איתור של רקמות בקטריה תושב ביופסיות שלפוחית השתן על ידי הזריחה של 16S rRNA באתרו היברידיזציה

כאן אנו מציגים פרוטוקול חזק לגילוי חיידקים בתוך רקמת שלפוחית השתן ביופסיה, אשר יש יישומים רחבים לסוגי רקמות רבים שבהם חיידקים חשודים להיות נוכחים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה לא משוחד. זה מאפשר לחוקר לזהות חיידקים בתוך רקמות ללא ידע מראש אילו מינים חיידקיים נמצאים.

טכניקה זו עשויה לעזור לקבוע אם חיידקים פלשו לקירות שלפוחית השתן של נשים עם זיהום חוזר בדרכי השתן ולהודיע על בחירות טיפוליות כגון הבחירה של אנטיביוטיקה חודרת רקמות. בעוד תוכנן עבור רקמות שלפוחית השתן, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על רקמות אחרות עם אוכלוסיות חיידקים תושב עם אופטימיזציה מינימלית. אנשים חדשים בטכניקה זו עשויים להיאבק עם מיקום כיסוי והדמיה.

התמקד במיטוב מיקום coverslip כדי להפחית בועות ולתרגל הדמיה על דגימות שאינן יקרות. עוזר להדגים את ההליך הזה יהיה Jashkaran Gadhvi, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, לנקות מכסה המנוע אדים ריק או ארון biosafety מצויד כראוי עם 70% אתנול.

הכן את כל המאגרים והריכונים הדרושים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לנקות חמש צנצנות קופלין עם 70% אתנול ולתת את הצנצנות להתייבש. כאשר הצנצנות יבשות, תייג אותן כפי שמוצג כאן ומלא אותן ב-100 מיליליטר של הפתרון המתאים.

במכסה המנוע של האדים, מקם שתי שקופיות לכל ביופסיה לתוך מתלה שקופיות אנכי. מניחים את מתלה השקופיות האנכי בצנצנת ה- Xylenes 1 Coplin למשך 10 דקות. לאחר מכן, להסיר את ארון התקשורת שקופיות מן הצנצנת כתם התחתון על מגבת נייר כדי להסיר קסילנים עודף.

מניחים את המדף לתוך צנצנת Xylenes 2 במשך 10 דקות. ולאחר מכן rehydrate את החלקים רקמה de-paraffinized בשטיפת אתנול רצופים במשך 10 דקות כל אחד. כאשר לשטוף הושלמו, כתם את החלק התחתון של מתלה השקופיות על מגבות נייר כדי להסיר אתנול עודף ולהניח את המדף בצנצנת קופלין המכיל 100 מיליליטר של מסנן מעוקר, מים מזוקקים כפול במשך 10 דקות.

במהלך שטיפה זו, לדלל את הבדיקות ל 10 nanomolar במאגר הכלאה כדי ליצור את פתרון הכתמים, הקפד להכין 150 microliters של פתרון הכתמים לכל שקופית. הכינו תא לחות לכל גשוש על ידי הוספת ניגוב משימה עדין ספוג ומפורר ומים סטריליים למאגר של קופסת קצה P1000. מקם את מחסנית מחזיק הקצה על גבי זה המקום שבו השקופיות יישבו.

לאחר השלמת הכביסה הסופית, הסר את השקופית ממדף השקופיות והצב אותם על מגבת נייר טרייה, בצד הרקמה למעלה. השתמשו בניגוב משימה עדין לייבוש המגלשה, הקפידו רק לטבול בעדינות קרוב אך לא בחלק הביופסיה כדי לפתל את המים. באמצעות עט הידרופובי, לצייר גבול סביב סעיף הביופסיה ולמקום את הצד רקמת השקופית בתא לחות.

לאחר מכן, מניחים את התא הלח לתוך אינקובטור להגדיר 50 מעלות צלזיוס. פיפטה בין 50 ל 150 microliters של פתרון הכתמים ישירות על גבי הרקמה, כך המלבן שנעשו על ידי הגבול הידרופובי סביב הרקמה מלא ולסגור את התיבה בעדינות. דגירה לילה ב 50 מעלות צלזיוס בחושך.

אם החממה יש חלון, לכסות אותו עם רדיד אלומיניום כדי ליצור סביבה כהה. למחרת בבוקר, להסיר את השקופיות מן התאים לחות במהירות wick משם כל פתרון הכלאה שנותר עם לנגב משימה עדינה. לאחר מכן מניחים את הצדדים לתוך מתלה מכתים אנכי.

מניחים את מתלה הכתמים בצנצנת קופלין עטופה בנייר אלומיניום המכילה 100 מיליליטר של חיץ הכביסה החם מראש במשך 10 דקות. חזור על שלב שטיפה זה פעמיים נוספות עם חיץ כביסה טרי בצנצנות קופלין חדשות. במהלך שלבי שטיפה אלה, להכין את הכתם נגדי על ידי דילול פתרון מלאי של Hoechst 33342 במאגר לשטוף, ביחס של אחד עד 1000.

לאותה צינור, מוסיפים את אלקסה-555 נבט חיטה אגלוטין לריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם למיליליטר ואלקסה-555 פאלואין לריכוז סופי של 33 ננומולרים. יש לאחסן בחושך עד שהוא מוכן לשימוש. כאשר הכביסה הסופית הושלמה, להסיר את השקופיות מן צנצנת Coplin בעדינות פתיל משם כל חיץ לשטוף עודף עם לנגב משימה עדינה.

מניחים את השקופיות בצד הרקמה על מגבת נייר ומוסיפים בין 50 ל -150 מיקרוליטרים של כתם נגדי ישירות על גבי הרקמה, כך שהגבול ההידרופובי מתמלא, אך לא עולה על גדותיו. מכסים עד ארבע מגלשות עם קריו-בוקס-טופ ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, מניחים את השקופיות בחזרה לתוך מתלה הכתמים ולשטוף אותם פעמיים נוספות בצנצנות קופלין המכילות חיץ שטיפה טרי, כאשר כל שטיפה נמשכה 10 דקות.

ואז לייבש ביסודיות את המגלשות ומניחים אותם בצד הרקמות על מגבת נייר מתחת לתיבת קריו-בוקס. לסחוט טיפה אחת של מדיה הרכבה ישירות על גבי הרקמה בעדינות למקם כיסוי בגודל מתאים על גבי. בעדינות ללחוץ על כל בועות ולאפשר שקופיות כיסוי לרפא לילה בחושך.

למחרת, לאטום את הקצוות של coverslips למגלשה עם מעיל בהיר של לק ברור ולתת יבש בחושך במשך 10 דקות, לפני אחסון אותם בחושך בארבע מעלות צלזיוס. כאשר אתה מוכן לדמיין את הביופסיות המוכתמות, הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקל ואת התוכנה המשויכת למיקרוסקופ. התחל בשקופית חיובית של FISH ועבור למצב תצוגה חזותית של המחשב.

בחר את הערוצים עבור 405, 488 ו- 555. הגדר את חור הסיכה באמצעות ערוץ אורך הגל הארוך ביותר, אשר במקרה זה הוא 555. לאחר מכן מצאו את מישור המוקד הנוכחי להדמיה של חיידקים מסומנים בערוץ 488.

מבלי לשנות את מישור המוקד, הגדר את הרווח, עוצמת הלייזר וההיסט עבור כל ערוץ כך שהאות אינו רווי והרקע אינו מתוקן יתר על המידה. רכוש את התמונה בכל שלושת הערוצים. במחקר זה, חיידקים הקשורים לרקמות מזוהים בביופסיות שלפוחית השתן האנושית על ידי 16S rRNA FISH.

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לגילוי בלתי משוחד של חיידקים הקשורים ל רירית שלפוחית השתן באזורי ביופסיה של שלפוחית השתן משובצים בפרפין. המוצגים כאן הם מיקרוגרפים קונפוקלים מייצגים מניסוי באמצעות פרוטוקול זה על קטעים של ביופסיות שלפוחית השתן המתקבלות מנשים עם זיהומים חוזרים בדרכי השתן. שני חלקים טוריים הם היברידית עם rRNA אוניברסלי 16S או לטרוף בדיקות.

תמונות ar נלקח מאותו אזור של הרקמה וחיידקים נראים בבירור ברקמה הכלאה עם בדיקות rRNA 16S, אבל הם לא עם בדיקה לטרוף. תוצאות חיוביות שגויות אפשריות גם כן. בנציג זה חיובי כוזב, אות המתאים קולגן autofluorescent או אלסטין מזוהה ב 405 ו 488 ערוצים הן rRNA 16S ולטרוף בדיקה היברידית ביופסיה סעיפים, הדגשת החשיבות של תמיד באמצעות בקרת בדיקה לטרוף.

כדי למנוע הלבנת תמונות, מזער את החשיפה של רקמה לאור לאחר החלת בדיקות. בעוד טכניקה זו מאפשרת זיהוי משוחד של חיידקים ברקמות אנושיות, היא אינה נותנת למינים מידע ספציפי. מולטיפלקס-דגים עם בדיקות ספציפיות לטקסונומיה יכול לשמש כדי לזהות את הסוג או המינים הנוכחים.

לפני טכניקה זו פותחה, זה לא הוכח בעבר כי חיידקים יכולים לפלוש לקיר שלפוחית השתן של חולי UTI חוזרים אדם. אנו משתמשים כעת בסוג ובבדיקות ספציפיות למינים כדי לקבוע אילו מינים חיידקיים קיימים. יש להשתמש בקסילנים במכסה המנוע של האדים בשל הרעילות שלהם.

יש לדאוג לא להסתכל ישירות לתוך הלייזר במהלך ההדמיה. יש לכבות את הלייזר בעת מיקום השקופית מתחת למטרה.