הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

תכשירי משטח שרוך מאפשרים הדמיה של כל העדשה של האיבר של קורטי באמצעות אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקאלית. זה שימש באופן נרחב לחקירה של פתולוגיות cochlear ספציפיות של עניין. אנו משנים את שיטת המיקרו-דיסקטוריה של השבב.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הדבקות של חתיכת אפיתל שבך ל 10 מילימטר כיסויים עגולים עבור הליך immunolabeling תוך הימנעות אובדן רקמות במהלך שלבי כביסה מרובים. בנוסף פתולוגיות cochlear, הכנת משטח שרוך יכול גם להיות מנוצל עבור ביטוי הערכה והתחדשות תאי השיער. מיומנויות מיקרוסקופ בסיסיות נדרשות עבור טכניקה זו והדגמה חזותית של השיטה יכולה לעזור להבטיח שכל שלב מבוצע כראוי.

הדגמת ההליך תהיה צ'יאוג'ון פאנג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. עבור עקירת עצם זמנית, מיד לאחר המוות למשוך את העור הקדמי כדי לחשוף את עצם הגולגולת ולהשתמש מספריים לחתוך את העצם מההיבט האחורי קדימה לאורך הקו המרכזי של הגולגולת. השתמש מדפים כדי להסיר את רקמת המוח לפני השימוש באגודל ובאצבע המורה כדי להסיר באופן ידני את עצמות הזמן מעכברים שלושה חודשים של גיל ומעלה.

מניחים את העצמות לתוך צלחת פטרי בקוטר 30 מ"מ המכילה קרח טרי קר 4% PFA ו PBS תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהסיר את stapes מהחלון הסגלגל. לנקב את קרום החלון העגול עם מלקחים מספר חמש ולהשתמש מחט מד 27 מחובר מזרק מיליליטר אחד המכיל טרי 4% PFA לעשות חור קטן לתוך שיאו של cochlea. בעדינות ולאט לאט לעיין ב cochlea עם פתרון תיקון דרך החלונות העגולים והאליפטיים עד הפתרון נשטף מתוך החור הקטן על apex.

לאחר מכן להעביר עד שני cochleae מנוון לתוך בקבוקונים בודדים 20 מיליליטר נצנוץ המכיל 10 מיליליטר של 4% PFA לכל בקבוקון בעדינות להתסיס את הדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ואחריו אחסון לילה בארבע מעלות צלזיוס על מסובב. למחרת בבוקר, לשטוף את cochleae עם שלוש שטיפות חמש דקות עם PBS טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים 20 מיליליטר של 4% EDTA לכל בקבוקון ומסובבים את הדגימות במשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה.

בסוף הדגירה, לגעת בחלק שיוויץ גרמי של כל cochlea עם מדפים כדי להעריך את הגמישות של הדגימות. אם העצמות אלסטיות ולא מוצקות, שבלול השיניים נודק. החלף את ה- EDTA עבור כל דגימה ב- PBS טרי.

עבור microdissection של אפיתל שרוך, לתפוס את החלק שיוויץ של עצם הזמן עם מטלפים ולהשתמש אזמל לחתוך את הסיבוב apical בזווית של 45 מעלות. חותכים אנכית לאורך הקו הקלוש שבין החלון העגול לחלון הסגלגל כדי להפריד את הקלאה מחלק שיוויון ומכווןים את חלק הלול עם הסיבוב הבסיסי לכיוון החלק התחתון והאמצע פונה לכיוון החלק העליון של צלחת פטרי. מעמדה זו, חותכים את הקפסולה הגרמי ואת הקיר רוחבי של האמצעי לפנות לכיוון הסוף שממנו החלק apical הוסר ולהמשיך לחתוך כדי להפריד לחלוטין את החלק האמצעי מאזורי בסיס וו.

הצבת החלק הבסיסי וו עם האתר קרום בזילאר מכוון לכיוון החלק התחתון של המנה, לחתוך אנכית את medialis את אזור הוו כדי להסיר את medialis לחתוך את אזורי בסיס וו להפריד את חלק הוו. כדי למנוע עיוות של הרקמה, לחתוך את medialis את אזור הוו לפני ההפרדה של אזור סיבוב בסיס וו. חותכים את החלקים הגדולים יחסית של כמוסה גרמית רקמת קיר צדדית של הפנה האמצעי ומחזיק את הקיר הצדדי עם מטלטולים כדי ליישר את הקפסולה גרמית ואת הקיר הצדדי עם החלק התחתון של צלחת פטרי, לחתוך את הרקמות האלה מהצד קרום בזיליקום.

לאחר מכן, משטחים את הדגימה כדי לכוון את צד פני השטח של תא השיער החושי למעלה ולקצץ את שאר הקפסולה הגרמי והקיר הצדדי. לאחר מכן השתמש במקלות כדי להסיר את קרום tectorial כדי להפריד לחלוטין את האזור האמצעי ולהסיר את הקפסולה גרמית, רקמת קיר מצד שני, ואזורים tectorial של פניות הנותרים כפי שהודגם רק. כאשר כל הסיבובים cochlear נותאו, להפיץ 0.5 microliters של תאים ורקמות דבק על המרכז של סיבוב אחד 10 מילימטר מכסה ולאפשר דבק להתייבש במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר.

מניחים את הכיסויים המיובשים בצלחת פטרי ומדביקים את כל ארבעת החלקים של כל דגימת אפיתל חושית על כיסוי אחד. לאחר מכן השתמש במטסים כדי לתפוס קצה אחד של כל כיסוי כדי להעביר את הדגימות לתוך בארות בודדות של צלחת תרבות תא ארבע בארות עבור immunolabeling. לקבלת immunolabeling של הכנות סינפסה שרוך פני השטח, לשטוף כל אפיתל חושי שלוש פעמים במשך חמש דקות PBS טרי לכל לשטוף, ואחריו הטיפול של כל מדגם עם שני מיליליטר של 2% לא יוני פעילי שטח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב.

בסוף הדגירה, שאפו את התמיסה האקטיבית מכל באר וחסמו כל כריכה לא ספציפית עם 100 מיקרוליטרים של פתרון חסימה לאורך שעה על המסובב עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה חסימה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם תחת תסיסה עדינה לפני תיוג כל אפיתל עם 100 microliters של הנוגדנים העיקריים של עניין במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. למחרת, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS טרי תסיסה עדינה לכל לשטוף ולתייג את הדגימות עם 100 microliters של נוגדנים משניים המתאימים של עניין במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.

בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם שלוש שטיפות חמש דקות PBS טרי לכל לשטוף לפני הנחת כל כיסוי על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות עם דגימות פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות שמונה מיקרוליטרים של מדיום הרכבה מתאים למרכז כל כיסוי ולהשתמש במדפים כדי להרכיב כיסוי נוסף של 10 מילימטרים על כל דגימה. לאחר מכן לאטום את הצדדים של כל כריך coverslip עם לק ברור, למקם את הדגימות לתוך תיקיית שקופיות קרטון, ולאחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס.

למרות הניתוח של שבלול עכבר בוגר להכנת פני השטח אינו פשוט, חוקרים חדשים בטכניקה צריכים להיות מסוגלים ללמוד את השיטה לאחר תרגול עם 10 עד 15 אוזניים. Immunolabeling של הכנות פני השטח של עכברים CBAJ לא מטופלים 10-12 שבועות עם CTBP2 ו GluA2 מדגים כי הן סרטים presynaptic וטרמינלים postsynaptic בהתאמה ממוקמים מתחת הגרעינים תא השיער הפנימי והם צירוף המציין סינפסות פונקציונליות. Immunolabeling עבור מיוסין 7A ונגד עם פאלודין ו DAPI מגלה את נוכחותם של תאי שיער חושיים כולל תאי השיער החיצוניים ותאי השיער הפנימיים ואת הגרעינים שלהם.

Immunolabeling עבור myosin 7A ונגד הגנה עם פאלודין מראה שום הבדלים immunoreactivity או אחידות עם או בלי שימוש דבק תאים ורקמות. בנוסף, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים של תכשירי פני השטח מעכברים שחורים שחורים C57 בני שישה עד שמונה שבועות מדגמים סטריאוסיליה מאורגנת היטב בצורת V של תאי שיער החיצוניים בשלוש שורות של המדגם. זכור למלא את העצם בפתרון מתקן בעדינות ולאט לאט דרך החלונות העגולים והאליפטיים עד שהפתרון יישטף מהחור הקטן ב- apex.

לפני הפרדת אזור הוו מפניית הבזל, טפל בחיתוך המדיאליס מאזור הוו כדי להקל על הסרת המדיאליס.