Name: הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: למד הכנה לפני שבלול בעכברים מבוגרים לצורך ויזואליזציה של אברון קורטי באמצעות אימונוהיסטוכימיה. שיטה זו משפרת הידבקות רקמות ומונעת אובדן דגימות במהלך השטיפות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט המחקר תיאר היה נתמך על ידי גרנט R01 DC009222 מן המכון הלאומי על חירשות והפרעות תקשורת אחרות, המכון הלאומי לבריאות. עבודה זו נערכה בבניין WR ב MUSC בחלל משופץ נתמך על ידי גרנט C06 RR014516. בעלי חיים היו שוכנו במתקני בעלי חיים MUSC, הנתמכת על ידי מענק C06 RR015455 מתוכנית מחקר של אקסטרקיר של המרכז הלאומי למשאבי מחקר. המחברים מודים לד ר ג'צ'ן שכטר על הערותיו היקרות ועל הגהה של כתב היד.

כל פרוטוקולי המחקר מעורבים גברים מבוגרים CBA/J עכברים בגילאי 10 – 12 שבועות ו C57BL/6J עכברים בגילאי 6 – 8 שבועות אושרו על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (MUSC). טיפול בבעלי חיים היה תחת פיקוחו של החטיבה למשאבי בעלי חיים במעבדה ב-MUSC.
הערה: עבור ההליכים המוצגים להלן, עכברים מורדם עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) באמצעות זריקות הצפק. לאחר שהחיה כבר לא מגיבה לגירויים כואבים, כגון צביטה בבוהן.
1. הפקת עצמות הרקה
<ol><li>ערוף את ראשו של העכבר מיד לאחר המוות עם מספריים כירורגית (17 ס מ ארוך) וחותכים את עצם הגולגולת עם מספריים מן ההיבט האחורי קדימה לאורך קו המרכז של הגולגולת לאחר חשיפת עצם הגולגולת על ידי משיכת העור בהמתנה.</li>
	<li>הסר את רקמת המוח באמצעות מלקחיים ולהסיר ידנית את עצמות הזמן עם האגודל ואת האצבע המדד עבור עכברים שלושה חודשים של גיל או מבוגר. השתמש במספריים כירורגיים קטנים (11 ס מ ארוכים) כדי לחתוך את עצם הרקה של עכברים צעירים יותר מאשר בן שלושה חודשים.</li>
	<li>לשים את עצם הרקה לתוך צלחת פטרי (30 מ"מ קוטר) המכיל קרח קר טרי 4% פאראפורמלדהיד (בחצי הקרחון) פתרון מומס פוספט מואגור פוספטים (PBS), pH 7.4. הערה: הכינו את הפתרון הבולייתי טרי 4% והתאימו את ה-pH ל-7.4 בדיוק לפני תיקון עצמות הזמן, מכיוון שאיזון החומציות הבלתי-מכוון של הפתרון ברמה הגבוהה ביותר יקטין את איכות האימונוולטילינג.</li>
</ol>2. קיבוע והפרזיה
<ol><li>הסר את הסטייבס מהחלון הסגלגל ונקב את קרום החלון העגול עם גודל #5 מלקחיים. תחת מיקרוסקופ לחיתוך סטריאו לעשות חור קטן לתוך קודקוד של שבלול באמצעות מחט של 27 גרם מחובר מזרק 1 mL.</li>
	<li>בעדינות ובאיטיות מסנן את שבלול עם 4% הפתרון הכאואלי דרך החלונות העגולים והסגלגל עד הפתרון שוטף מהחור הקטן בקודקוד. העבר את הכלאה (כנימת שבלול אחת או שתיים לכל בקבוקון) עד 20 מ ל בנפח המכיל 10 מ ל של 4% הפתרון האנגלי.</li>
	<li>בעדינות מתפרעים בבקבוקונים בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 h ולהשאיר לילה במקרר (4 ° c) על מסובבי. הערה: הזמן של קיבעון יכול להיות מותאם בהתאם לנוגדן המשמש. לדוגמה, הגבלת הקיבעון ל-1.5 h תאפשר לחיסולולילינג מוצלחים של מסופי הפוסט-סינפטית באמצעות נוגדן GluA 2.</li>
</ol>3. הסרת עצם הרקה
<ol><li>הסר את הפתרון בכיוון הדור השני ושטוף את הכנימת עם ה-PBS החדשה במשך 5 דקות לכל אחד.</li>
	<li>הוסיפו 20 מ ל של 4% מחומצת החומץ ניתרן (edta) תמיסת מלח (pH 7.4) לבקבוקונים ולשמור במקרר במשך 48 עד 72 שעות על מסובבי עם עצבנות עדינה. שנה את פתרון ה-EDTA מדי יום עד שהקוצ'ליק מתפורר. בדוק אם שבלול הינם מוגרמות על ידי נגיעה בחלק שיווי המידה הגרמי עם מלקחיים כדי להעריך גמישות או פשוט לחתוך חתיכה קטנה מהקצה של החלק של שיווי המידה. אם חיתוך כזה מביא ליצירה מרוסקת, השבלול אינו מדקע. הערה: פתרון ה-EDTA עלול לשבש את הפעולה החיסונית של נוגדנים ראשוניים בהתאם לריכוז הפתרון. הכן 4% EDTA ב-PBS ולהתאים את ה-pH ל 7.4. לצורך הדקיפיקציה עקבית של עצמות הזמן, פתרון EDTA טרי משמש.</li>
	<li>לשנות את הפתרון ל-PBS לניתוח מיקרו לאחר השלמת הdecalcification. הערה: אם הקוצ'ליק אינו מספיק מסווג, לא ניתן לבצע את החיתוך של הקוצ'ליק.</li>
</ol>4. מיקרוחיתוך של אפיתל השבלול
הערה: לאחר decalcification הוא השלם, מיקרוניתוח של אפיתל שבלול עבור immunolabeling צריך להתבצע בהקדם האפשרי. בצלוחית נקייה של 30 מ"מ המכילה את ה-PBS, האוזן הפנימית מכוונת באופן הבא: בהתייחסות לראש צלחת פטרי (מכסה) ולמטה, הסיבוב השבלול וחלונות הסגלגל פונים לפסגה. בהתייחסות לניתוח, החלק השבלול מכוון לכיוון החזית (הרחק מהנתח) והחלק האחורי של שיווי הבמה לעבר העורף (ליד מבתר). הפעולות הבאות מתארות את השלבים בפירוט.
<ol><li>להחזיק את החלק באמצע הפרוזדור של עצם הרקה עם מלקחיים לחתוך את הפנייה פסגה עם אזמל בזווית 45 ° כפי שמצוין על ידי הקו האדום (איור 1א).</li>
	<li>חותכים אנכית לאורך הקו הקלוש שבין החלון העגול לחלון הסגלגל, כפי שמצוין בקו האדום (איור 1ב) כדי להפריד בין הקולאה לבין החלק של הפרוזדור (איור 1ג). הערה: זה החלק שבלול מכיל את האמצע, בסיס, חלקים הוק של האפיתל.</li>
	<li>מניחים את החלק של שבלול עם לפנות בסיס לכיוון התחתון ולהפוך את האמצע לכיוון העליון של צלחת פטרי וחותכים את הקפסולה הגרמית ואת הקיר הצדדי של הסיבוב האמצעי לקראת הסוף שממנו הוסר הסעיף העליון, כפי שמצוין על ידי הקו האדום (Figu re 1, e).</li>
	<li>המשך חיתוך כדי להפריד לחלוטין את החלק האמצעי מאזורי הבסיס והקרס (איור 1f, g). הערה: אזור הקרס של שבלול הוא סוף האפיתל שבלול המתאים רגישות לטונים 48 kHz ומעלה בעכברים.</li>
	<li>לשים את החלק הבסיס והקרס עם האתר קרום בזיאר מונחה לכיוון החלק התחתון של המנה ולחתוך אנכית מודיולוס את אזור הוו כדי להסיר את המודולוס כפי שמצוין על ידי הקו האדום האנכי (איור 1g). הערה: מודיולוס הוא הציר המרכזי בצורת חרוט של השבלול המורכב של עצם ספוגית ועצב שבלול, כמו גם גנגליון ספירלה. ייתכן שעדיף לבצע את החיתוך עם מספריים.</li>
	<li>חותכים את אזורי הבסיס וההוק כפי שהקו האדום השני מציין באיור 1g כדי להפריד בין החלקים (איור 1h). הערה: שבלול הופרד כעת לתוך apical, באמצע, בסיס, ומנות וו. השלבים הבאים יהיו החיתוך הסופי של כל אחד מתורות הפרט, באמצעות הפנייה האמצעית כדוגמה.</li>
	<li>חותכים את החלקים הגדולים יחסית של כמוסה גרמית ואת רקמת הקיר לרוחב של התור האמצעי כפי שמצוין על ידי הקו האדום (איור 1i). הערה: הקיר הצדדי של צינור השבלול נוצר על ידי הרצועה הספירלית ואת ואסיקולאריס הניסטריה.</li>
	<li>החזיקו את הקיר לרוחב עם מלקחיים כדי ליישר את הקפסולה הגרמית ואת הקיר הצדדי עם החלק התחתון של צלחת פטרי לחתוך את הרקמות האלה מהצד ממברנה בסילאר. ואז לשטח את הדגימה כדי לכוון את המשטח של תא השיער החושי למעלה. קצץ את שאר הקפסולה הגרמית ואת הקיר הצדדי (איור 1j).</li>
	<li>הסר את קרום tectorial באמצעות מלקחיים כדי להפריד לחלוטין את האזור האמצעי (איור 1k).</li>
	<li>חזור על שלבים 4.7-4.9 עבור הניתוח הסופי של התורים או האזורים הנותרים כמוצג באיור 1לערך.</li>
	<li>הכינו שמיכות סיבוב של 10 מ"מ לצורך הדבקה של האפיתל החושי. השתמש בפיפטה כדי להפיץ את 0.5 μL של תא ודבק ברקמות על מרכז הכיסויים העגולים. לאחר ייבוש (3 – 5 דקות ב RT), לשים את הכיסויים ב-PBS בצלחות פטרי.</li>
	<li>מקל את כל ארבעת פיסות האפיתל החושי על שמיכות סיבוב 10 מ"מ בצלחת פטרי. ואז להחזיק קצה אחד של שמיכות כדי להעביר אותו למנה ארבע היטב עבור immunolabeling או אימונוהיסטוכימיה (איור 1m). הערה: איור 2 ממחיש את מיקום החתכים העיקריים.</li>
</ol>5. אימונויוללינג עבור סינולשבלול
הערה: הפרוטוקול עבור אימונואולבלינג עבור סינאושולי שבלול ואחריו במחקר זה תוארה בעבר13. סרטים טרום סינפטיות סומנו עם נוגדן CtBP2 (עכבר נגד carboxyl-מסוף כריכת חלבון 2 IgG1, תיוג התחום B של חלבון פיגומים RIBEYE). מסופי סינפטית פוסט שתויגו עם GluA2 נוגדן (העכבר נגד גלוטמט קולטן 2 IgG2a, תיוג תת יחידות של קולטן אמפא).
<ol><li>לשטוף את האפיתל החושי עם PBS 3x עבור 5 דקות כל כביסה בצלחת ארבע-טוב ולאחר מכן להוסיף 2 מ ל 2% nonionic הטריסטנט (כלומר, טריטון-X 100) לתוך הקערה עבור 30 דקות ב-RT על מסובבי.</li>
	<li>הסר את הפתרון הגולש nonionic מן התבשיל באמצעות פיפטה ולהוסיף 100 μL של פתרון חסימת המכיל 10% סרום עז רגיל לכל טוב עבור 1 h על מסובבי עם עצבנות עדינה ב RT.</li>
	<li>הסר את פתרון חסימת מכל טוב, לשטוף עם PBS 3x עבור 5 דקות כל לשטוף תחת עצבנות עדינה ב RT.</li>
	<li>הוסף 100 μL של הנוגדנים העיקריים מדולל עם PBS לכל טוב: העכבר anti-GluA2 IgG2a (1:2000), העכבר anti-CtBP2 IgG1 (1:400). מכסים כל מנה ארבע-היטב עם המכסה שלה ומקום לתוך מכולה גדולה מחולל לחות אשר מגן מפני אור. מודטה ב 37 ° c עבור 24 שעות. הערה: כאופציה, ארנב anti-רירן VIIa (1:400) עבור אימונויניום שיער חושי תאים ניתן להוסיף.</li>
	<li>כביסה 3x עם PBS עבור 5 דקות כל לשטוף עם עצבנות עדינה ב RT.</li>
	<li>הוסף 100 μL של נוגדנים משניים אלקסה 594 עז נגד עכבר IgG1a (1:1000), אלקסה 488 עז נגד עכבר IgG2a (1:1000) מדולל עם PBS לכל טוב. מכסים כל מנה ארבע-היטב עם המכסה שלה ומקום לתוך מכולה גדולה מחולל לחות אשר מגן מפני אור. מודטה ב 37 ° c עבור 2 h. הערה: אם רירן VIIa משמש, להוסיף אלקסה 350 עז אנטי ארנב (1:200).</li>
	<li>שטוף 3x עם PBS עבור 5 דקות. לאחר מכן, להעביר את שמיכות סיבוב 10 מ"מ על שקופית עם דגימות על גבי.</li>
	<li>הוסף בקפידה 8 μL של Fluoro-Gel עם מאגר טריס לתוך המרכז של coverslip. ואז להחזיק את הקצה של עוד 10 מ"מ שמיכות עגול עם מלקחיים כדי לעלות על גבי, sandwiching שני שמיכות יחד.</li>
	<li>שימוש לק לציפורניים לאטום את השקופיות, לשים אותם בתיקיה שקופית קרטון, ולאחסן במקרר. הערה: אם כמה Fluoro-Gel דולף החוצה בין שמיכות במהלך הטעינה, לנקות את הקצוות של שמיכות לפני איטום השקופית עם לק. תמונות confocal וקד צריך להילקח בתוך 7 ימים.</li>
</ol>

<ol><li>Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiological+place-frequency+map+of+the+cochlea+in+the+CBA%2FJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse.</a> Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).</li>
<li>Viberg, A., Canlon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+guide+to+plotting+a+cochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The guide to plotting a cochleogram.</a> Hearing Research. 197 (1-10), (2004).</li>
<li>Sha, S. H., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapeutic+interventions+against+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Investigational+Drugs%22%5BJournal%5D)">Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%22temporary%22+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss.</a> Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+Noise+Activates+Rho-Family+GTPases+through+Transient+Cellular+Energy+Depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion.</a> Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).</li>
<li>Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-Induced+Loss+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synaptopathy+Are+Mediated+by+the+Activation+of+AMPK%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK.</a> Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).</li>
<li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Histone+Methyltransferase+G9a+Attenuates+Noise-Induced+Cochlear+Synaptopathy+and+Hearing+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss.</a> Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+attenuates+noise-induced+hearing+loss+by+reducing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidant+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress.</a> Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Calcium+Transporters+Mediate+Sensitivity+to+Noise-Induced+Losses+of+Hair+Cells+and+Cochlear+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469(2018).</li>
<li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross%2C+cellular+and+subcellular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li>
<li>Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+pathways+of+hair+cell+death+induced+by+kanamycin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo.</a> Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).</li>
<li>Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+and+neural+degeneration+with+aging%2C+as+seen+in+microdissections+of+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology%2C+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).</li>
<li>Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophin-3+regulates+ribbon+synapse+density+in+the+cochlea+and+induces+synapse+regeneration+after+acoustic+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HDAC+with+a+novel+inhibitor+effectively+reverses+paclitaxel+resistance+in+non-small+cell+lung+cancer+via+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms.</a> Cell Death & Disease. 7, 2063(2016).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEngstr%C3%B6m%2C+H+%22Structural+pattern+of+the+organ+of+Corti%3A+a+systematic+mapping+of+sensory+cells+and+neural+elements%22">Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements</a>. , Almqvist & Wiksell. Stockholm, Sweden. (1966).</li>
<li>Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+and+vestibular+lesions+in+capsular+otosclerosis+as+seen+in+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology%2C+and+Laryngology+Supplement%22%5BJournal%5D)">Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection.</a> Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, Pt 3 Suppl 48 1-40 (1978).</li>
<li>MassEyeAndEar.org. , https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Mount+Dissection+and+Immunofluorescence+of+the+Adult+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).</li>
<li>Corning Cell Culture Surfaces. , https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019).</li>
<li>Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the hair cell ribbon synapse.</a> The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).</li>
<li>Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+anatomy+of+the+%27hook%27+region+of+the+human+cochlea+and+how+it+relates+to+cochlear+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology+and+Neurootology%22%5BJournal%5D)">On the anatomy of the 'hook' region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation.</a> Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).</li>
<li>Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+hook+region+of+the+cochlea+for+bone-conduction+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing.</a> Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).</li>
<li>Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-interacting+protein+kinases+modulate+noise-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death.</a> Cell Death & Disease. 5, 1262(2014).</li>
<li>Brown, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-Mediated+Glial+Cell+Elimination+in+the+Postnatal+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407(2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

ניתוח שבלול של פני השטח הכולל בשילוב עם האימונואולבלינג מספק כלי בסיסי לחקירת הפתווגיות באוזן הפנימית ומנגנונים מולקולריים. זה שונה העכבר המבוגר לנתיחה שבלול שיטה באמצעות התא ואת הדבק מפשט את ההליך הזה קשה.
למרות שיטת ההכנה לפני שבלול זו שונה יחסית קלה ונגישה, היא עדיין דורשת תרגול כדי להשיג מיומנות. כדי לבצע את החתכים הנכונים, הבתר צריך ריכוז זהיר. כי תאי שיער שבלול חושי בתור בסיס הם כל כך קרובים לימבוס ספירלה, קשה להסיר באופן מלא את רקמת לימבוס כדי לאפשר הכנה לפני השטח לשכב שטוח לחלוטין, אבל...

שבלול מוקדש זיהוי של קול ואחראי לשמיעה. תעלת השבלול מתפתל בצורת ספירלה במבוך הגרמי ומחזיקה את האיבר החושי הסופי של השמיעה, העוגב של קורטי (OC). OC נח על קרום בזיאר, הפיכת האפיתל שבלול, עם אורך של כ 5.7 מ"מ כאשר הסרת מתפתל ב cba/caj עכברים מבוגרים1,2. בגלל OC הוא tonotopically מריחה על הרקמות עם תדרים גבוהים זוהה בבסיס תדרים נמוכים בפיסגה, אפיתל שבלול מחולק לעתים קרובות לשלושה חלקים עבור השוואות אנליטיות: apical, האמצעי, ו בסיס הופך מתאים נמוך, בינוני, וזיהוי תדר גבוה, בהתאמה. בנוסף למערך של תאים תומכים, ה-OC מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים (IHCs) הממוקמת באופן מדעי ושלוש שורות של תאי שיער חיצוניים (OHCs) ממוקמים באופן משני ביחס לספירלה השבלול.
עיבוד שמיעתי נכון תלוי בשלמות תאי השיער החושי בתוך שבלול. נזק או אובדן של תאי שיער חושי היא תכונה פתולוגית נפוצה של אובדן שמיעה נרכש, שנגרמו על ידי הרבה חבלות כגון חשיפה לרעש מוגזם, שימוש בתרופות אוטוטוקסיות, דלקות אוזניים חיידקי או נגיפי, פציעות ראש, והזדקנות תהליך3. בנוסף, את היושרה והתפקוד של תא השיער הפנימי/מעצבי העצב השמיעה יכול להיות לקוי על ידי העלבונות קל4. עם הזמינות של מידע מולקולרי וגנטי ומניפולציה של גנים על ידי הסתרה וטכניקות דפיקה, עכברים כבר בשימוש נרחב במדע שמיעה. למרות שבלול העכבר המבוגר הוא זעיר ואת האפיתל שבלול הוא מוקף כמוסה גרמי וכתוצאה מכך מיקרוניתוח קשה מבחינה טכנית, משטח ההכנות של האפיתל בשילוב עם אימונויניום או אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית וקד שימשו באופן נרחב לחקירת הפתווגיות שבלול, כולל הפסדים של הסינפסות של הסרט ותאי השיער, שינויים ברמות של חלבונים בתאי שיער חושי ותאים תומכים, והתחדשות תא השיער. ההכנות פני השטח שבלול שימשו גם כדי לקבוע את תבנית הביטוי של גנים הכתב (כלומר, GFP) ולאשר התמרה מוצלחת ולזהות סוגי תאים התמרה. טכניקות אלה שימשו בעבר למחקר של מנגנונים מולקולריים בבסיס אובדן שמיעה המושרה רעש באמצעות מבוגרים cba/J עכברים5,6,7,8,9.
בניגוד אימונוהיסטוכימיה באמצעות מקטעים פרפין או קריוקטדורים כדי לקבל חלקים החוצה חתך קטן של שבלול המכילים שלושה תאים השיער החיצוני (OHCs) ואחד תא השיער הפנימי (IHC) על כל קטע, משטח שבלול ההכנות לאפשר ויזואליזציה של האורך כולו של OC לספירת תאים שיער חושי וסינפסות סרט ואימונויניום של תאי שיער חושי המתאימים תדרים פונקציונליים ספציפיים. טבלה 1 מראה את המיפוי של תדרי שמיעה כפונקציה של מרחק לאורך הספירלה שבלול ב-cba/J עכבר למבוגרים על פי לימודים מולר1 ו Viberg ו canlon1,2. ההכנות פני השטח שבלול כבר בשימוש נרחב לחקירת הפתווגיות שבלול4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13.14,15 שיטת הניתוח השבלול המלא תוארה במקור בספר שנערך על ידי הנס אנגלסטרום ב-196616. טכניקה זו הייתה מעודנת ומותאמת למגוון של מינים כמתואר בספרות על ידי מספר מדענים במדעי השמיעה10,11,12,13, 15,17 ועל ידי מעבדות איטון-פיבודי ב מסצ עין ואוזן18. לאחרונה דווח על שיטה נוספת לחיתוך שבלול על-ידי מונטגומרי ואח '19. מיקרודיסקציה של שבלול הוא צעד חיוני וקריטי עבור ההכנות פני השטח של שבלול. עם זאת, מבתר כנימת העכבר הוא אתגר טכני ודורש פרקטיקה ניכרת. כאן, שיטת הכנה לפני השבלול שונה מוצגת לשימוש כנימת העכבר למבוגרים. שיטה זו דורשת decalcification ושימוש בדבק תא ורקמות (כלומר, Cell-Tak) כדי לדבוק פיסות של אפיתל שבלול כדי 10 מ"מ שמיכות עגול מחליק עבור immunolabeling. דבק תא ורקמה שימש באופן נרחב עבור אימונוהיסטוכימיה20. שיטה זו שונה לנתיחה המיקרודיסקציה היא פשוטה יחסית לאלה שדווחו בעבר18,19.

<table><tbody><tr><td>מוצרי מיקרוסקופיה</td> <td>של Rund Coverslips 10 מ"מ</td> למדע ותעשייה <td>260367</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 עז נגד עכבר IgG1</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A-21125</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 עז נגד ארנב IgG (H+L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>מגשי מיקרו שקופיות קרבורד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-587-10</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג מנות פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #5 מלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>EDTA מלח דיסודיום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>פלואורו-ג'ל עם Tris Buffer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-10</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים עם ארבע בארות</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>עיזים אנטי-מיוזין VIIa נוגדן</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-CtBP2 נוגדן</td><td>BD Biosciences</td><td>#612044</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי-Glu2R נוגדן</td><td>Millipore</td><td>MAB397</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>31872</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>אזמל</td><td>VWR</td><td>100491-038</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X100-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>ואנאס מספריים קפיציים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>15001-08</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

עיבוד השמיעה בתוך שבלול תלוי בשלמות של תאי השיער המכניים. במשך החיים, אובדן שמיעה ניתן לרכוש הרבה חבלות כגון חשיפה לרעש מוגזם, השימוש בתרופות האוטוטוקסינים, זיהומים חיידקיים או נגיפי האוזן, פציעות ראש, ואת תהליך ההזדקנות. אובדן תאים שיער חושי היא תכונה פתולוגית נפוצה של זנים של אובדן שמיעה נרכש. בנוסף, תא השיער הפנימי סינפסה יכול להיפגע על ידי עלבונות קלים. לכן, ההכנות פני השטח של epithelia שבלול, בשילוב עם טכניקות אימונויניום ודימויים קונפוקלית וקד, הם כלי שימושי מאוד לחקירת הפתווגיות שבלול, כולל הפסדים של הסינפסות של רצועת הכלים ותאי שיער חושי, שינויים ברמות החלבונים בתאי השיער והתאים התומכים, התחדשות תאי השיער וקביעת הביטוי הגנטי של הדוח (כלומר, GFP) לאימות התמרה מוצלחת וזיהוי של סוגי תאים שעברו התמרה. שבלול, מבנה בצורת ספירלה גרמי באוזן הפנימית, מחזיק את האיבר החושי קצה השמיעה, האיבר של Corti (OC). תאים שיער חושי התאים התומכים המקיפים ב-OC הם כלולים צינור שבלול ולנוח על קרום בזיאר, מאורגן באופנה tonotopic נושא עם זיהוי תדר גבוה המתרחשים בבסיס ובתדר נמוך בקודקוד. עם הזמינות של מידע מולקולרי וגנטי ואת היכולת לתמרן גנים על ידי הסתרה וטכניקות דפיקה, עכברים כבר בשימוש נרחב במחקר ביולוגי, כולל במדעי השמיעה. עם זאת, העכבר המבוגר שבלול הוא זעיר, ואת האפיתל שבלול הוא כימוס במבוך הגרמי, הפיכת מיקרו לנתיחה קשה. למרות טכניקות הניתוח פותחו ונעשה שימוש במעבדות רבות, זו שיטה מיקרודיסקציה שונה באמצעות דבק תא ורקמות קל יותר ונוח יותר. ניתן להשתמש בו בכל סוגי שבלול העכבר המבוגר בעקבות decalcification.

משטח ההכנות של האפיתל שבלול, בשילוב עם אימונויניום והדמיה קונפוקלית וקד, כבר נעשה שימוש נרחב במדע שמיעה לחקירה של פתווגיות שבלול, כגון כימות של הסינפסות של סרט, תאי שיער חושי, וחלבון ביטוי בתאי השיער הסנסוריים5,6,7,8. למרות הניתוח של כנימת העכבר מבוגרים עבור ההכנות פני השטח אינו פשוט, סטודנטים חדשים מוסמכים מסוגלים ללמוד שיטה זו שונה לאחר תרגול עם 10 – 15 אוזניים (איור 1</s...

מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

תכשירי משטח שרוך מאפשרים הדמיה של כל העדשה של האיבר של קורטי באמצעות אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקאלית. זה שימש באופן נרחב לחקירה של פתולוגיות cochlear ספציפיות של עניין. אנו משנים את שיטת המיקרו-דיסקטוריה של השבב.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הדבקות של חתיכת אפיתל שבך ל 10 מילימטר כיסויים עגולים עבור הליך immunolabeling תוך הימנעות אובדן רקמות במהלך שלבי כביסה מרובים. בנוסף פתולוגיות cochlear, הכנת משטח שרוך יכול גם להיות מנוצל עבור ביטוי הערכה והתחדשות תאי השיער. מיומנויות מיקרוסקופ בסיסיות נדרשות עבור טכניקה זו והדגמה חזותית של השיטה יכולה לעזור להבטיח שכל שלב מבוצע כראוי.הדגמת ההליך תהיה צ'יאוג'ון פאנג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. עבור עקירת עצם זמנית, מיד לאחר המוות למשוך את העור הקדמי כדי לחשוף את עצם הגולגולת ולהשתמש מספריים לחתוך את העצם מההיבט האחורי קדימה לאורך הקו המרכזי של הגולגולת. השתמש מדפים כדי להסיר את רקמת המוח לפני השימוש באגודל ובאצבע המורה כדי להסיר באופן ידני את עצמות הזמן מעכברים שלושה חודשים של גיל ומעלה.מניחים את העצמות לתוך צלחת פטרי בקוטר 30 מ"מ המכילה קרח טרי קר 4% PFA ו PBS תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהסיר את stapes מהחלון הסגלגל. לנקב את קרום החלון העגול עם מלקחים מספר חמש ולהשתמש מחט מד 27 מחובר מזרק מיליליטר אחד המכיל טרי 4% PFA לעשות חור קטן לתוך שיאו של cochlea. בעדינות ולאט לאט לעיין ב cochlea עם פתרון תיקון דרך החלונות העגולים והאליפטיים עד הפתרון נשטף מתוך החור הקטן על apex.לאחר מכן להעביר עד שני cochleae מנוון לתוך בקבוקונים בודדים 20 מיליליטר נצנוץ המכיל 10 מיליליטר של 4% PFA לכל בקבוקון בעדינות להתסיס את הדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ואחריו אחסון לילה בארבע מעלות צלזיוס על מסובב. למחרת בבוקר, לשטוף את cochleae עם שלוש שטיפות חמש דקות עם PBS טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים 20 מיליליטר של 4% EDTA לכל בקבוקון ומסובבים את הדגימות במשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה.בסוף הדגירה, לגעת בחלק שיוויץ גרמי של כל cochlea עם מדפים כדי להעריך את הגמישות של הדגימות. אם העצמות אלסטיות ולא מוצקות, שבלול השיניים נודק. החלף את ה- EDTA עבור כל דגימה ב- PBS טרי.עבור microdissection של אפיתל שרוך, לתפוס את החלק שיוויץ של עצם הזמן עם מטלפים ולהשתמש אזמל לחתוך את הסיבוב apical בזווית של 45 מעלות. חותכים אנכית לאורך הקו הקלוש שבין החלון העגול לחלון הסגלגל כדי להפריד את הקלאה מחלק שיוויון ומכווןים את חלק הלול עם הסיבוב הבסיסי לכיוון החלק התחתון והאמצע פונה לכיוון החלק העליון של צלחת פטרי. מעמדה זו, חותכים את הקפסולה הגרמי ואת הקיר רוחבי של האמצעי לפנות לכיוון הסוף שממנו החלק apical הוסר ולהמשיך לחתוך כדי להפריד לחלוטין את החלק האמצעי מאזורי בסיס וו.הצבת החלק הבסיסי וו עם האתר קרום בזילאר מכוון לכיוון החלק התחתון של המנה, לחתוך אנכית את medialis את אזור הוו כדי להסיר את medialis לחתוך את אזורי בסיס וו להפריד את חלק הוו. כדי למנוע עיוות של הרקמה, לחתוך את medialis את אזור הוו לפני ההפרדה של אזור סיבוב בסיס וו. חותכים את החלקים הגדולים יחסית של כמוסה גרמית רקמת קיר צדדית של הפנה האמצעי ומחזיק את הקיר הצדדי עם מטלטולים כדי ליישר את הקפסולה גרמית ואת הקיר הצדדי עם החלק התחתון של צלחת פטרי, לחתוך את הרקמות האלה מהצד קרום בזיליקום.לאחר מכן, משטחים את הדגימה כדי לכוון את צד פני השטח של תא השיער החושי למעלה ולקצץ את שאר הקפסולה הגרמי והקיר הצדדי. לאחר מכן השתמש במקלות כדי להסיר את קרום tectorial כדי להפריד לחלוטין את האזור האמצעי ולהסיר את הקפסולה גרמית, רקמת קיר מצד שני, ואזורים tectorial של פניות הנותרים כפי שהודגם רק. כאשר כל הסיבובים cochlear נותאו, להפיץ 0.5 microliters של תאים ורקמות דבק על המרכז של סיבוב אחד 10 מילימטר מכסה ולאפשר דבק להתייבש במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר.מניחים את הכיסויים המיובשים בצלחת פטרי ומדביקים את כל ארבעת החלקים של כל דגימת אפיתל חושית על כיסוי אחד. לאחר מכן השתמש במטסים כדי לתפוס קצה אחד של כל כיסוי כדי להעביר את הדגימות לתוך בארות בודדות של צלחת תרבות תא ארבע בארות עבור immunolabeling. לקבלת immunolabeling של הכנות סינפסה שרוך פני השטח, לשטוף כל אפיתל חושי שלוש פעמים במשך חמש דקות PBS טרי לכל לשטוף, ואחריו הטיפול של כל מדגם עם שני מיליליטר של 2% לא יוני פעילי שטח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב.בסוף הדגירה, שאפו את התמיסה האקטיבית מכל באר וחסמו כל כריכה לא ספציפית עם 100 מיקרוליטרים של פתרון חסימה לאורך שעה על המסובב עם תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה חסימה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם תחת תסיסה עדינה לפני תיוג כל אפיתל עם 100 microliters של הנוגדנים העיקריים של עניין במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. למחרת, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS טרי תסיסה עדינה לכל לשטוף ולתייג את הדגימות עם 100 microliters של נוגדנים משניים המתאימים של עניין במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם שלוש שטיפות חמש דקות PBS טרי לכל לשטוף לפני הנחת כל כיסוי על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות עם דגימות פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות שמונה מיקרוליטרים של מדיום הרכבה מתאים למרכז כל כיסוי ולהשתמש במדפים כדי להרכיב כיסוי נוסף של 10 מילימטרים על כל דגימה. לאחר מכן לאטום את הצדדים של כל כריך coverslip עם לק ברור, למקם את הדגימות לתוך תיקיית שקופיות קרטון, ולאחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס.למרות הניתוח של שבלול עכבר בוגר להכנת פני השטח אינו פשוט, חוקרים חדשים בטכניקה צריכים להיות מסוגלים ללמוד את השיטה לאחר תרגול עם 10 עד 15 אוזניים. Immunolabeling של הכנות פני השטח של עכברים CBAJ לא מטופלים 10-12 שבועות עם CTBP2 ו GluA2 מדגים כי הן סרטים presynaptic וטרמינלים postsynaptic בהתאמה ממוקמים מתחת הגרעינים תא השיער הפנימי והם צירוף המציין סינפסות פונקציונליות. Immunolabeling עבור מיוסין 7A ונגד עם פאלודין ו DAPI מגלה את נוכחותם של תאי שיער חושיים כולל תאי השיער החיצוניים ותאי השיער הפנימיים ואת הגרעינים שלהם.Immunolabeling עבור myosin 7A ונגד הגנה עם פאלודין מראה שום הבדלים immunoreactivity או אחידות עם או בלי שימוש דבק תאים ורקמות. בנוסף, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים של תכשירי פני השטח מעכברים שחורים שחורים C57 בני שישה עד שמונה שבועות מדגמים סטריאוסיליה מאורגנת היטב בצורת V של תאי שיער החיצוניים בשלוש שורות של המדגם. זכור למלא את העצם בפתרון מתקן בעדינות ולאט לאט דרך החלונות העגולים והאליפטיים עד שהפתרון יישטף מהחור הקטן ב- apex.לפני הפרדת אזור הוו מפניית הבזל, טפל בחיתוך המדיאליס מאזור הוו כדי להקל על הסרת המדיאליס.

cochlear-surface-preparation-in-the-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

קיימות שיטות שונות להחדרת חומרים אוטוטוקסיים לשבלול של מודלים של בעלי חיים. מוצג פרוטוקול כירורגי להעברת חומרים אוטוטוקסיים לגומחת החלון העגול. ההליך אמין, יוצר נגעים תוך-שבלוליים ממוקדים ומונע נזק מכני למיקרו-ארכיטקטורה. ניתן לבחון תיקון/התחדשות עצמית של השבלול.

גישת העכבר עגול החלון לototoxic סוכן משלוח: מהיר וטכניקה אמינה גרימת ניוון תא שבלול

ריסים ראשוניים משפיעים על מסלולי איתות שונים. שבלול היונקים אידיאלי לבחינת איתות קוטביות תאים מישוריים (PCP). תפקוד לקוי של ריסים משפיע על צמיחת השבלול, דפוס התאים וכיוון תאי השערה, קריאות של PCP. מטרתנו היא לנתח איתות PCP בשבלול עכבר באמצעות ניתוח פנוטיפי, אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

שתי גישות מיקרו-כירורגיות להעברת תרופות מקומיות לאוזן הפנימית מתוארות כאן ומושוות במונחים של השפעה על פרמטרי שמיעה, ציטוארכיטקטורה של השבלול וביטוי סמנים דלקתיים.

מחקר השוואתי של שיטות שיגור תרופות אל האוזן הפנימית עכבר: Bullostomy Versus הזרקת Transtympanic

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

מודלים חייתיים של שתלי שבלול יכול לקדם את הידע בסיסי טכנולוגיים לטיפול אובדן שמיעה sensorineural קבוע עם גירוי חשמלי. מחקר זה מציג פרוטוקול כירורגי מחריש אוזניים חריפה, שבלול השרשה של מערך אלקטרודה עכברים, כמו גם את הערכת תפקודי עם גזע המוח השמיעתית תגובה.

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

פרוטוקול זה, המיועד למשתמשים מתחילים ברקמת האוזן הפנימית של העכבר, מפרט באופן מקיף שלבים לעיבוד אוזניים פנימיות של עכבר בשלבי התפתחות שונים לצביעה חיסונית של חתך.

הקפאה וצביעה חיסונית של רקמת האוזן הפנימית של עכבר: משלב עוברי לשלב בוגר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, טיהור ותרבות של תאים שוליים ראשוניים מ-stria vascularis של העכבר, וכן להקמת מודלים במבחנה של לחץ חמצוני והזדקנות תאית לחקר הפרעות בדופן הצדדית של השבלול.

בידוד ותרבות של תאי שוליים ראשוניים של Stria Vascularis מעכברים יילודים

למד הכנה לפני שבלול בעכברים מבוגרים לצורך ויזואליזציה של אברון קורטי באמצעות אימונוהיסטוכימיה. שיטה זו משפרת הידבקות רקמות ומונעת אובדן דגימות במהלך השטיפות.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

גלה סרטונים נוספים