שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

פיתחנו שיטת הרכבה להדמיית זמן לשגות המאפשרת צמיחה בלתי מוגבלת של עוברי זברה שבירים ו בו בזמן שומרת אותם במצב קבוע לחלוטין. שיטת הרכבה זו מהירה, קלה וזולה והיא פועלת להדמיית מעבדה בכל מיקרוסקופ הפוך. פיתחנו שיטה זו להדמיה של עוברי זברה חיים, אך ניתן לשנותה להדמיה של מודלים קטנים אחרים של בעלי חיים ימיים.

התחל על ידי הרבייה של דג הזברה הבוגר. אחר הצהריים, מניחים את הדגים במיכלי רבייה ביחס של זכר לנקבה של אחד לשניים. לאחר מכן הכינו תמיסת מלאי של 1% התכה נמוכה בתקשורת העוברים והמיסו אותה על ידי חימום במיקרוגל.

אליקאוט הפתרון agarose לתוך צינורות 1.5 מיליליטר. הפוך פתרון מלאי של 4% tricaine במים מזוקקים ולאחסן את אגרוז טריקאין בארבע מעלות צלזיוס. Tricaine הוא רעיל ויש לשקול ולהוכן במכסה המנוע אדים.

לאחר ההזדווגות, קוצרים את עוברי הזברה ב- E3 בצלחת פטרי ודגירה אותם ב 26.5 מעלות צלזיוס במשך כ 28 שעות לפני ההרכבה. הרדמה העוברים עם 0.02% tricaine ו dechorionate אותם תחת מיקרוסקופ על ידי אחיזה בעדינות משיכת chorion לגזרים כדי לשחרר את העובר. רגע לפני ההרכבה, מחממים את תווי ההתעוררות ל-65 מעלות ואז נותנים לו להתקרר לכ-30 מעלות צלזיוס כדי שהעובר לא ייפגע מהחום ומוסיפים טריקאין לתסכול ההתעוררות.

השתמש 35 מילימטר זכוכית התחתון מנות עם מספר אפס coverglass התחתון. מניחים בעדינות עובר dechorionated עם אחד הצדדים הצדדיים שלה לכיוון החלק התחתון של המנה עם פיפטה זכוכית או micropipette, ולאחר מכן להסיר בזהירות כל E3 הנותרים עם micropipette. הוסף את הפתרון הראשון agarose ל באר קטנה שנוצרה על ידי coverglass מחובר לתחתית המנה כדי לכסות את העובר לוודא כי אגרוז מכסה את באר קטנה אבל לא עולה על גדותיו.

מכסים את באר קטנה עם coverglass כדי ליצור חלל צר מלא אגרוז עם העובר בין שני coverglasses. מניחים שכבה של 1% פתרון agarose על גבי coverglass בכל רחבי החלק התחתון של המנה אשר ישמור את coverglass במקום כפי שהוא מתמצח. לאחר מכן מלאו את החלק הנותר של המנה ב-E3 המכיל 0.02% טריקאין כדי לשמור על התייבשות המערכת.

כדי לזהות את ריכוז ההתעוררות האופטימלי לשכבה 1, הר את העוברים בריכוזים הולכים וגדלים של אגרוז ובצע הדמיה של זמן לשגות כדי לזהות את הריכוז הממזער את עיוות העובר ואת תנועתיותו, ולאחר מכן לבדוק טווח עדין יותר של ריכוזים המבוססים על התוצאות. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא לזהות את הריכוז האופטימלי של אגרוז לשכבה 1. בדוק ריכוזי ננו שונים של אגרוז כגון 0.030%0.032%etc.

כדי למצוא את הריכוז האופטימלי. כדי לבצע הדמיה בזמן לשגות של העוברים, להשתמש בשלב מיקרוסקופ עם אינקובטור מוגדר 28.5 מעלות צלזיוס ותדמית עד 55 שעות. כדי לדמיין בו זמנית מספר עוברים, השתמש במתאם שלב המכיל מספר מנות וסובב את הכלים בזה אחר זה כך שהעוברים ממוקמים אופקית.

בחר מטרת הגדלה נמוכה, ולאחר מכן לאתר את העוברים באמצעות העין ולבסוף ליישר אותם אופקית על ידי סיבוב הכלים. רשום את מיקום העוברים בתוכנה וצור שם קובץ עבור שמירה אוטומטית של הנתונים. הגדר את גודל חור הסיכה, מהירות הסריקה, גודל התמונה ושינוי גודל התצוגה.

לאחר מכן בחרו הגדלה גבוהה יותר ללכידת תמונות וערוצי הפלואורסצנטיות להדמיה. עבור כל ערוץ, כוונן את עוצמת הלייזר ואת המתח הגבוה של הגלאי הקפד לאסוף את הטווח הדינמי הטוב ביותר האפשרי תוך הימנעות מרוויה והגבלת הלבנת תמונות. לאחר מכן, כדי לצלם את העובר כולו עם מטרה 10X, להגדיר את הגדרות לכידת תמונה גדולה בתוכנה כדי תמונה מספר שדות תצוגה ולתפור אותם יחד התאמת המיקום של העובר כדי לוודא שהוא מתאים בתוך שטח תמונה גדול זה.

קבע את ההגדרות ללכידת ערימות Z בהתאם להוראות כתב היד. על מנת לשמור על מיקוד של עוברים מרובים במהלך הדמיה לטווח ארוך לשגות זמן, להשתמש במוקד אוטומטי ולהתאים את רמות ההיסט הפרט עבור כל עובר להתמקד במישור הייחוס. לאחר מכן הגדר פרמטרים לשגות זמן בתוכנת המיקרוסקופ לתמונה למשך 55 שעות במרווחי זמן של שעה.

בכל מחזור, לכוד שתי ערכות נתונים עובריות ברצף ושמור נתונים באופן אוטומטי. השתמש בתוכנת המיקרוסקופ כדי לעבד את התמונות. אם יותר עובר אחד תדמית, צור קבצים עצמאיים עבור כל עובר על-ידי פיצול ערכות הנתונים בהתבסס על מיקום ההדמיה.

המירו את ערכות הנתונים של זמן תלת-מימד לערכות נתונים דו-מימדיות באמצעות הקרנות בעוצמה מרבית או כלי דומה. לבסוף, צור קבצי סרטים על-ידי שמירה כ- AVI ובחירה באפשרות ללא דחיסה עם מרווחי זמן של 200 אלפיות שניה למהירות הפעלה של חמש מסגרות לשנייה. שיטת הרכבה שכבתית זו מאפשרת דימוי עוברי זברה-דג תוך מתן אפשרות לגדול אך בו זמנית מגבילה את תנועתם.

אם ריכוז ההתעוררות גבוה מדי, העוברים הופכים מעוותים. אבל אם זה נמוך מדי, הם יעברו מחוץ לשדה המבט במהלך מיקרוסקופיה לשגות בזמן. ריכוז האגרוז האופטימלי נמצא בין 0.028 ל-0.034%דגי זברה מהונדסים חיים המבטאים RFP בעובר כולו ו-GFP בתאי האנדותל של כלי הדם נתפרו במשך 55 שעות שבמהלכן נבט כלי הדם הבין-דוריים, כלי דם תת מעיים וראש התפתחו, ועיבוי מקלעת ורידים caudal עם הארכת תא המטען התרחשה.

עוברים המבטעים GFP ותאי עצב מוטוריים דימוי לדמיין התפתחות נוירון מוטורי. אקסונים נוירון מוטורי לנבוט מן הצינור העצבי הגחוני מעל somites לכיוון הצד הגחוני של העובר. ההתפתחות ההדדית של הנבט הגבי של אקסונים של נוירונים מוטוריים ביחס למיקום של כלי דם בין-סגמנטליים תדמית באמצעות הגדלה גבוהה יותר.

זה אפשר לדמיין את הפרטים הקטנים של נובט אקסון הגחוני, כמו גם אקסון הגב נובט מן הצינור העצבי. ככל שמספרי somite גדלו, somites גם להרחיב באורך ורוחב. תהליך זה תדמית באמצעות עוברים מהופנטים המבטעים GFP בשרירים.

בגלל הריכוז האופטימלי של אגרוז הוא צר מאוד, הוא רגיש מאוד וריאציות קטנות במדידות בעת הכנת פתרון המניות של אגרוז וזה צריך להיות מוגדר מחדש עבור כל קבוצה חדשה של פתרון agarose. חשוב להגדיר בזהירות את פרמטרי ההדמיה כולל גודל התמונה ורזולוציה, מהירות הסריקה, זום, מתח גבוה גלאי, וכוח לייזר כדי להבטיח עקביות בין ניסויים וגם כדי להפחית את האפשרות של רעילות תמונה הלבנת תמונה במהלך זמן ארוך לשגות הדמיה. באמצעות שיטת הרכבה זו לעוברים מהונדסים של דגי זברה ואחריה הדמיה ממושכת של האורגניזם כולו, אנו יכולים לדמיין כיצד רקמות שונות מתפתחות יחד.