		<li>שוב, להוסיף 150 μL של DMSO ו 150 μL של למשל כדי hepatocytes ולערבב בעדינות.</li>
		<li>טען 3.5 mL במזרק 3 מ ל.</li>
	</ol></li>
	<li>. לבצע ויטריפיקציה
	<ol>
<li>הכנס את המזרק עם hepatocytes טרום המחשב ואת מזרקים פתרון V2 על מתאם משאבת המזרק.</li>
		<li>צרף שתי נקבה Luer נעילת צינור בארב מתאמים מזרקים להחליק את אבובים סיליקון של ההרכבה מחט ערבוב על האביזרים בארב (איור 1F).</li>
		<li>הצב את ההרכבה כולה במשאבת המזרק (איור 1E).</li>
		<li>שלושה דקות לאחר התוספת האחרונה של DMSO ו-EG כדי hepatocytes, להפעיל את המשאבה ב 2 מ ל/דקה.</li>
		<li>הפסיקו את המשאבה לאחר שכל הפטוציטים נוספו לחנקן הנוזלי.</li>
	</ol></li>
</ol>2. אחסון קריוגני
<ol><li>ניקוב 10 חורים קטנים במכסה של צינור 50 mL באמצעות מחט של 20 גרם ולעטוף את החלק החיצוני של המכסה עם סרט גמיש, כפי שמוצג באיור 1B. זה יוצר שסתום המאפשר בריחה של שאריות חנקן נוזלי.</li>
	<li>כדי לאסוף את טיפות hepatocyte מעשה, ראשית להסיר את המשפך מן החנקן נוזלי Dewar. הבא, השתמש מלקחיים ארוכים לקחת את צינור חרוט המכיל את טיפות מתוך החנקן הנוזלי ובאיטיות לשפוך את החנקן הנוזלי עודף מצינור החרוט.</li>
	<li>סגרו את צינור החרוט עם המכסה הנוקב והציבו ישירות את צינור החרוט הסגור עם טיפות החרופציט לאחור בחנקן הנוזלי.</li>
	<li>להעביר את צינור החרוט מן החנקן הנוזלי לתוך אדי חנקן נוזלי קריוטנק.</li>
</ol>3. התחממות מחדש של טיפות הפטציט
<ol><li>
הכן את פתרון ההתחממות החוזרת.
	<ol>
<li>התמוססות 17.13 גרם של סוכרוז ב-100 mL של מדיית התרבות התרבותית של DMEM כדי ליצור את פתרון ההתחממות מחדש. המסנן הסטרילי מסנן את פתרון ההתחממות מחדש באמצעות פילטר 0.22 יקרומטר וחמים ל-37 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
. חממי מחדש את ההיפטציטים
	<ol>
<li>קח את הצינורית החרותית בעזרת הפטציטים והובלת אותו בחנקן נוזלי למכסה המנוע של התאים.</li>
		<li>שחרר קלות את הכובע והחזר את הצינורית החרוטית לתוך החנקן הנוזלי.</li>
		<li>הוסיפו את טיפות הפטציט המרופנות לגביע ריק, הוסיפו באופן מיידי את התמיסה החמימה (37 ° c), ומיד מערבבים 10 ס מ. הערה: חשוב לעבוד במהירות כדי למנוע הקפאה במהלך התחממות מחדש. בהתאם לדרישות המחקר, מעטים לכל הטיפות ניתן לrewarmed בבת אחת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בטל את הטעינה של פתרון ההתחממות מחדש.
	<ol>
<li>מחלקים את פתרון ההתחממות החוזרת עם hepatocytes מעל 2 50 מ"ל שפופרות חרוט.</li>
		<li>צנטריפוגה את שני צינורות חרוט עבור 2 דקות ב 100 x g ב 4 ° צ' ללא בלם.</li>
		<li>משלחים את סופרנאטאנט כדי להשאיר נפח כולל של 12.5 mL באמצעות סימן הסיום של הצינור החרוט כהפניה ולהוסיף 12.5 mL של DMEM קר הקרח בצינור הקירור כדי לדלל את הפתרון התחממות מחדש ל 50%.</li>
		<li>השהה מחדש את הפטציטים והדגירה על הקרח במשך 3 דקות.</li>
		<li>הוסף 25 מ ל של הקרח קר DMEM לצינור חרוט כדי לדלל את הפתרון התחממות מחדש ל 25%.</li>
		<li>צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 50 x g ב 4 ° c ללא בלם.</li>
		<li>לאחר מכן, השתמש בתכשיר והשהה מחדש את הפטציטים ב -2 מ ל של מדיום התרבות הרצוי לשימוש. הערה: הצנטריפוגה מעבר בצפיפות ניתן להשתמש כדי להסיר hepatocytes מת מהשעיה התא אם יש צורך.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+and+bioartificial+liver+devices%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li>
<li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+transplantation%3A+Hepatocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li>
<li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li>
<li>Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+cryopreservation%3A+is+it+time+to+change+the+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li>
<li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).</li>
<li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation%3A+An+emerging+paradigm+change%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li>
<li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li>
<li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li>
<li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+encapsulating+droplet+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).</li>
<li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li>
<li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-%CE%BCl+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li>
<li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+banking+in+living+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530(2011).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li>
<li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+Droplet+Vitrification%3A+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li>
<li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li>
<li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoprotectant+Toxicity%3A+Facts%2C+Issues%2C+and+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים. ד ר דה פריז, וואנג, טונר, Tessier, ו Ugun יש בקשות פטנט הזמניים הרלוונטיים למחקר זה. לד ר אויגאן יש אינטרס פיננסי בפתרונות איברים, חברה המתמקדת בפיתוח טכנולוגיית שימור איברים. כל האינטרסים של החוקרים מנוהלים על ידי הבריאות של MGH ושותפים בהתאם לסכסוך המדיניות שלהם.

הקפאת ההזמנה של hepatocytes על ידי הקפאה איטית תוצאות הכדאיות מופחתת פונקציה מטבולית. ויטריפיקציה מציעה חלופה מבטיחה לקריוגנית קלאסית, כאשר הפציעה הקפואה נמנעת לחלוטין9. עם זאת, טרום דגירה עם CPAs נדרש כדי להקטין את קצב הקירור הקריטי8. כתוצאה מכך, הויטריפיקציה מהרעילות של רואי החשבון17 ומוגבלת לנפחים קטנים של מדגם. במאמצים להתגבר על מגבלות אלה ויטריפיקציה בצובר השיטה droplet שהוצגו בכתב יד זה פותחה כדי לאפשר ויטריפיקציה של כמויות גדולות של תאים תוך ש...

הפסד של הכדאיות התאית ותפקוד מטבולית לאחר קריוגנית של hepatocytes עדיין בעיה מרכזית המגבילה יישומים קליניים1,2,3. שיטת בחינת הסדר של ההיפציט הקריוגנית היא איטית-הקפאה, אשר מבוצעת על ידי הפרה מראש של hepatocyte עם CPA (diמתיל סולפוקסיד [dmso], גלוקוז, ו-אלבומין, הקפאת קצב מבוקרת (בקירוב 1 ° c/min) כדי ל טמפרטורות קריוגניים4,5. למרות מיטובי הדיווחים רבים, הרעלת רואי חשבון ביחד עם חוסר איזון אוסמוטי מזיק במהלך הקפאת הלחץ מכני של היווצרות קרח להישאר החסרונות הבסיסיים של קיפאון איטי6,7.
ויטריפיקציה מציע יתרון על הקפאה איטית בפציעה זו בשל היווצרות קרח הוא נמנע לחלוטין על ידי מעבר שלב ישיר של מים למצב זכוכית6. עם זאת, כדי להגיע לטמפרטורת המעבר זכוכית של מים טהורים (-137 ° c), המים חייבים להיות מקורר במחירים בסדר של 1,000,000 מעלות צלזיוס לשנייה (כלומר, שיעור צינון קריטי) כדי למנוע היווצרות קרח מעל טמפרטורת המעבר זכוכית8 . תוספת של CPAs יכול להקטין את שיעור הקירור הקריטי ולהגדיל את טמפרטורת המעבר זכוכית של פתרונות מימית9. עם זאת, גם עם ריכוזי CPA גבוהה (למשל, 40% v/v dmso או גבוה יותר) שיעורי צינון מהיר בכל זאתנדרשים עבור ויטריפיקציהמוצלחת 8,9.
תעריפי הצינון הנדרשים וריכוזי רואי חשבון גבוהים גורמים לשני החסרונות העיקריים של ויטריפיקציה. ראשית, כדי לאפשר קירור מהיר, הדגימות חייב להיות מסה תרמית נמוכה. שנית, כדי להגיע לריכוזי רואי חשבון גבוהים תוך הימנעות מפציעה אוסמוטי, CPAs חייב להיות לאט הציג ומוקצב מלא בין התאים הפנים והחילוץ6. זה מגביר את זמן החשיפה של תאים CPAs רעילים. יחד, הדבר גורם לויטריפיקציה תהליך מסורבל המוגבל למספר דוגמאות קטנות (מיקרוליטר) בכל פעם. מויטריפיקציה Droplet הוצע כפתרון פוטנציאלי להגבלות אלה. על-ידי חשיפת מזערית התאים טיפות (nanoliters) כדי חנקן נוזלי שיעור הקירור הוא גדל באופן משמעותי, אשר כתוצאה מכך מאפשר הפחתה ניכרת בריכוז רואי החשבון10,11,12 ,13,14. למרות שניתן להשתמש בו זמנית במספר רב של החרירים בתדר גבוה, גודל ה-droplet הקטן ביותר מגביל את התפוקה למיקרו-ליטר לדקה10, המונע הויטריפיקציה יעילה של תא גדול אמצעי אחסון עם קצבי עיבוד גניטודות גבוהים יותר לפי סדר מיליליטר לדקה.
לאחרונה הוכח כי אלה מגבלות הטבועה של ויטריפיקציה ניתן להתגבר על ידי droplet ויטריפיקציה15בצובר. זו שיטה הרומן ממנף התייבשות אוסמוטי מהירה כדי לרכז את הריכוז של רואי חשבון תאיים של 7.5% v/v אתילן גליקול ו DMSO מיד לפני ויטריפיקציה, ביטול הצורך של היכולת המלאה של ריכוזי רואי חשבון רעילים. התייבשות תאית מבוצעת במכשיר פלואידיג באמצעות חשיפה קצרה של hepatocytes לריכוז הרואי חשבון גבוהה. למרות חשיפה זו גורמת התייבשות אוסמוטי מהירה, זה קצר מדי עבור ריכוז CPA גבוה כדי לפזר לתוך התאים. מיד לאחר התייבשות, התאים נטענים טיפות כי הם באופן ישיר בחנקן נוזלי. שיטה זו מבטלת את הצורך של ספיגת מלאה תאיים של ריכוזי CPA גבוהים בעוד ריכוז רואי חשבון גבוהה מאפשר ויטריפיקציה של טיפות בגודל גדול, וכתוצאה מכך נפח תפוקה גבוהה עם רעילות CPA מינימלית.
מויטריפיקציה Droplet משפרת את הכדאיות הישירה והארוכת-טווח לאחר שימור, כמו גם מורפולוגיה ותפקוד מטבולי של החולדה הראשית לעומת הקריוגנית קלאסית בהקפאה איטית15. כתב יד זה מספק את הפרטים מתודולוגיים עבור droplet גורפת ויטריפיקציה של החולדה הראשית העכבר.

<table><tbody><tr><td>מזרקים חד פעמיים BD 3 מ"ל עם טיפים Luer-Lok</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>CLS1000-250</td><td></td></tr><tr><td>Belzer UW פתרון אחסון קר</td><td>גשר לחיים</td><td>BUW-001</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer נקבה לואר ל-1/16 אינץ' דוקרני צינורות קשיחים למחצה בפרופיל נמוך, PP</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>מיכל סטראג' קריוגנטי / תרשים קריוטנק</td><td>תעשיות</td><td>MVE 800</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, אבקה, גלוקוז גבוה, פירובט</td><td>Life Technologies</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>107-21-1</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td> <td>ארוכים במיוחדפישר סיינטיפיק</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>פישרברנד צינורות צנטריפוגה מפלסטיק במהירות גבוהה יותר - סגירת מעגל עליונה שטוחה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>חוט דיג</td><td>Stren</td><td>SOFS4-15</td><td></td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>איירגז</td><td>7727-37-9</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S צינורות סיליקון מרפא פלטינה, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לערבב, לשימוש עם 3HPW1</td><td>Grainger</td><td>3WRL7</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene פוליפרופילן משפך אבקת</td><td>ThermoFisher</td><td>4252-0100</td><td></td></tr><tr><td>מחט 20 ga</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M - סרט גמיש</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>מרית</td><td>קול-פארמר</td><td>EW-06369-18</td><td>&nbsp; מסנן סטרילי </td></tr><tr><td>Steriflip</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז (גבישי/מוסמך ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>מיכל חנקן נוזלי ספסל תרמו-בקבוק</td><td>ThermoFisher</td><td>2122</td><td></td></tr></tbody></table>

בצובר droplet ויטריפיקציה עבור שימור ההירופציט הראשי

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

ויטריפיקציה היא חלופה מבטיחה ללא קרח להקפאה קלאסית (בקירוב 1 ° c/דקות) הקפאה של דגימות ביולוגיות. ויטריפיקציה דורש שיעורי צינון מהיר במיוחד כדי להשיג מעבר של מים לשלב הזכוכית תוך הימנעות היווצרות קרח מזיק. למרות שטרום הדגירה עם סוכנים ביולוגיים (CPA) יכול להפחית את שיעור הצינון הקריטי של דגימות ביולוגיות, ריכוזים גבוהים בדרך כלל נדרשים כדי לאפשר הקפאת קרח חינם על ידי ויטריפיקציה. כתוצאה מכך, ויטריפיקציה מושפע מרעילות CPA ומוגבלת לדגימות קטנות שניתן לקרר במהירות. לאחרונה הפגינו כי אלה מגבלות הטבועה ניתן להתגבר על ידי droplet ויטריפיקציה בצובר. באמצעות שיטה זו הרומן, התאים הם הראשונים לקדם מחדש עם ריכוז הרואה חשבון נמוך תאיים. מינוף התייבשות אוסמוטי מהירה, ה-CPA תאיים מרוכז ישירות לקראת ויטריפיקציה, ללא צורך באופן מלא ריכוזי רואי חשבון רעילים. התייבשות הסלולר מבוצעת במכשיר פלואידיג ומשולב עם הדור תפוקה גבוהה רציפה של טיפות בגודל גדול כי הם התמסדים בחנקן נוזלי. שיטת הקפאת הקרח ללא הקפאה עם רעילות CPA מינימלית מתאימה לכמויות התאים הגדולות והתוצאות בכדאיות המוגברת של המעי האטי ובתפקוד המטבולית לעומת הקריוגנית איטית ומקפיאה. כתב יד זה מתאר את השיטות עבור droplet בצובר מוצלחת ויטריפיקציה בפירוט.

בידוד הראשי הראשוני מבודדים מחמישה כבדי חולדה שונים שימשו להשוואת השוואה ישירה של droplet בצובר ויטריפיקציה כדי הקפאה קלאסית באמצעות פרוטוקולי ההקפאה הראשונה שדווחו בספרות4, 5. בקיצור, hepatocytes הושעו ב UW שיושלם עם BSA (2.2 mg/mL), גלוקוז (333 mM), ו DMSO (10% v/v) קפוא באמצעות מקפיא קצב מבוקר. לאחר האחסון ב-196 ° c, הופלו הדגימות באמבט מים חמים. לאחר כל הקרח נמס, DMSO היה מדולל ישירות בעוד ריכוז הגלוקוז הופחת בהדרגה במהלך שלבים מרובים כדי להפחית את הפציעה או...

כתב יד זה מתאר שיטת הקפאה נטולת קרח עבור כמויות גדולות של החולדות החצציטים לפיה התאים הראשוניים הם טרום מודבטים עם סוכנים הקפאה בריכוז נמוך והוא מוקשה בטיפות גדולות.

בצובר Droplet ויטריפיקציה עבור שימור ההירופציט הראשי

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Vitrification מטופל בדרך כלל על ידי רעילות של סוכני cryoprotective. והוכנס מחדש לדגימות קטנות שניתן לקרר במהירות. פרוטוקול זה מאפשר ויטרציה של כמויות תאים גדולות תוך שימוש בריכוז ת"א נמוך במהלך הדגירה מראש.באמצעות התייבשות אוסמוטית מהירה, רו"ח בין מרתפים נמוך מרוכז בהתקן הנוזלים ישירות לפני vitrification. זה מבטל את הצורך של שקיבוע מלא ריכוזי רו"ח רעילים. סגול טיפה בתפזורת עשוי לספק hepatocytes קיימא ופעילים מטבולית לשימוש השתלת hepatocytes והתקני כבד ביו מלאכותי אשר שלנו כרגע הפריע על ידי תוצאות לקויות לאחר cryopreservation.שיטה זו עשויה להיות מותאמת vitrification של סוגי תאים אחרים כי צריך להיות cryo נשמר בכמויות גדולות;כגון מוצרי דם או תאי גזע בין היתר. כדי להתחיל, להפוך את פתרון vitrification 1 על ידי הוספת 40 מיליגרם של BSA ל 17.0 מיליליטר של פתרון אוניברסיטת ויסקונסין. השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את הפתרון ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס.הפוך את פתרון vitrification 2 כמתואר בפרוטוקול. וסטרילי לסנן אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. לטעון 3.5 מיליליטר של פתרון V2 מסונן סטרילי במזרק שלושה מיליליטר ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס.כדי להכין את מנגנון vitrification טיפה בתפזורת, הראשון, לחתוך לאורך צד אחד של המחטים ערבוב שרוול אפור החיצוני. לכופף את השרוול פתוח כדי להסיר אותו מן המחט ערבוב. לאחר מכן, לחתוך את המחט ערבוב לאורך של 20 מילימטרים ולהכניס את שקע החיתוך שלה לתוך מחט הזרקת מד 20.החלק שני מקטעי צינורות סיליקון 25 מילימטר מעל הבקתות של מחט הערבוב. ולהבטיח את עמדתם עם דבק. סטריליזציה של הרכבה זו על-ידי הפעלה אוטומטית.ממלאים בקבוק דיואר סטרילי בחנקן נוזלי. ולעקר את החוץ עם isopropanol לפני הצבתו במכסה המנוע סטרילי לתרבות תא זרימה למינר. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כמו חנקן נוזלי יכול לגרום לכוויות חמורות.כדי ליצור את התקן איסוף טיפה להכניס משפך עם קוטר חיצוני זהה לקוטר הפנימי של דיואר, לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. באמצעות מטחות גדולות, לחץ לאט על התקן איסוף טיפות למטה בחנקן הנוזלי במצבו האנכי הסופי. ודא כי הצינור חרוט נשען במיקום אנכי בחלק התחתון של דיואר.ומפלס החנקן הנוזלי נמוך בסנטימטר אחד מקצה המשפך. כדי להרכיב משאבת מזרק במיקום אנכי על הקיר של מכסה המנוע של תרבות התא, לקשור חוט מכפות הרגליים של משאבת המזרק לברגים בולטים מקיר מכסה המנוע של תרבות התא. לאחר מכן, מניחים את החנקן הנוזלי Dewar עם מכשיר איסוף טיפות מתחת למשאבת המזרק המותקנת אנכית.לאחר קבלת hepatocytes עכברוש מבודד טרי, לספור את ריכוז המניות על ידי הדרה כחולה תלת פאן. ולהעביר 40 מיליון hepatocytes קיימא לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה hepatocytes ב 50 פעמים G במשך חמש דקות ללא הפסקה.שאף את העל-טבעי. להשעות מחדש את hepatocytes ב 3.4 מיליליטר של פתרון V1. ותידגר על קרח במשך שלוש דקות.לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של DMSO ו-150 מיקרוליטרים של EG;ערבבו בעדינות ודגירה על הקרח שוב במשך שלוש דקות. הוסיפו 150 מיקרוליטרים של DMSO ו-150 מיקרוליטרים של EG להפטוציטים שוב והתערבבו בעדינות. לטעון 3.5 מיליליטר של תערובת זו במזרק שלושה מיליליטר.הכנס את המזרק עם hepatocytes דגירה מראש ואת המזרק עם פתרון V2 על מתאם משאבת המזרק. חבר שני מתאמי צינור-ברב לולר לוק נקבה למזרקים. ולהחליק את צינורות הסיליקון של מכלול מחט הערבוב מעל אביזרי העקיצה.שים את כל ההרכבה הזאת במשאבת המזרק. שלוש דקות לאחר המהדורה האחרונה של DMSO ו- EG להפטוציטים, התחל את המשאבה בשני מיליליטר לדקה. אחרי כל hepatocytes נוספו חנקן נוזלי לעצור את המשאבה.באמצעות מחט 20 מד, לנקב 10 חורים קטנים במכסה של צינור חרוט 50 מיליליטר. ולעטוף את החלק החיצוני של המכסה עם סרט גמיש, יצירת שסתום שיאפשר את הבריחה של אידוי חנקן נוזלי שמאלי. כדי לאסוף את טיפות hepatocyte vitrified, תחילה להסיר את המשפך מן דיואר עם חנקן נוזלי.לאחר מכן, עם מטחנות ארוכות, להוציא את הצינור חרוט המכיל את טיפות מן החנקן הנוזלי, ולאט לאט לשפוך את החנקן הנוזלי עודף מן הצינור חרוט. סגור את הצינור החרוטי עם המכסה המנוקב ולאחר מכן למקם ישירות את הצינור חרוט סגור עם טיפות hepatocyte סגול בחזרה Dewar עם חנקן נוזלי. לבסוף, להעביר את הצינור חרוט מן החנקן הנוזלי לתוך cryotank חנקן נוזלי.לאחר יצירת פתרון המלחמה מחדש עם מדיה תרבות סוכרוז ו- DMEM hepatocyte, השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר כדי לסנן אותו סטרילי. ואז לחמם אותו ל 37 מעלות צלזיוס. כדי לחזור hepatocytes להסיר את הצינור חרוט עם hepatocytes vitrified מן cryotank ולהעביר אותו חנקן נוזלי Dewar למכסה המנוע תת תרבות.משחררים קלות את הכובע ומ מניחים את הצינור הקדום בחזרה בחנקן הנוזלי. עובדים במהירות, מוסיפים את כל טיפות hepatocyte סגולים לתוך מקור ריק, ולאחר מכן להוסיף במהירות 100 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס חם חיסון פתרון תוך ערבוב במשך 10 שניות. כאשר טיפות מוסרים הקפאה תוך-est חנקן נוזלי מתרחשת בתוך שניות אם טיפות לא מחדש במהירות.לכן, זה קריטי להוסיף ישירות את התקשורת המלחמה מחדש טיפות תוך ערבוב. חלק את פתרון המלחמה מחדש עם hepatocytes לשני צינורות חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות במשך שתי דקות ב 100 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס ללא הפסקה.שאף את העל-טבעיים להשאיר נפח כולל של 12.5 מיליליטר באמצעות סימן סיום הלימודים של הצינור כהפניה. כדי לדלל את פתרון המלחמה מחדש ל 50%להוסיף 12.5 מיליליטר של קרח קר DMEM לכל צינור חרוט. להשעות מחדש ותידגר על קרח למשך שלוש דקות.כדי לדלל את פתרון המלחמה מחדש ל-25%להוסיף 25 מיליליטר של DMEM קר כקרח לכל צינור חרוט. לאחר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 50 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס ללא הפסקה, שאפו את העל-טבעי והשעו מחדש את ההפטוציטים בשני מיליליטר של מדיום התרבות הרצוי. כאשר נמדד על ידי בדיקות אי הכללה כחולות תלת פאן, אשר קובע שלמות הממברנה, סגולות טיפה בתפזורת הביא הכדאיות hepatocyte לאחר שימור ישיר של 79%זה היה גבוה באופן משמעותי מאשר 68%הכדאיות לאחר cryopreservation אופטימיזציה קלאסית.התשואה של ויטריפיקציה טיפה בתפזורת היה 56%אשר היה 10% גבוה יותר ועקבי יותר מאשר cryopreservation קלאסי. באמצעות מטבוליזם presto-דבק assay במכללה לטווח ארוך ותרבויות כריך, פעילות מטבולית ב hepatocytes נמדד להיות גבוה באופן משמעותי לאחר סגול טיפה בתפזורת אז לאחר cryopreservation קלאסי. סינתזת אלבומין, כמו הפרמטר הנפוץ ביותר של פונקציה סינתטית של hepatocytes, היה גדול כמעט פי שניים לאחר סגול טיפה בתפזורת, ולאחר מכן לאחר cryopreservation קלאסי.ייצור אוריאה שימש למדידת פונקציית ניקוי רעלים hepatocyte בתרבות שבוע אחד. ב hepatocytes טיפה בתפזורת סגולה, ייצור אוריאה היה גבוה משמעותית מזה ב hepatocytes cryopreserve קלאסי. לקבלת תוצאות עקביות לאחר vitrification טיפה בתפזורת חשוב בדיוק לעקוב אחר התזמון במהלך הדגירה מראש של רואי ה-IP ו לחנוך מחדש כמפורט בפרוטוקול זה.לאחר המלחמה מחדש טיפות hepatocyte סגול אתה תהיה בסופו של דבר עם השעיה גודל טוב יותר אשר ולכן ניתן להשתמש בכל אותן דרכים כאילו הם היו מבודדים טריים. כשיטה משופרת לשימור, סגול טיפה בתפזורת עשוי להגדיל את הזמינות pri-ma למחקר ויישומים קליניים.

bulk-droplet-vitrification-for-primary-hepatocyte-preservation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מתוארת טכניקה לבידוד הפטוציטים אנושיים ותאי כבד לא פרנכימליים מאותו תורם. סוגי תאי הכבד השונים בונים את הבסיס למודלים תפקודיים של כבד והנדסת רקמות. שיטה חדשה זו שואפת לבודד תאי כבד בתפוקה גבוהה ובכדאיות.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג הכדאיות גבוהה, תשואה גבוהה של hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal של הכבד. זו מושגת על ידי פרפוזיה הכבד עם פתרון collagenase IV סוג דרך וריד שער הכבד, ואחריו דיפרנציאלית צנטריפוגה כדי להשיג hepatocytes ותאי אנדותל sinusoidal.

טיהור של Hepatocytes ותאי אנדותל Sinusoidal מן הכבד העכבר זלוף

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של העכבר הראשי בריא ופונקציונליים hepatocytes פרוטוקול. הוראות לגילוי סינתזה של חלבון nascent הכבד על ידי המצע תיוג לא רדיואקטיבי נמסרו כדי לעזור להבין את המנגנונים שבבסיס סינתזת החלבון בהקשר של הומאוסטזיס אנרגיה-מטבוליזם בכבד.

בידוד של העכבר הראשי Hepatocytes לניתוח סינתזת חלבון Nascent בשיטה תיוג L שאינו רדיואקטיבי-azidohomoalanine

המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק מדריך צעד אחר צעד כדי לבצע ניסויים זיהום "כבד-על-שבב" תלת-ממדי עם הנגיף הפטיטיס B.

"כבד-על-שבב" תרבויות של ראשי Hepatocytes ותאים Kupffer על זיהום בנגיף הפטיטיס B

מוצג כאן הוא פרוטוקול לבידוד של העכבר hepatocytes מתוך כבדי העכבר למבוגרים באמצעות שונה קולגן הטכניקה הפרו הפרזיה. גם תיאר הוא התרבות ארוכת טווח של hepatocytes בקביעת כריך קולגן תלת-ממד, כמו גם immunolabeling של מרכיבים ציטושלד לחקר היווצרות המרה והתגובה שלה לטיפול.

בידוד וכריך קולגן 3D תרבות של העכבר הראשי Hepatocytes כדי ללמוד את התפקיד של שלד ציטוזה היווצרות של המרה בתוך מחוץ לגופית

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בצנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה בתוספת ניטור בזמן אמת, ומערכת אזעקה להליך זלוף קולגןאז דו-שלבי כדי לשפר את העקביות בכדאיות, בתפוקה ובפונקציונליות של הפטוציטים של חולדה ראשונית מבודדת.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

חמצון β חומצות שומן הוא מסלול מטבולי חיוני האחראי על הפקת אנרגיה בסוגי תאים רבים ושונים, כולל הפטוציטים. כאן אנו מתארים שיטה למדידת חמצון-β חומצות שומן בהפטוציטים ראשוניים שזה עתה בודדו באמצעות 14חומצה פלמיטית המסומנת כ-C.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

פרוטוקול זה מתאר טכניקות לבידוד הפטוציטים ראשוניים של עכברים מהכבד ואלקטרופורציה של CRISPR-Cas9 כריבונוקלאופרוטאינים ו-mRNA כדי לשבש גן מטרה טיפולי הקשור למחלה מטבולית תורשתית של הכבד. השיטות המתוארות מביאות לכדאיות גבוהה ולרמות גבוהות של שינוי גנים לאחר אלקטרופורציה.

אספקה בתיווך אלקטרופורציה של ריבונוקלאופרוטאינים Cas9 ו-mRNA לתוך הפטוציטים של עכברים ראשוניים שבודדו זה עתה

הפטוציטים עמוסי שומנים טבועים בהתחדשות הכבד, אך בדרך כלל הולכים לאיבוד עם צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאים אופטימלי השומר על הפטוציטים סטאטוטיים, ומניב אוכלוסיות מייצגות של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים.

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

פרוטוקול זה מציג טכניקת זילוח כבד אופטימלית של collagenase בשני שלבים במודל חולדה ומראה את השימוש בהפטוציטים מבודדים עבור תרבית ארוכת טווח במבחנה של אורגנואידים תלת-ממדיים.

זילוח כבד חולדה ובידוד הפטוציטים ראשוני: הליך ישן חיוני לתרבית אורגנואידים תלת-ממדית חדשנית

למד שיטת ויטריפיקציה בטיפות גדולות לשימור כמות גדולה של הפטוציטים ראשוניים מעכברים. שיטה זו משתמשת בריכוזים נמוכים של סוכני הגנה מקפיאים ומייעלת את התוצאות להשתלת תאי כבד ויישומים קליניים.

בצובר Droplet ויטריפיקציה עבור שימור ההירופציט הראשי

גלה סרטונים נוספים