קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

סינתזת חלבונים נטולת תאים היא טכנולוגיה מתפתחת במערכות וביולוגיה סינתטית לייצור במבחנה של חלבונים. למערכות סינתזת חלבונים נטולות תאים אין קיר תאים, ולכן יש לנו גישה ישירה למטבוליטים. בפרוטוקול זה, אנו מכמתים את המדידות המוחלטות של 40 מטבוליטים המעורבים בחילוף חומרים מרכזי של פחמן ואנרגיה, המאפשר לנו לאפיין את חילוף החומרים ללא תאים.

הפרוטוקול מסתמך על גרורות של התרכובות עם אנילין, המאפשר הפרדה טובה יותר ורזולוציית ספקטרומטריית מסה גבוהה יותר. בנוסף, אנו משתמשים בתקנים פנימיים עם אנילין תווית isotopic, לכמות מוחלט של מטבוליטים. מטבוליטים מתויגים coelute, אשר מבטל את ההשפעות של דיכוי ברזל.

המאפשר כימות מדויק של התרכובות. עבודה במכסה המנוע, לשלב 550 microliters של אנילין, עם 337.5 microliters של מים LC-MS כיתה. ו-112.5 מיקרוליטרים של 12 חומצה הידרוכלורית טוחנת בצינור צנטריפוגה.

מערבולת היטב, ולאחסן את פתרון aniline שש טוחן ב pH 4.5 וארבע מעלות צלזיוס. כדי להכין פתרון אנילין פחמן-13 טוחן, ב pH 4.5, לשלב 250 מיליגרם של פחמן-13 אנילין עם 132 microliters של מים, ו 44 microliters של 12 חומצה הידרוכלורית טוחנת. מערבולת היטב, ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס.

כדי להכין 200 מיליגרם לכל פתרון EDC מיליליטר, להמיס שני מיליגרם של EDC ב 10 microliters של מים עבור כל מדגם להיות מתויג. ומערבולת היטב. כדי להכין דגימות, מרווה ומזרז את החלבונים בתגובת סינתזת חלבונים נטולת תאים, על ידי הוספת נפח שווה של 100% אתנול קר כקרח לתגובת הסינתזה נטולת התאים.

צנטריפוגה המדגם ב 12, 000 פעמים גרם, במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי של הדגימה לצינור צנטריפוגה חדש. כדי לתייג את המדגם בתווית אנילין פחמן-12, העבר שישה מיקרוליטרים של המדגם לתוך צינור צנטריפוגה חדש, ולהביא את הנפח ל 50 microliters עם מים.

הוסיפו 5 מיקרוליטרים של 200 מיליגרם לתסרון EDC מיליליטר, ערבבו היטב את תווי האנילין פחמן-12 והעברו 5 מיקרוליטרים לצינור. מערבולת התגובה עם רעידות עדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר שעתיים, מוציאים את הצינורות מהשייקר ומעבירים אותם למכסה המנוע.

הוסף 1.5 microliters של טריאתילאמין לכל תגובה כדי לעצור את תגובת תיוג אנילין ולייצב את התרכובות. צנטריפוגה ב 13, 500 פעמים g במשך שלוש דקות. ולהציל את העל-טבעי.

כדי לתייג את הסטנדרטים הפנימיים בתווית אנילין פחמן-13, לדלל את פתרון המלאי הפנימי ל-80 מיקרומולרים בנפח סופי של 50 מיקרוליטרים. הוסף חמישה מיקרוליטרים של 200 מיליגרם לכל פתרון EDC מיליליטר, וחמישה microliters של פתרון אנילין פחמן-13 מעורב היטב. מערבולת התגובה עם רעידות עדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

לאחר שעתיים, להסיר את הצינורות מן השייקר, ולהוסיף 1.5 microliters של טריאתילאמין לתגובה ברדס אדים. צנטריפוגה ב 13, 500 פעמים g במשך שלוש דקות ולשמור על טבעי. כדי לגלות את התקן הפנימי המתויג ואת המדגם המתויג, ערבבו 25 מיקרוליטרים של כל אחד מהם בבקבוקון מדגם אוטומטי.

וניתוח על ידי הליך LC-MS. לאחר מכן, כדי ליצור עקומה סטנדרטית עבור מטבוליטים untagged, הראשון, לדלל את פתרון המלאי של מטבוליטים untagged לריכוזים שונים, עם נפח של 50 microliters. הוסף חמישה microliters של 200 מיליגרם לכל פתרון EDC מיליליטר, וחמישה microliters של פתרון אנילין פחמן 12 לכל ריכוז.

מערבולת התגובה עם רעידות עדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. ולהמשיך עם הטיפול טריאתילאמין. וצנטריפוגליזציה לפני ניתוח על ידי LC-MS כבעבר.

לאחר אתחול LC-MS, על פי הוראות היצרן, להזריק חמישה microliters של המדגם לתוך העמודה. ולרכוש את ההתעצמויות המתאימות m מעל z יון עבור פחמן-12 אנילין מתויג מדגם. לאחר מכן, להזריק חמישה microliters של אותה דגימה שוב.

ולרכוש את m מעל z יון התעצמויות עבור פחמן-13 אנילין מתויג סטנדרטים. בפרוטוקול זה, מטבוליטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בסינתזת חלבון נטולת תאים המבוססת על E.coli כומתו. 40 מטבוליטים המעורבים בחילוף חומרים מרכזי של פחמן ואנרגיה, זוהו וכמתו באמצעות סטנדרטים פנימיים.

בעוד עקומה סטנדרטית עבור חמישה מטבוליטים שלא תויגו עם אנילין פותחה גם. המטבוליטים המגוונים המעורבים במסלולים אלה היו סוג של סוכרים זרחניים, חומצות פוספו-קרבוקסיליות, חומצות קרבוקסיליות, נוקלאוטידים וגורמים שותף. בנוסף, השיטה אפשרה הפרדת זוגות isomer מבניים, כגון גלוקוז-שש פוספט, פרוקטוז-שש פוספט בהפעלת LC-MS אחת.

הצעד החשוב ביותר הוא תיוג המדגם דה חלבון עם אנילין. מכיוון שהפתרון aniline נפרד, חשוב לעבוד במהירות וביעילות, תוך שמירה על נוהלי בטיחות טובים. שיטה זו מסייעת לאפיין את חילוף החומרים ללא תאים עם כימות של 40 מטבוליטים.

אבל, תרכובות נוספות נמצאות בתערובת ללא תאים, כגון חומצות אמינו שניתן לכמת. זה יעזור במתן מבט מקיף יותר לתוך חילוף החומרים ללא תאים. שיטה זו גילתה כי מערכות ללא תאים יש מטבוליזם מורכב, עדיין פועל כי ניתן לנצל פוטנציאל עבור יעילות אנרגיה טובה יותר ותפוקת פחמן.

הפרוטוקול מסתמך על תיוג התרכובות עם אנילין עם השימוש EDC כזרז. שני רייגנטים אלה מסוכנים ויש להשתמש בהם בזהירות.