Name: מקורי פוליאקרילאמיד גל לטיפול חיסוני כתמי באנליזה של אנדודוגני IRF5 דימרזציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: למדו ניתוח דימריזציה של IRF5 באמצעות Western blot נייטיב בקו תאי CAL-1. פרוטוקול זה מאפשר חקר הפעלת IRF5 אנדוגני בהקשרים תאיים שונים עם שחזוריות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכת על ידי מימון של קרן קראוצ'ר וקרנות האתחול של אוניברסיטת סיטי. אנו מודים לכל חברי המעבדה צ'או לקבלת עזרה בניסוי ובקריאה ביקורתית של כתב היד.

הערה: הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בקו התאים CAL-1 של pDC שטופלו ברסיקימוד (R848), אגוניסט עבור TLR7/8. פרוטוקול זה הוחל על סוגים אחרים של תאים אנושיים ו-murine, כולל RAW 264.7 (מורלין מקרופאג line), THP-1 (קו מונלוציטיק האנושי), BJAB (קו תא אנושי B), ראמוס (קו התא האנושי), ו-MUTZ-3 (קו הדנדריטי האנושי)23.
1. המרצת תאים CAL-1
<ol><li>שמירה על תרביות תאים CAL-1 בבקבוקון T75 ב 37 ° c ו-5% CO2 תחת תנאים סטריליים עם 20 על 25 מ ל של RPMI 1640 בינוני המכיל 5% סרום העוברי (fbs), 25 מ"מ hepes, ו-1x רקפטואתנול (כלומר, להשלים RPMI 1640 בינוני).</li>
	<li>העבר את התאים לשפופרת חרוט ב50 mL. הערה: תאי CAL-1 אינם מחסיד. לסוגי תאים מחסיד, ניתן לבצע טריסיזציה סטנדרטית לתאי הקציר.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הסר supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב 8 מ ל להשלים RPMI 1640 בינונית כדי לקבל הבולם האחיד התא יחיד.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות הומוציטומטר. זרע את התאים בצפיפות של 1 x 106 תאים לכל טוב בצלחת 6 היטב עם 4 מ ל של RPMI מלאה מחומם להשלים בינוני 1640 בכל טוב. מודטה עבור 20-24 שעות ב 37 ° c ו-5% CO2 כדי לאפשר את השטף להגיע 90% ל 95% (מתאים כ 1.5 x 106 תאים).</li>
	<li>לגרות את התאים על ידי הוספת 4 μL של 1 מ"ג/mL R848 לכל טוב של 6 צלחת הבאר (הריכוז הסופי של 1 μg/mL). גם להגדיר שליטה ללא גירוי היטב עם תאים ללא טיפול R848.</li>
	<li>ודא R848 מפוזר באופן שווה על ידי נדנוד בעדינות את הצלחת מצד לצד. לאחר מכן, מודאת התאים עבור 2-16 h בחממה ב 37 ° c ו-5% CO2.</li>
</ol>2. הפקת חלבונים סלולריים
<ol><li>להעביר את השעיות התא מ 6 צלחת הבאר לתוך 5 שפופרות צנטריפוגה mL.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות ב RT. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של תמיסת מלח (PBS) כדי לקבל השעיית תא יחיד אחיד.</li>
	<li>להעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת צנטריפוגה 1.5 mL.</li>
	<li>הסתובב לזמן קצר בשעה 12,000 x g עבור 0.5-1 דקות ב-4 ° c ובזהירות הסר את הסופרנטאנט.</li>
	<li>הכן את מאגר הליזה המכילה 6.25 mL של 1 M Tris-HCl pH 7.4 (ריכוז סופי של 25 מ"מ), 7.5 mL של 5 M הנאל (ריכוז סופי של 150 mM), 0.5 ml של 0.5 M EDTA (הריכוז הסופי של 1 מ"מ), 2.5 mL של NP-40 (הריכוז הסופי של 1%) ו 7.5 מ ל של גליצרול (הריכוז הסופי של 5%) ב 250 מ ל של מים מפוהים (ddH2O). הוסף מעכב פרוטאז 100x יחיד להשתמש בקוקטייל לריכוז הסופי של 1x למאגר הליזה ממש לפני השימוש. שמור את מאגר הליזה המוכן על הקרח. הערה: מאגר הליזה ללא פרוטאז יכול להיות מאוחסן ב -4 ° c.</li>
	<li>מחדש את הגלולה תא ב 30 μL של מאגר פירוק קרח קר ומערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה.</li>
	<li>מיכל הקרח במשך 15-20 דקות</li>
	<li>להבהיר את הליפוסט על ידי תפרידו ב 12,000 x g עבור 15-20 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה חדש מקורר 1.5 mL. . שמור את התמציות על הקרח כל הזמן הערה: ניתן לאחסן ליסיטים סלולריים ב-20 ° c או-80 ° c. . אל תרתיח את הדגימות</li>
	<li>מדידת ריכוז חלבונים. בעזרת מגיב ברדפורד</li>
</ol>3. ניתוח IRF5 דימרזציה על-ידי דף מקורי
<ol><li>הכן את מאגרי האלקטרופורזה העליונים (-) והנמוכים (+). מאגר החדר העליון מורכב מ-0.3% נתרן (NaDOC) במאגר מקורי של 1 x, והתא התחתון מכיל רק דף מקורי של 1x הפועל מאגר. הערה: הכן מאגר חדש של התא העליון עבור כל הפעלה חדשה.</li>
	<li>לשטוף 3%-12% ג'ל מקורי לעמוד ביסודיות עם מים מבלי לעוות את הבארות. הגדר את ג'ל לתוך המיכל מיני ג'ל ולהסיר את המסרק. מזוג את הג בחדר קר בגודל 4 ° c או על הקרח ב-150 V במשך 30 דקות. הערה: מראש מסיר אמוניה מוגזמת ויונים פרסולפט העלולים להפריע להפעלת הג.</li>
	<li>במהלך ההכנה מוקלטת, הכינו את הדגימות לטעינה על ידי ערבוב החלבונים הסלולריים הנשמרים על הקרח עם מאגר דגם מקורי של 4 x.</li>
	<li>לאחר העריכה המוכנה, טען 10 עד 15 μg של חלבון עם נפח סופי של 10 עד 15 μL לכל מדגם. הערה: העמסת יתר של חלבון יכולה לגרום לכהיית.</li>
	<li>הפעל ג'ל ב 85 V עבור 30 דקות, ואז 150 V עבור 2 h. הערה: בהתחשב בהבדלים בציוד ובקווי התאים המשמשים מעבדות שונות, שינויים קלים בריכוז של דגימות חלבונים, מתח וזמן ריצה עשויים להתאים למיטוב פרוטוקול זה. הפחתת הפעלה מראש והפעלת מתח בעת הגדלת זמן הריצה עשויה לסייע בשיפור הרזולוציה של דיימר ועקביות התוצאה.</li>
	<li>להשרות את ג'ל ב SDS פועל מאגר (25 mM Tris pH 8.3, 250 מ"מ גליצין, 0.1% SDS) עבור 30 דקות ב RT. הערה: . אין צורך בעצבנות לעיתים, עוצמת הלהקה לא תהיה פרופורציונלית לכמות החלבון שנטענה עקב העברה לא יעילה בנוכחות הדאוקסיכוליום (DOC), המשפיעה בעיקר על צורת monomeric של IRF5. הספגת הג ב-SDS המפעיל מאגר לפני ההעברה פותרת בעיה זו. . הג'ל שברירי לטפל בזהירות קיצונית מלמטה (כלומר, אחוז גבוה יותר) בקצה של ג'ל.</li>
</ol>4. ניתוח כתמי חיסוני של IRF5
<ol><li>הפעל את ממברנה divinylidene (PDVF) על ידי המתנול במשך כ 5 דקות.</li>
	<li>לחתוך בפינה אחת של הקרום כדי לציין את כיוון. להרכיב את הכריך להעביר בהתאם לסדר רציפים מפורט בפרוטוקול של היצרן עם טיפול נוסף כדי להבטיח כי אין בועות אוויר לכודים בתוך.</li>
	<li>הצב את קלטת ההעברה לתוך המיכל והעבר ב -20 וולט עבור 1 h על הקרח. הערה: לבצע את כל incubations ושוטף בצעדים הבאים עם נדנדה.</li>
	<li>להסיר את קרום מתוך הקלטת עם מלקחיים פלסטיק לאחר השלמת ההעברה. לחסום את הממברנה במאגר חסימת (TBS) עבור 45 דקות ב RT. הערה: ניתן להשתמש במאגר TBS עם 5% BSA גם כמאגר חסימה.</li>
	<li>מודדת את הקרום עם הנוגדן העיקרי המפורטים בטבלה 1. לשטוף את הקרום עם מאגר כביסה 1 x TBST (20 מ"מ טריס, pH 7.0, 150 מ"מ הנאל ו 0.1% רצף 20) עבור 3 דקות בזמן נדנדה. חזור על השטיפה 2 x.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>דידליזציה</td>
			<td>מאגר דיילוטור</td>
			<td>דגירה</td>
			<td>ערות</td>
		</tr>
<tr>
<td>נוגדן ראשוני (Anti-IRF5)</td>
			<td>1/1000</td>
			<td>מאגר חסימה של TBS</td>
			<td>לינה בשעה 4 ° צ' או 2 שעות בשעה</td>
			<td>נוגדנים מדולל ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים אם מאוחסן ב 4 ° c בנוכחות של 0.02% נתרן azide.</td>
		</tr>
<tr>
<td>נוגדן משני (אנטי ארנבת)</td>
			<td>1/10000</td>
			<td>מאגר חסימה של TBS</td>
			<td>45 דקות ב-RT</td>
			<td>נוגדנים מדולל ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים אם מאוחסן ב 4 ° c בנוכחות של 0.02% נתרן azide.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
הערה: דילול צריך להיות ממוטב כפי שהוא משתנה בין יצרנים.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מפרטים של הנוגדנים הנמצאים בשימוש בהליך החיסוני.
<ol start="6"><li>מודדת את הקרום עם הנוגדן המשני המפורטים בטבלה 1. לשטוף את הקרומים עבור 3 דקות ב-1 x TBST מאגר כביסה. חזור על השטיפה 2 x.</li>
	<li>סרוק את האבן החשופה באמצעות מערכת תיעוד מתאימה של ג'ל.</li>
</ol>

<ol><li>Takaoka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+role+of+IRF-5+in+the+gene+induction+programme+activated+by+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors.</a> Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).</li>
<li>Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKKbeta+is+an+IRF5+kinase+that+instigates+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).</li>
<li>Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interferon+%28IFN%29+Class+of+Cytokines+and+the+IFN+Regulatory+Factor+%28IRF%29+Transcription+Factor+Family%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).</li>
<li>Clark, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+Promoters+of+IRF5+Respond+Distinctly+to+Stimuli+and+are+Affected+by+Autoimmune-Risk+Polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms.</a> Frontiers in Immunology. 4, 360(2013).</li>
<li>Bo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis+patient+antibodies+highly+recognize+IL-2+in+the+immune+response+pathway+involving+IRF5+and+EBV+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1789(2018).</li>
<li>Duffau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+Inflammatory+Arthritis+by+Interferon+Regulatory+Factor+5+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatolpgy%22%5BJournal%5D)">Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model.</a> Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).</li>
<li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf5-deficient+mice+are+protected+from+pristane-induced+lupus+via+increased+Th2+cytokines+and+altered+IgG+class+switching%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching.</a> European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).</li>
<li>Richez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN+regulatory+factor+5+is+required+for+disease+development+in+the+FcgammaRIIB-%2F-Yaa+and+FcgammaRIIB-%2F-+mouse+models+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).</li>
<li>Tada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+is+critical+for+the+development+of+lupus+in+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice.</a> Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).</li>
<li>Weiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+controls+both+acute+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IRF5 controls both acute and chronic inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).</li>
<li>Schoenemeyer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon+regulatory+factor%2C+IRF5%2C+is+a+central+mediator+of+toll-like+receptor+7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).</li>
<li>Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regulation+of+MyD88-activated+interferon+regulatory+factor+5+by+K63-linked+polyubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).</li>
<li>Lopez-Pelaez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+IKK%CE%B2-catalyzed+phosphorylation+of+IRF5+at+Ser462+induces+its+dimerization+and+nuclear+translocation+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).</li>
<li>McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localisation+and+trafficking+of+Toll-like+receptors%3A+an+important+mode+of+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+Immunology%22%5BJournal%5D)">Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation.</a> Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).</li>
<li>Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-dependent+and+TLR-independent+pathways+of+type+I+interferon+induction+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity.</a> Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).</li>
<li>Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells%3A+sensing+nucleic+acids+in+viral+infection+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).</li>
<li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+Receptors+and+Their+Crosstalk+with+Other+Innate+Receptors+in+Infection+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity.</a> Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).</li>
<li>Liu, Z., Davidson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+lupus-a+new+understanding+of+pathogenesis+is+leading+to+clinical+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances.</a> Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).</li>
<li>del Fresno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-beta+production+via+Dectin-1-Syk-IRF5+signaling+in+dendritic+cells+is+crucial+for+immunity+to+C.+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans.</a> Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+Levels+of+Interferon+Regulatory+Factor+5+%28IRF5%29+and+Related+Inflammatory+Cytokines+Associated+with+Severity%2C+Prognosis%2C+and+Causative+Pathogen+in+Patients+with+Community-Acquired+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Science+Monitor%22%5BJournal%5D)">Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia.</a> Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+recognition+by+GEF-H1+controls+IKKepsilon+mediated+activation+of+IRF5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5.</a> Nature Communications. 10 (1), 1349(2019).</li>
<li>Almuttaqi, H., Udalova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+targeting+IRF5%2C+a+key+regulator+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation.</a> FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).</li>
<li>Chow, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+Overlapping+Immune+Programs+Regulated+by+IRF3+and+IRF5+in+Plasmacytoid+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells.</a> The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).</li>
<li>Cheng, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Activation+of+IFN+Regulatory+Factor+%28IRF%29-3+and+IRF-5+Transcription+Factors+during+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection.</a> The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).</li>
<li>Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+interferon+regulatory+factor+5+by+site+specific+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation.</a> PLoS One. 7 (3), 33098(2012).</li>
<li>Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRM1-dependent+nuclear+export+pathway+is+involved+in+the+regulation+of+IRF-5+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).</li>
<li>Stone, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+activation+in+monocytes+of+systemic+lupus+erythematosus+patients+is+triggered+by+circulating+autoantigens+independent+of+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons.</a> Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).</li>
<li>De, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell-Intrinsic+Role+for+IRF5+in+TLR9%2FBCR-Induced+Human+B+Cell+Activation%2C+Proliferation%2C+and+Plasmablast+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1938(2017).</li>
<li>Fabie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF-5+Promotes+Cell+Death+in+CD4+T+Cells+during+Chronic+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection.</a> Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).</li>
<li>Cushing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRAK4+kinase+activity+controls+Toll-like+receptor-induced+inflammation+through+the+transcription+factor+IRF5+in+primary+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).</li>
<li>Li, C., Arakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+protein+analysis%3A+Bovine+serum+albumin+as+a+model+protein%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).</li>
<li>Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+dependent+separation+of+modified+and+hybrid+ferritin+in+native+PAGE%3A+Impact+of+lysine+104%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).</li>
<li>Reynolds, J. A., Tanford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Dodecyl+Sulfate+to+Proteins+at+High+Binding+Ratios+-+Possible+Implications+for+State+of+Proteins+in+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002(1970).</li>
<li>Manning, M., Colon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+protein+kinetic+stability%3A+resistance+to+sodium+dodecyl+sulfate+suggests+a+central+role+for+rigidity+and+a+bias+toward+beta-sheet+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure.</a> Biochemistry. 43 (35), 11248-11254 (2004).</li>
<li>Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKKalpha+negatively+regulates+IRF-5+function+in+a+MyD88-TRAF6+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway.</a> Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).</li>
<li>Paun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+murine+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF-5%29+and+its+role+in+the+innate+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).</li>
<li>Yasuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+dendritic+cell+type+I+IFN+production+induced+by+human+IgG-RNA+immune+complexes+is+IFN+regulatory+factor+%28IRF%295+and+IRF7+dependent+and+is+required+for+IL-6+production%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).</li>
<li>Steinhagen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF-5+and+NF-kappaB+p50+co-regulate+IFN-beta+and+IL-6+expression+in+TLR9-stimulated+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells.</a> European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).</li>
<li>Gratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+production+induced+by+Streptococcus+pyogenes-derived+nucleic+acids+is+required+for+host+protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345(2011).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הפרוטוקול המתואר כאן הוא דף יליד שונה אשר מבדיל הן monomeric ו dimeric צורות של אנדודוגני IRF5. היו מחקרים מעטים דיווחו על זיהוי של הפעלה אנדודוגני IRF5 באמצעות זרימת הדמיה מיוחדות cy, 27,25,28,30. פרוטוקול זה משתמש בטכניקה נפוצה וריאגנטים שגרתי וכלים כדי להעריך את מצב ההפעלה האנדודוגני IRF5 במהלך האירועים המוקדמים של ההפעלה. הפרוטוקול מהווה שינויים פשוטים בפרוטוקול המקורי של עמוד מקורי כדי לאפ...

אינטרפרון התקינה פקטור 5 (IRF5) הוא מווסת שעתוק חשוב המשחק תפקיד בולט בוויסות התגובה החיסונית, במיוחד לשחרור ציטוקינים פרו דלקתיים וסוג אני הפרעות (ifns)1,2 ,3. Misregulation של IRF5 הוא גורם תורם במחלות אוטואימוניות רבות, כפי שניכר על ידי פולימריות שונות ב IRF5 לוקוס כי הם קשורים עם זאבת מערכתית אריתסוס, טרשת נפוצה, דלקת מפרקים שגרונית, וכו '4, . חמש,שש,שבע,שמונה,9,10 לכן, שיטת גילוי חזקה עבור מצב הפעלה אנדודוגני IRF5 היא חיונית להבנת מסלולים הרגולציה ואת ההשפעה של הזרם של IRF5 בהקשר הסלולר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית.
IRF5 הוא מבוטא באופן קונסטיטולי ב מונוציטים, תאים דנדריטים (DCs), B תאים, ו מקרופאגים1,11. כמו בשאר משפחת IRF מרכיבי התעתיק, IRF5 שוכנת בציטופלסמה במצבו הנסתר. עם ההפעלה, IRF5 הוא זרחנות וצורות הומודימרס, אשר לאחר מכן העברה לתוך הגרעין ולאגד אלמנטים הרגולציה ספציפיים של גנים קידוד סוג I IFNs והפרו-דלקתיות ציטוקינים, בסופו של דבר גרימת הביטוי של גנים אלה1 ,2,11,12,13. IRF5 מווסת את התגובות החיסוניות המורמות במורד של קולטני שונים כמו שיחות (tlrs), כגון TLR7, tlrs 8, ו-tlrs 9, אשר מותאמים לאנזומים ומשתמשים ב-MyD88 עבור איתות1,11,14. אלה tlrs לזהות בעיקר חומצות גרעין זרות מינים כגון רנ א אחד (ssrna) ו-DNA הסרת מתילated של ה-CpG כי הם סימפטומים של זיהום15,16,17,18. IRF5 הוכח לווסת את התגובות החיסונית נגד חיידקים, נגיפי, ופטריות זיהומים19,20,21. בהתחשב IRF5's תפקיד המשפיע והמגוונים במערכת החיסונית, שיפור או לחות פעילות IRF5 יכול לשמש כשדרה הרומן לפיתוח של סוכנים טיפוליים22. מכאן, זה קריטי לפתח פרוטוקול כדי לפקח על מצב ההפעלה של אנדודוגני IRF5 כדי לאפשר חקירה יסודית של מסלולים ומנגנונים המסדירים פעילות IRF5 סוגי תאים שונים.
למיטב הידע שלנו, לא שיטת ביוכימיה או ג'ל אלקטרופלטית עבור הפעלה אנדודוגני IRF5 פורסמה לפני הפיתוח של פרוטוקול זה. זירחון הוכח להיות צעד ראשון חשוב של הפעלה IRF5, והנוגדן IRF5 מסוים זרחן פותחה כי הוביל גילוי ואישור של סרין שאריות חשוב עבור IRF5 פעילות13. עם זאת, בעוד הנוגדן מזהה בבירור IRF5 זרחתי כאשר immunoprecipitated או overexpressed יטא23, זה לא מצליח לזהות IRF5 זרחון בתאים שלמים בידינו (נתונים לא מוצגים). דימרזציה היא השלב הבא של IRF5 הפעלה, ומחקרים חשובים רבים עד כה בחקירת שלב זה הסתמך על ביטוי יתר של אפירופה-מתויג IRF5, לעתים קרובות בסוגי תאים לא רלוונטיים שאינם מבטאים בדרך כלל IRF511,12 ,24,25. מחקרים קודמים הראו כי dimerized IRF5 לא תמיד לאתר את הגרעין ולכן הוא לא בהכרח הופעל באופן מלא25,26. שיטת התאמה לוקליזציה גרעינית IRF5 פותחה כדי להעריך את IRF5 ההפעלה על ידי זרימת הדמיה cy try27. השיקול הזה הוחל במחקרים שהיו חיוניים להבנת פעילות IRF5, במיוחד בסוגי תאים ראשוניים או נדירים28,29 , ומתקדם מאוד את הידע בתחום. עם זאת, שיטת הפעולה נשענת על כלי מיוחד שאינו זמין באופן נרחב לחוקרים. יתר על כן, לעתים קרובות יש צורך לחקור את הצעדים הראשוניים של ההפעלה תוך מנתח מסלולים IRF5 רגולציה וזיהוי הרגולטורים במעלה ורכיבי מסלול. מחקר זה מספק שיטת ביוכימית איתנה ואמינה לאירועי ההפעלה המוקדמים של IRF5 שניתן לבצע במעבדות המצוידות בכלים ביולוגיים מולקולריים. הפרוטוקול המתואר כאן יהיה שימושי מאוד בחקירת מסלולים ומנגנונים של פעולות IRF5, במיוחד כאשר בשילוב עם אורתוגונאליות מספר כגון הדמיה של זרימת ההדמיה ניתוח ציטוטומטשל IRF5 לוקליזציה גרעינית23, 27,28,30.
פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (עמוד מקורי) היא שיטה נפוצה לניתוח מתחמי חלבונים31,32. בניגוד נתרן dodecylsulfate אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (sds-page), דף יליד מפריד חלבונים על בסיס צורתם, גודל, וטעינה. זה גם שומרמבנה החלבון המקוריללא הדציה31,33,34,35. הפרוטוקול המוצג מנצל תכונות אלה של דף מקורי ומזהה הן monomeric ו dimeric צורות של IRF5. שיטה זו חשובה במיוחד לגילוי אירועים הפעלה מוקדמת, כי אין נוגדן המתאים מסחרית זמין שיכול לזהות זרחני IRF5. בעבר, מספר מחקרים שפורסמו השתמשו בעמוד יליד כדי להעריך IRF5 dimerization. עם זאת, רוב המחקרים תלויים בביטוי יתר של אפידוגני-מתויג IRF5 לנתח מצב הפעלה2,13,24,36,37 . עבודה זו מציגה פרוטוקול צעד אחר צעד לניתוח אנדוגניים IRF5 dimerization באמצעות שינוי בטכניקה מקורית של דף מקורי (pDC) האדם תא דנדריטי, שם הפעילות IRF5 הוכח קריטי עבור תפקידה1, 38,39,40. אותה טכניקה הוחלה על קווי תאים אחרים23.

<table><tbody><tr><td></td><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies, HK</td> 21985023 <td></td></tr><tr><td>ספק כוח 300 W/250 V 230 V AC</td><td>Life Technologies, HK</td><td>PS0301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IRF5 Anti-IRF5</td><td>Bethyl Laboratories, ארה"ב</td><td>A303-385</td><td></td></tr><tr><td>BIOSAN Rocker Shaker (בטוח בחדר קירור)</td> <td>EcoLife, HK</td><td>MR-12</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4x 100 מ"ל</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>15575020</tr><tr><td>גליצרול 500 מ"ל</td><td>Life Technologies</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15527013</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG DyLight 800 נוגדן מצומד</td><td>LAB-A-PORTER/Rockland, HK</td><td>610-145-002-0.5</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG DyLight 800 נוגדן מצומד</td><td>LAB-A-PORTER/Rockland, HK</td><td>611-145-002-0.5</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז עצור (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, HK</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td><td>Gene Company, HK</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>מיני טנק משולב מודול כתמים; מודול העברה, אביזרים</td><td>Life Technologies, HK</td><td>NW2000</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% ג'לים, ערכת 10 בארות</td><td>Life Technologies, HK</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE מאגר ריצה 20x</td><td>Life Technologies, HK</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE מאגר דגימה 4x</td><td>Life Technologies,</td> חלופת HK <td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NP-40, נונילפניל פוליאתילן גליקול</td><td>פח תלוי/ Calbiochem, HK</td><td>#492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS 7.4</td><td>Life Technologies, HK</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF)</td><td>ביו-גן/Merck Millipore,</td><td></td> ערכת בדיקת חלבון IPFL00010 <td></td></tr><tr><td>HK II (BSA)</td><td>Bio-Rad, HK</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen, HK</td><td>tlrl-r848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies, HK</td><td></td><td></td>61870127</tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>ThermoFisher</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט &ge; 97% (טיטרציה)</td> <td>תליית פח/סיגמא, HK</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>20</td><td>תליית פח/סיגמא, HK</td><td>#P9416-100 מ"ל</td><td></td></tr></tbody></table>

מקורי פוליאקרילאמיד ג'ל לטיפול חיסוני כתמי באנליזה של אנדודוגני irf5 דימרזציה

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization

אינטרפרון פקטור 5 (IRF5) הוא גורם שעתוק מפתח לוויסות התגובה החיסונית. הוא מופעל במורד במורד הזרם של שיחת כמו מיאלואידית קולטן מיאלואיד התגובה הראשונית גן 88 (TLR-MyD88) איתות מסלול. ההפעלה IRF5 כרוכה זירחון, דימרזציה, והטרנסלוקציה הבאים מן הציטופלסמה לתוך הגרעין, אשר בתורו מעורר את הביטוי הגנטי של ציטוקינים פרו דלקתיים שונים. שיטת זיהוי עבור הפעלת IRF5 חיונית ללימוד פונקציות IRF5 ומסלולים רלוונטיים. מאמר זה מתאר את הערך החזק לזיהוי הפעלה IRF5 אנדודוגני ב-CAL-1 (pDC) של תא הדנדריטי האנושי. הפרוטוקול מורכב מתוך שונה מבחינה אלקטרופורזה בלתי מבוקר שיכול להבחין IRF5 בצורות המונומר שלה דיימר, ובכך לספק גישה במחיר סביר ורגיש לנתח IRF5 הפעלה.

החיסוני (ליברות) עם נוגדן anti-IRF5 בוצעה על התאים CAL-1 בלתי מגורה או מגורה עם 1 μg/mL R848 עבור 2 h (איור 1). ליוטים סלולריים היו מוכנים, והדף המקורי בוצע. בתאי CAL-1 הממריצים, IRF5 זוהתה כלהקה יחידה בעמוד המקור, המתאימה לצורתו של monomeric. עם הטיפול בתאים CAL-1 עם R848 עבור 2 h, רמת IRF5 מונומר ירד עם עלייה במקביל בהצטברות של להקה הגירה לאט שתאמו את הצורה dimeric של IRF5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_uplo...

שיטת כתמי האבן המערבית המקומית לניתוח מקדם אינטרפרון הרגולציה האנדוגניים מהווה 5 דימרזציה בשורת התא הדנדריאיד של CAL-1 מתוארת. ניתן להחיל פרוטוקול זה גם על קווי תאים אחרים.

מקורי פוליאקרילאמיד ג'ל לטיפול חיסוני כתמי באנליזה של אנדודוגני IRF5 דימרזציה

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like ...

פרוטוקול זה משתמש בטכניקה נפוצה יחד עם רייגנטים וכלים שניתן לרכוש באופן מסחרי כדי להעריך הפעלת IRF5 אנדוגני במהלך האירועים המוקדמים של גירוי. זה יכול בקלות להיות מיושם על ביולוגיה IRF5 מבחן בהקשר תאי אחר. בעוד ש-PAGE מקורי הוא טכניקה נפוצה, השגת תוצאות ברורות, חזקות, ניתנות לפרשנות ושחזור יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית.שימוש במאגר ריצה מסחרי ובמערכת ג'ל מסייע למזער את השונות. ותשומת לב לפרטים היא חיונית, וניסיון הוא המפתח להצלחה בהשגת תוצאות טובות. פרוטוקול דף מקורי זה שהשתנה כרוך בשלבים רבים עם פרטים עדינים שהם המפתח להצלחה.הדגמה חזותית יכולה להראות את הפרטים האלה זה יהיה מועיל לחוקרים. שמור על תרבות התאים CAL-1 בבקבוק T75 ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, עם מדיום RPMI 1640 מלא. כאשר מוכנים לעורר את התאים, להעביר אותם צינור חרוט 50 מיליליטר צנטריפוגה אותם ב 200 x g במשך חמש דקות.הסר את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולה במדיום כדי לקבל השעיה הומוגנית תא יחיד. לאחר מכן חשבון התאים עם hemocytometer, ולזרע אותם בצפיפות של 1, 000, 000 תאים לגם בצלחת שש באר עם ארבעה מיליליטר של מדיום מחומם מראש בכל באר. דגירה התאים במשך 20 עד 24 שעות כדי לאפשר את הקונפדרציה להגיע 90 עד 95%למחרת, לעורר את התאים על ידי הוספת ארבעה microliters של מיליגרם אחד למיליליטר R848 ל הבאר, הקפדה להשאיר שליטה היטב עם תאים ולא טיפול R848.בעדינות לנענע את הצלחת מצד לצד כדי לפזר באופן שווה את R848, ולאחר מכן דגירה התאים במשך 2 עד 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, להעביר את המתלים התא מהצלחת לתוך צינורות צנטריפוגה 5 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 200 x g במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS.העבר את ההשעיה התא לתוך צינור 1.5 מיליליטר, ולסובב אותו למטה ב 12, 000 x g במשך 30 עד 60 שניות ב 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להסיר בזהירות את העל טבעי. מכינים את חיץ התיזה לפי הוראות כתב היד, ולשמור אותו על קרח עד מוכן לשימוש. להשעות מחדש את גלולת התא ב 30 מיקרוליטרים של חיץ תיזה קר כקרח, ו pipette למעלה ולמטה לערבב.ואז להחגירה את הצינור על קרח במשך 15 עד 20 דקות. להבהיר את lysate על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 x גרם במשך 15 עד 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהעביר את העל טבעי צינור 1.5 מיליליטר מקורר מראש, הקפדה לשמור את התמציות על קרח בכל עת. לאחר מכן, למדוד את ריכוז החלבון באמצעות ברדפורד Reagent.הכינו את מאגרי האלקטרופורזה בתא העליון והתחתון בהתאם לכיווני כתב היד, ושטוף ג'ל PAGE מקורי 3-12% ביסודיות במים, מבלי לעוות את הבארות יש לנקוט טיפול נוסף בעת הטיפול בנתרן deoxycholate. PPE להגנה כגון חלוק מעבדה, משקפי בטיחות ומסכה נדרשים לטיפול בכימיקל. לאחר מכן, להגדיר את הג'ל לתוך מיכל ג'ל מיני, להסיר את המסרק, להוסיף את מאגרי אלקטרופורזה מוכן העליון והתחתון התא, ולהפעיל אותו מראש בחדר קר 4 מעלות צלזיוס או על קרח ב 150 וולט במשך 30 דקות.בינתיים, הכינו את הדגימות לטעינה על ידי ערבוב החלבונים התאיים על הקרח עם חיץ מדגם מקורי פי 4. לאחר השלמת הריצה מראש, יש לטעון 10 עד 15 מיקרוגרם חלבון לכל באר, ולהפעיל את הג'ל במשך 30 דקות ב-85 וולט, ולאחר מכן שעתיים ב-150 וולט. לאחר מכן, להשרות את הג'ל SDS פועל חיץ במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.הפעל את קרום דיפלאוריד פוליווינילידן על ידי השרייתו במתנול במשך כחמש דקות. בצע חתך בפינה אחת של הממברנה כדי לציין את האוריינטציה שלה, ולהרכיב את כריך ההעברה על פי פרוטוקול היצרן. מניחים את קלטת ההעברה לתוך הטנק ומעבירים ב 20 וולט במשך שעה אחת על הקרח.לאחר מכן להסיר את הממברנה מן הקלטת עם מ forceps פלסטיק ולחסום את הממברנה בחסימת חיץ בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות על שייקר נדנדה. לאחר מכן, הדגירה את הממברנה עם הנוגדן העיקרי ב 4 מעלות צלזיוס לילה או בטמפרטורת החדר במשך שעתיים ולשטוף אותו עם חיץ כביסה 1XTBST במשך שלוש דקות תוך נדנדה. לאחר מכן הדגירה את הממברנה עם הנוגדן המשני שוב באמצעות חיץ כביסה 1XTBST בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות, חוזר על לשטוף.לאחר מכן סרוק את הכתם באמצעות מערכת תיעוד ג'ל מתאימה. באמצעות פרוטוקול זה, תאי CAL-1 שהיו מגורים או לא גירוי עם R848 נותחו עם immunoblot. בתאי CAL-1 לא מנומקים, IRF5 זוהה כרצועה בודדת בדף המקורי המתאימה לצורתו המונומרית.עבור התאים מגורה, רמת מונומר IRF5 ירד, בעוד רמת העמעום גדל. אימונובלו עם נוגדן נגד IRF5 בוצע על IRF5 over-expressing 293 תאי T מומרים עם מבנים שונים. לא זוהה IRF5 בשליטה הלא פתורה, המדגימה את הספציפיות של הנוגדן נגד IRF5.רצועה אחת המתאימה ל- IRF5 מונומרי זוהתה רק ב- IRF5 של 293 תאי T. כאשר מבנים קידוד IRF5 הפעלת חלבונים נותבו במשותף, רצועה נודדת לאט המתאים הצורה dimeric של IRF5 הופיע. עם זאת, NMDA5, חלבון הקשור RIG-I, לא לגרום עמעום IRF5.השימוש בג'לים הדרגתיים של ביס-טריס הוא חיוני, ככל הנראה בשל ה- pH הספציפי וההרכב הכימי של מערכות אלקטרופורטיות ג'ל זה שאיפשרו הפרדה של צורות מונומריות ודימריות של IRF5. כמו כן, lysing ושמירה על lysates התא במאגר מדגם מקורי שאינו denaturing שומרת על מבני חלבון מקוריים. כאן השתמשנו באחד זמין מסחרית המותאמת לחומצות דף מקוריות.שיטה נוספת שמחמיא מאוד עם זה היא, היא לנצל את מערכת cytometry זרימת הדמיה ImageStream כדי להעריך טרנסלוקציה גרעינית IRF5, שהוא החומר כי בהפעלת IRF5 לאחר עמעום. בשילוב עם הפרוטוקול שלנו, הוא משמש כסוג אחר של בדיקה כדי לאמת את השלבים המעורבים בהפעלת IRF5. בהיותו רגולטור מפתח של התגובה הדלקתית, IRF5 ממלא תפקיד חשוב בזיהום וחסינות, מחלות אוטואימוניות, סרטן ומחלות רבות אחרות החשובות לבריאות האדם.ישנם גם מאמצים בפיתוח טיפולים למקד IRF5 וגורמי שעתוק הקשורים. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים בתחומים מגוונים להבין ולבדיקה ביולוגיה של IRF5.

native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-immunoblot-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כמותי, תפוקה גבוהה, בזמן אמת, וכן ללא תווית זיהוי biomolecular (דנ"א, חלבונים, וכו ') על...

Biomolecular איתור העסקת ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS)

הגנה מולדת לנגיף מופעלות על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs). שני PRRs cytoplasmic RIG-I ו לאגד PKR כדי RNAs הנגיפי החתימה, שינוי קונפורמציה, oligomerize, ולהפעיל את איתות אנטי. שיטות מתוארות המאפשרות לפקח על מיתוג קונפורמציה וoligomerization של PRRs cytoplasmic אלה בנוחות.

הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה RIG-I ו PKR ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד Native

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

כאן אנו מתארים הליך המאפשר ניתוח מפורט של ההפעלה התלויה בזרחון של גורם השעתוק IRF3. זה מושג באמצעות שילוב של SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה ו-native-PAGE בשילוב עם אימונובלוט באמצעות נוגדנים מרובים של פוספו-ספציפיות.

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

אנו מתארים את הבידוד של מטריצה חוץ-תאית לבבית מעכברי ביקורת C57Bl/6J, עכברים בעלי עור מתוח ועכברים בעלי עור מתוח שטופלו בפפטיד מעכב IRF5. אנו מתארים גם את מחקרי הרחבת כלי הדם על כלי הדם המבודדים מ-C57Bl/6J, עכברים בעלי עור מתוח ועכברים בעלי עור מתוח שטופלו בפפטיד מעכב IRF5.

Vasodilation של כלי מבודד והבידוד של מטריקס של עכברים צמוד עור

מוצגים כאן שתי שיטות מחקר של אינטראקציה עם נוגדן מבוססי חלבון: immunofluorescence ו- immunoprecipitation. טכניקות אלה מתאימים ללמוד הפיזי אינטראקציות בין חלבונים עבור גילוי הרומן מרכיבי הסלולר איתות המסלולים, הבנה חלבון דינמיקה.<br...

חקר אינטראקציות חלבון במחקר Autophagy

Integrase retroviral רקומביננטי oligomers DNA מחקה מסתיים DNA נגיפי יכול יוצרים קומפלקס פעיל enzymatically המכונה של intasome. Intasomes עשוי לשמש ללימודי הביוכימי, מבניים קינטי. פרוטוקול זה מפרט כיצד להרכיב ולטהר intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס.

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות להבהרת תפקודם של חלבוני המטרה, וקו-אימונומשקעים (co-IP) יכולים לאשר בקלות PPIs. הדבקנו באופן זמני פלסמיד המקודד חלבון מתויג אפיטופ לתאי HEK-293 ופיתחנו שיטת משקעים חיסוניים כדי לאשר בקלות את הקישור של שני חלבוני מטרה.

משקעים חיסוניים עם ג'ל זיקה נגד תג אפיטופ לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

למדו ניתוח דימריזציה של IRF5 באמצעות Western blot נייטיב בקו תאי CAL-1. פרוטוקול זה מאפשר חקר הפעלת IRF5 אנדוגני בהקשרים תאיים שונים עם שחזוריות גבוהה.

מקורי פוליאקרילאמיד ג'ל לטיפול חיסוני כתמי באנליזה של אנדודוגני IRF5 דימרזציה

גלה סרטונים נוספים