בחוקת חוץ גופית דפוסי יצירת קשר מרחבי המרחב עם מבודדים העובר בלייסטומרים וחרוזי קלקר

קומפלקס רקמות רב-תאיות, פרוטוקול זה מחדש את ההתנהגות התאית בצורה פשוטה יותר. דבר אחד הוא טכניקה זו כדי ללמוד את היחסים הישירים בין פרוטונים מוליכים הסלולר תגובה הסלולר. פרוטוקול זה משתמש ב-polystyrene פונקציונלי מבחינה כימית כדי ליצור מחדש את הפרוטונים של מוליכים תאיים.

ניתן לחתוך את חרוזים עם כל פרוטונים של עניין, כדי לבדוק את ההשפעות שלהם על התגובה התאית. השתמשנו בשיטה זו באלגנטיות C על עוברי עכבר. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות זקוף למחקרים של אורגניזמים רחבים.

כמו עוברים שבירים לאחר טיפול כלוריט מלא גבוה, תרגול משמעותי נדרש לפני אחד יכול לבודד בהצלחה blastomere. הדגמה חזותית תספק הבנה טובה יותר של האופן שבו יש לטפל נימי במהלך שיטות בידוד blastomere. כדי להתחיל, לשקול 10 מיליגרם של בחנורי פוליסטירן שונה קרבוקסילאט בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.

הוסף מיליליטר אחד של חיץ MES לתוך הצינור כדי לשטוף. מערבולת הצינור לערבב את חרוזים. לסובב את הצינור במשך 60 שניות ב 2000XG באמצעות צנטריפוגה ספסל העליון.

תכסה את העל-טבעי על-ידי צבת בזהירות את המאגר. לשטוף את חרוזים שוב עם מיליליטר אחד של חיץ MES. לאחר הכביסה, להוסיף מיליליטר אחד של חיץ MES המכיל 10 מילי גרם של EDAC לתוך הצינור, כדי להפעיל את קבוצות קרבוקסיל פני השטח.

מערבולת הצינור לערבב את חרוזים. לסובב ולהדרור את הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לסובב את חרוזים במשך 60 שניות ב 2000XG.

השלך את העל-טבעי על-ידי פיתוק זהיר של המאגר, ושטף במיליליטר אחד של PBS. Vortex הצינור לערבב את חרוזים ולחזור לשטוף PBS עוד פעם אחת. הכן מיליליטר אחד של אחד, 10, 100, וסדרת דילול של אלף של רודמין אדום-X מתסכול המניות 0.65 מיליליטר רודמין אדום-X.

פיפטה 20 מיקרו ליטרים של חרוזים לתוך כל צינור דילול סדרתי. לסובב ולהדרור את הצינורות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את חרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS.

לאחר הכביסה, מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לתוך הצינורות ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס עד שישה שבועות. בדוק את עוצמת הפלואורסצנטיות של חרוזים תחת מיקרוסקופ המשמש להדמיה חיה. החזק כל קצה של מיקרו נימי בקיבולת של 10 מיקרו ליטר עם יד ימין ושמאל.

משוך את המיקרו נימי לכיוון שני הקצוות כדי להחיל מתח ולהביא את מרכז נימי מעל צורב לעשות שני נימים שנמשכו ביד. מתחת למיקרוסקופ החותך, חותכים את קצות נימי היד עם מלקחיים. הפוך את שני גדלי פתיחת קצה בערך פעמיים, וגם פעם אחת את אורך הגישה הקצרה של עוברי C-אלגנטיות להעברת העובר והסרת קליפת הביצה בהתאמה.

חבר את נימי משך לתוך מנגנון פיפסטינג הפה. פיפטה 45 מיקרו ליטרים של תותב מלחי ביצים על באר של מגלשה מרובת היטב. מניחים 5 עד 10 בוגרים C-אלגנטיות על הטוב.

כדי להשיג C-אלגנטיות מוקדמת עוברים לחתוך מבוגרים לחתיכות על ידי מיקום שני מחטים מימין ומשמאל של הגוף של C-Elegance, ו מחליק את המחטים על פני אחד את השני. פיפטה 45 מיקרו ליטרים של פתרון hypochlorite על באר ליד פתרון מלח ביצה המכיל היטב פיפטה 45 מיקרו ליטר של מדיום הצמיחה של שלטון על שלוש הבארות הבאות. להעביר שלב תא אחד ועוברים בשלב שני תאים מוקדם לתוך פתרון hypochlorite על ידי פיפטה הפה עם פתח בגודל גדול יותר ולחכות 40 עד 55 שניות.

לשטוף את העוברים על ידי העברתם לתוך שלוש הבאר עם מדיום הצמיחה של שלטון. עם 1-2 שניות בכל אחת משתי בארות הראשונות. באמצעות נימי מצויר ביד עם פתח בגודל קטן יותר בזהירות לחזור pippetting העובר להסרת קליפת ביצים.

לאחר מכן, פיפטה רציפה עם נימי מצויר ביד כדי להפריד את בלאסטרים עובריים שלב שני תאים. לאחר הסרת קליפת הביצה, למזער את הכוח pippetting העוברים למעלה ולמטה כדי למנוע פרץ. הכינו תא הדמיה על ידי הנחת כיסוי על מחזיק כיסוי וקלטו את קצות הכיסוי כדי לייצב אותו.

הפוך את מחזיק המכסה, וצייר עיגול על המכסה בעט הידרופובי. הוסף את מדיום הצמיחה של שלטון בתוך המעגל שצויר על ידי הסמן ההידרופובי, והעבר את הבליסומר המבודד לתא ההדמיה בתוך המעגל. עכשיו, לוותר על נפח קטן של חרוזים פונקציונליים כימית על לוח המכסה באמצעות נימי מצויר ביד עם הפתח הגדול יותר.

לשלוט על המיקום של חרוזים על ידי נושבת לתוך נימי מצויר ביד עד חרוזים לצרף blastomere מבודד. הר את הכיסוי כדי למנוע אידוי של מדיום ולבצע הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ הפוך. במחקר זה, אות פלואורסצנט מן החרוז שטופלו 0.005 מיקרו גרם למילי ליטר רודאמין אדום X Succinimidyl אסתר עבור הזן מהונדס המבטא GFP miosin-2 ו M-cherihistone היה חלש מדי.

מצד שני, אות הפלואורסצנט מהחרוזים שטופלו בחמישה מיקרו-גרם למיליליטר רודאמין רד-אקס סוצימיליל אסתר היה חזק מדי. הריכוז של רודאמין אדום X Succinimidyl אסתר ב 0.5 מיקרו גרם למילי ליטר היה אופטימלי עבור זן מהונדס מסוים זה. במהלך ההדמיה החיה זוהה מישור שבו שני centrosomes היו מיושרים אנכית.

המטוס עם זווית פלוס או מינוס 90 מעלות של המטוס הזה הוא מישור ציר. הזווית של כיוון ציר יחסית לממשק מגע תא / חרוז לאחר cytokinesis מראה כי שני תאי הבת היו מחוברים חרוז בשורה העוברת שני המראות מגע שימש ככיוון מגע. צריך ללמוד כיצד עוברים וקליפת ביצים מגיבים לכוחות חיצוניים מסוימים המיושמים על ידי פיפט הפה.

תיאורטית, כל תגובה תאית ניתן ללמוד, למשל, מפרט גופרית ניתן ללמוד על ידי culturing תאים ומגע עם חרוזים דבק על פני מונחים ארוכים יותר. טכניקה זו שימשה להבנת מנגנון כיוון חלוקת תאים תלויי מגע. מסנן PTF שימש כדי למנוע שאיפה של אדים של פתרון hypochlorite באמצעות פיפטה הפה.