בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על המשמעות של דינמיקת ביטוי גנים בהתפשטות התאים וההתבראות, במיוחד הדינמיקה של מולקולות איתות Notch בתאי גזע עצביים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לפקח על ביטוי גנים הן במבחנה והן ב vivo עם דיוק גבוה מאוד על ידי הדמיה חיה. הדגימה להליך תהיה הירומי שימוג'ו, עוזרת הפרופסור מהמעבדה שלי שפיתחה את הטכנולוגיה החדשה הזו.

עבור Dll1 F לוציפראז כתב מבוא לתוך NPC, לאשר חוסר תגובה רפלקס הדוושה ביום עוברי 12.5 כדי 14.5 עכבר בהריון לפני ביצוע חתך של שניים עד שלושה סנטימטרים דרך הבטן, לאורך קו האמצע. מניחים גזה ספוגה PBS סביב החתך, ולהשתמש מדפים בצורת טבעת כדי לחלץ בזהירות את קרן הרחם הימנית. לאחר ספירת העוברים, השתמש במיקרו נימי כדי להזריק אחד עד שני מיקרוליטרים של דנ"א מעורב של כתב Dll1 F לוציפראז לחדר של הטלנצפלון של כל עובר.

זריקה מוצלחת תגרום לשמירה על צבע כחול על פני השטח של הרחם. עבור אלקטרופורציה, להרטיב את הרחם ואת האלקטרודה עם PBS, בעדינות לתפוס את הראש של העובר הראשון. הגדר את האלקטרודה טעונה חיובית לצד של חצי הכדור שבו הוזרק ה-DNA, ולספק חמישה 30-50 וולט, 50 אלפיות שנייה פולסים, עם הפסקה של שנייה אחת בין פולסים, בודק כי בועות נוצרות מן האלקטרודה טעונה שלילית.

כאשר כל העוברים הוזרקו, להחזיר את קרן הרחם השמאלית לבטן, ולהשתמש מחט 17 מילימטר כדי לסגור את החתך עם תפר משי 4-0, הצבת PBS חם לתוך חלל הבטן לפני השלמת הסגירה. כדי להקים תרבות NPC ניתוק, במקום הראשון הרחם מיום עוברי 12.5 כדי 14.5 בהריון Dll1 בכל מקום לוציפראז עכבר מהודק לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ המכיל 25 מיליליטר של PBS קר כקרח, ולהשתמש מספריים מיקרו ומטסים עדינים כדי להסיר את העוברים מן הרחם. לאחר עריפת ראשם של העוברים, מניחים את הראשים לתוך צלחת פטרי חדשה של 10 ס"מ המכילה DMEM/F12 קר כקרח, ומסירים את האפידרמיס והסחוס המקיפים כל מוח.

מעבירים את המוח לצלחת של 35 מ"מ תחת מיקרוסקופ ניתוח המכיל שלושה מיליליטר של מדיום N2B27 קר כקרח. הסר את הטלנצפלון הימני והשמאלי מ-דינצפלון. השתמש במטלות עדין כדי להסיר את קרום המוח המכסה את פני השטח של telencephalon ול לנתח את החלק הגבי של קליפת המוח מן telencephalon.

כאשר כל הרקמות העצביות של עניין בודדו, להשתמש פיפטה P1000 להעביר את הדגימות לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר, ולהשתמש פיפטה P200 כדי לשאף כל מדיום נוסף מכל צינור. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תברוב פפאין לכל זוג קליפת המוח, ומ מניחים את הדגימות על 24 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בסוף הדגירה, בעדינות pipette את הדגימות 10 פעמים עם פיפטה P1000 חדש, ולהחזיר את הצינורות ל 24 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות נוספות.

בסוף הדגירה, בעדינות pipette את הדגימות שוב לפני איסוף הרקמות מתעכל על ידי צנטריפוגה. שאף את העל-טבעיים, והתן בעדינות כל גלולה עם מיליליטר אחד של מדיום DMEM/F12. צנטריפוגה הדגימות שלוש פעמים נוספות כפי שהוכח רק, בעדינות resuspending כל גלולה עם מיליליטר טרי של מדיום לאחר כל צנטריפוגה.

לאחר הצנטריפוגה האחרונה, יש להשתמש מחדש ב-500 מיקרוליטרים של אמצעי N2B27 בתוספת לוציפרין מילימולרי אחד, ולזרע פעם אחת 10 עד ששת התאים מכל דגימה על כלים תחתונים בודדים מצופים זכוכית מצופה פולי-L-ליסין. לאחר מכן, מניחים את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך שעה אחת. לאחר התאים דבקו בצלחת, מוסיפים שני מיליליטר של טרי N2B27 בינוני בתוספת לוציפרין מילימולרי אחד לכל צלחת.

כדי לדמיין את ביטוי הכתב של לוציפראז בתרבויות דיסוציאציה של NPC, בחר את מטרת טבילת השמן והנח את צלחת הדגימה על שלב המיקרוסקופ. הצג את השדה באופן ידני כדי לקבוע את המיקום הטוב ביותר להצגת התאים והתמקד בתאי העניין. לחץ על Live כדי להשיג את תמונת הבדיקה, ולהשתמש בתוכנית רכישה רב-ממדית כדי להפעיל את רכישת זמן לשגות על ידי זוהר דו מימדי ורכישות שדה בהיר במשך 24 שעות.

כדי להכין תרבויות פרוסת קליפת המוח המתפתחת, יום אחד לאחר הזרקת הכתב, לקצור את היום העוברי 13.5 עד 14.5 מוחות עוברים כפי שהוכח, ולה מניחים את המנה המכילה את המוח על הבמה של מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטי. אשר כי כל קליפת המוח מבטאת את הכתב פלואורסצנטי מוזרק תחת אור העירור המתאים, ולהעביר את המוח ללוח חיתוך גומי סיליקון מלא 30 מיליליטר של אמצעי DMEM / F12, מבעבע עם 100% גז חמצן. השתמש בסכין מיקרו כירורגית ומקלות עדינים כדי לחתוך את הגבול בין החלק המדיאלי והצידי של telencephalon הגבי, ולהפריד את הרקמה לשתי ההמיספרות.

לאחר מכן, השתמש בסכין כדי לחתוך את קליפת המוח כמו פסים כדי להשיג פרוסות קליפת המוח, העברת הפרוסות במדיום מן קרש החיתוך לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ חדש כפי שהם נרכשים. לאחר איסוף כל הפרוסות, מניחים את המשטח החתך של כל פרוסה על גבי מוסיף תרבות המוצב בצלחת תחתית זכוכית המכילה מדיום מועשר, ומתאימים את הכיוון של כל פרוסה במטחנים עדין לפי הצורך. לאחר מכן, הסר כל מדיום עודף עם פיפטה, והכנס את המנה לאנקובטור מרובה גזים שנקבע ל-40%חמצן, 5% פחמן דו-חמצני ו-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

בסוף הדגירה, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של מדיום מועשר בתוספת לוציפרין מילימולרי אחד לצלחת התרבות. כדי לדמיין את ביטוי הכתב של לוציפראז בתוך תרבויות הפרוסה, בחר את המטרה 40x והצב את צלחת הדגימה על שלב המיקרוסקופ. לרכוש תמונת מבחן של הפלואורסצנטיות, ולהגדיר את המיקום ואת מישור המיקוד לאזור העניין תחת הארת אור העירור המתאים.

לאחר מכן, הפעל את רכישת זמן לשגות על ידי זוהר תלת מימדי, פלואורסצנטיות, ורכישות שדה בהיר במשך 24 שעות. כדי לפקח על פעילות האמרגן של הגן המתנד Dll1, luciferase בכל מקום, כתב luciferase לא יציבות עם זמן מחצית חיים של כ 10 דקות, ניתן להשתמש. כמו כתב פלואורסצנטי, כתב luciferase יכול לשמש כדי לפקח על הדינמיקה ביטוי של חלבון על ידי התמזגו רצף קידוד גנים של עניין.

כדי לדמיין ביטוי כתב ברמה של תא יחיד בתרבות רקמות, הגן הכתב יכול להיות מתחלף באופן חולף לתוך NPCs באמצעות אלקטרופורציה ברחם כפי שהוכח. בנוסף, הדמיה מבוססת מיקרוסקופ מאפשרת רכישה של תמונות שדה בהיר, פלואורסצנטיות וכימותרפיה. הכתב של פעילות האמרגן Dll1 מציג ביטוי נדנוד ב- NPCs הנגזרים מהטלנצפלון של עכברי כתב F luciferase בכל מקום, עם כתב לוציפראז חסר יציבות המציין תקנה חדה למעלה ולמטה של הביטוי של פעילות האמרגן.

בתאים סחוביים משופרים של חלבון פלואורסצנטי ירוק הסמוך הנושאים כתב Hes1 ותאים חיוביים mCherry המביעים כתב חלבון Dll1 אשר יצר קשר אחד עם השני במהלך התצפית, הבעת כתב Hes1 נראה להתחיל כ 60 דקות לאחר מגע, מה שמרמז כי עיכוב הזמן להעברת Notch איתות בין התאים הסמוכים הוא כשעה. יתר על כן, במהלך העברת אותות, ביטוי חלבון Dll1 מפגין טרנסלוקציה דינמית. בעת רכישת הדמיה bioluminescence, לשמור על חדר מיקרוסקופ כהה לחלוטין, כמו אור מיותר יכול למנוע רכישה אופטימלית.

ההתפתחויות האחרונות באופטוגנטיקה מאפשרות לנו לשלוט בביטוי גנים עם אור. בעזרת טכניקה זו, אנו יכולים להציג בו זמנית דפוסים שונים של ביטוי גנים ולנטר תגובות כתב לוציפראז.