Name: מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: למדו שיטה לניתוח דינמיקת מיקרוטובולים בתאי HeLa מסונכרנים בפרומטאפז באמצעות מיקרוסקופיית דיסק סיבובי ועיבוד תמונה ב-MATLAB. השיטה מפחיתה פוטוטוקסיות ומאפשרת מחקר מנגנוני מחלה וגילוי תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מתקן המיקרוסקופיה, מכון מקס פלנק לרפואה ניסויית, לייעוץ ולתמיכה המומחים שלהם.

1. זריעת תאי הלה
<ol><li>להכין 2 מ ל של 5 μg/mL fibronectin פתרון ב פוספט באגירה מלוחים (PBS) ולהוסיף 450 μL של אותו לתוך כל טוב של 4 שמיכות היטב הצ (#1 .5). מודיית את השקופית עבור 15 דקות ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
	<li>לשטוף באופן אסינכרוני בתאי הלה גדל עם מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) ו דגירה עם טריפסין-EDTA (0.05%: 0.02%; w:v) עבור 5 דקות ב 37 ° c. להפסיק את התגובה אנזימטית על ידי תוספת של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 בינוני בתוספת 10% החום מופעל סרום עגל העוברי (FCS) ב 3:1 (v:v) יחס של טריפסין הוסיף-EDTA. הערה: תאי הלה שמרו ב RPMI 1640 בינוני בתוספת של 10% חום מופעל FCS ב 37 ° צ' ו 5% CO2 ו היו באופן שגרתי בעבר הגיעו 80-90% שליטה כמתואר לעיל.</li>
	<li>קבע את ריכוז התא. באמצעות תא נויבאואר מערבבים 50 μL ליטר של השעיית התא עם טריבן כחול ב 1:1 (v:v) יחס, השעיה מחדש, והעברה 10 μL של ההשעיה אל החדר. הרוזן רק את התאים הכחולים-שליליים בתוך ארבעת הריבועים הגדולים (לפרטים ראו פיילן47ואח '). גזור את ריכוז התא ממספר התא שנספר באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60478/60478eq1.jpg">
</li>
	<li>גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 2 דקות. Resuspend שעיה עם חדש RPMI 1640 על מנת להשיג 1 x 106 תאים/mL.</li>
	<li>הסר את fibronectin מתוך שמיכות השינה, לשטוף את הבארות פעמיים עם DPBS, ואת הזרע 50,000 תאים לכל טוב.</li>
	<li>להחזיר את שמיכות השינה עם התאים לחממה ולגדול אותם 24 שעות ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
</ol>2. ביטוי של pEB3-tdTomato בתאי הלה
<ol><li>. הכן שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ ל עבור כל צינור, לדלל 2 μg של pEB3-tdTomato48 עם מאגר החצייה (סינתטי מוצר בפתרון מימית) לנפח הסופי של 396 μl.</li>
	<li>הוסף 4 μL של מגיב (non-lipidic, המכיל פוליאתילן) לצינור הראשון, ומערבולת את התערובת מיד בדיוק 10 s.</li>
	<li>בקצרה לסובב את הצינור עם מיקרוצנטריפוגה ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות.</li>
	<li>הסירו את תאי הלה מהאינקובטור. Dropwise, להוסיף 100 μL של תערובת החצייה לכל הבאר של 4 שמיכות היטב, ולהחזיר את התאים לחממה.</li>
	<li>לאחר 4 h של דגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2, מוסף את התאים עם בינוני גדילה טריים ו-דגירה לפחות 24 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2. הערה: יש צורך למטב את תנאי ההעברה עבור כל סוג תא. רמות הביטוי צריכות להיות נמוכות מספיק כדי לאפשר זיהוי של קצוות MT אחד גדל. לחילופין, קו תא המבטא באופן בלתי נשכח EB3-tdTomato ניתן להשתמש בניסויים; זה יפחית את השונות ברמות הביטוי של EB3-tdTomato בין ההכנות ובין תאים מאותה הכנה49.</li>
</ol>3. סנכרון ולייב תא הדמיה של pEB3-tdTomato – ביטוי בתאי הלה
<ol><li>הכנת פתרון μM 2.5 של dimethylenאסטרה (DME) ב-פנול-אדום חינם מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DME) שיושלם עם 10% FCS ו 2 מ"מ L-גלוטמין או אספקת גלוטמין חלופית.</li>
	<li>החלף את מדיום הצמיחה ב coverslip שמיכות עם 500 μL של מדיום הצמיחה המכיל 2.5 μM DME ו-מארג התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
	<li>לאחר 3.5 h של דגירה עם DME, להעביר את התאים למיקרוסקופ, הר שמיכות לתוך חדר הסביבה עם פאנלים כהים עבור הדמיה ב 37 ° צ' ו 5% CO2, ו מודטה נוספת עד הזמן הדגירה הכולל הוא 4 h. הערה: תחזוקת הטמפרטורה ב-37 ° צ' ללא תנודות היא חיונית לניסוי.</li>
	<li>לבצע את ההדמיה הזמן הדמיה על מיקרוסקופ הפוך מצויד 100x 1.49 N.A. שמן טבילה המטרה, מערכת מסתובב כפול הדיסק קונפוקלית, ואת מערכת האוטומטי אמין עבור תחזוקה רציפה של מטוס מוקד. הגדר את פרמטרי ההדמיה כדלקמן. הערה: אנו משתמשים מכשיר אלקטרוני הכפלת חיוב בשילוב מצלמה (EM-CCD).<ol>
<li>לעירור EB3-tdTomato, השתמש בקו לייזר של 561 ננומטר עם 200 ms זמן חשיפה. לאסוף את האור הנפלט באמצעות bandpass מרובעת (405, 488, 561, 640 nm) דיקרואיק מראה ומסנן פליטת nm 600/52. הערה: ניתן לכוונן את כוח הלייזר עבור כל תא הניתן לדימות כדי למנוע רוויית תמונה. בכל הזמנים הסרטים שניתנו כאן הכוח לייזר הוגדר 5.3 mW.</li>
		<li>למצוא תא ב prophase ולהתמקד Z-מישור המתאים למרכז של ציר הmitotic מונוסולאר. לרכוש תמונות כל 0.5 s על סך של 1 דקות ללא ביננינג ולא תאורה בין החשיפות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח הדינמיקה של MT באמצעות U-Track v 2.2.0
<ol><li>כדי לנתח את הדינמיקה MT נדרשת תוכנת סביבת מיחשוב נומרית (לדוגמה, MATLAB). הערה: הבנה בסיסית של התוכנה מספיקה לניתוח. חומר עזרה מקיף וערכות לימוד זמינים באתר האינטרנט של המפתחים (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).</li>
	<li>הורד (https://github.com/DanuserLab/u-track) והתקן את תוכנת הקוד הפתוח u-track v 2.2.0 בעקבות ההוראות המפורטות שניתנו בקובץ "Readme_u-track. pdf"50,51,52.</li>
	<li>הפעל את תוכנת ניתוח המספריים והוסף את תיקיית ה-U-Track v 2.2.0 עם תיקיות ממשנה לנתיב החיפוש של התוכנה.</li>
	<li>מתוך חלון הפקודה קוראים. " הדבר פותח חלון דיאלוג שממנו ניתן לייבא את הקבצים הגולמיים שהופקו על-ידי תוכנת רכישת התמונות במיקרוסקופ (איור משלים 1, איור 2, איור 3, איור 4). הערה: תוכנת ה-U-Track תואמת לתבניות אחרות של נתוני תמונה. היא משתמשת ביו-פורמטים, אשר מזהה חיים שונים מדעי הנתונים תבניות53.</li>
	<li>הגודל של כל תמונה נקרא מתוך המטא-נתונים באופן אוטומטי. הזן באופן ידני את הצמצם המספרי של המטרה (במקרה זה 1.49) ואת מרווח הזמן (0.5 s) המשמש לדימות (איור משלים 1B). בנוסף, מידע על אורך הגל, fluorophore ואת זמן החשיפה ניתן גם לספק, אבל הם לא קריטיים לניתוח נוסף.</li>
	<li>לאחר טעינת כל התמונות, שמור את סידרת הזמן שהוזנה כרשימת סרטים על-ידי בחירתרשימת הסרטים "שמור כסרט". בצד הימני של חלון הדיאלוג בחר באפשרות "U-Track" ולחץ על "המשך" (איור משלים 1c). הערה: הערכים ממוטבים לתאי הלה. אם מעבר לקו טלפון אחר, יש להגדיר שוב את הערכים. לחלופין, השתמש בהגדרות המומלצות על-ידי מפתחי התוכנה. ההסבר המפורט של כל אחד מהפרמטרים וכיצד יש להגדירה ניתן למצוא בדו ח הטכני המסופק עם הגירסה הקודמת של התוכנה, באמצעות מכשיר המעקב50.</li>
	<li>מהחלון המוקפץ, בחרבאפשרות"מסוף מיקרוטוכדורית" ולחץ על "אישור" (איור משלים 1c). חלון הדיאלוג החדש מאפשר לקבוע את הפרמטרים לשלושת השלבים של הניתוח (איור משלים 1D), שבהם מדובר בזיהוי, מעקב וניתוח מעקב.</li>
	<li>בשלב 1 בחר באפשרות "הגדרות" ומהתפריט הנפתח בחר "זיהוי שביט" כשיטת זיהוי (איור משלים 2 ב).<ol>
<li>מתוך חלון הדיאלוג החדש להגדיר את הפרמטרים עבור ההפרש של מסנן גאוסים ומפלח פרשת הזמן כדלקמן (איור משלים 2 ג): תהליך מסכה לשמש עבור הזיהוי = ללא; סטיית תקן של גאוסיאנית בעלת המעבר הנמוך = פיקסל אחד; סטיית תקן של גאוס-מעבר גבוהה = 3 פיקסלים; סף מינימלי = 3 סטיות סטנדרטיות; גודל השלב של הסף = 0.25 סטיות סטנדרטיות. בחר "החל הגדרות על כל הסרטים" ו "החל".</li>
	</ol></li>
	<li>בשלב 2, הפרמטרים לקישור, סגירת מרווח, מיזוג ופיצול, ופונקציות מסנן קלמן מוגדרות בשלושה שלבים המסומנים בצבע ורוד, ירוק וכחול, בהתאם (איור משלים 3 ב). עבור שלבים אלה, בחר באפשרות "דינמיקה מיקרוכדורית פלוס" ומהאפשרות "הגדרה", הגדר את הערכים כפי שמצוין באיור 3C – E, בהתאמה.<ol>
<li>לבעיות עם מנות מימדית, בחרו ' 2 ' מהתפריט הנפתח. השתמש במרווח מירבי כדי לסגור = 5 מסגרות; אורך מינימלי של מקטעי מסלול משלב ראשון = 3 מסגרות. כמו קודם, לבחור "להחיל הגדרות על כל הסרטים" ולחץ על "להחיל".</li>
	</ol></li>
	<li>בשלב 3 של הניתוח, התגלו שירים MT מסווגים (איור משלים 4). כשיטה לניתוח מעקב, בחרו באפשרות 'סיווג מיקרוטורודינמיקה' והגדירו את הפרמטרים באמצעות הלחצן 'הגדרה' כפי שמצוין באיור 4 ב, ג. לאחר מכן, בחר את התיבה "החל הגדרות על כל הסרטים" ולחץ על "החל".</li>
	<li>לאחר כל הפרמטרים מוגדרים, מתוך "לוח הבקרה-U-Track" חלון (איור משלים 1d) בחר את "החלת בדוק/בטל את כל הסרטים" ו "הפעל את כל הסרטים" ולחץ "לרוץ". פעולה זו תיזום את הניתוח MT של סדרת הקפיצה בזמן.</li>
	<li>לאחר השלמת עיבוד הסרט, מוצגת הודעה "הסרטים שלך עובדו בהצלחה". לחץ על "אישור", ואז "שמור".</li>
	<li>עכשיו בטוח לפרוש מתוכנת. הניתוח המספרי התוצאות מעיבוד הסרט מאוחסנות במבני תיקיות מסגרות כקבצי m בתיקייה שבה מאוחסנות הקבצים הגולמיים.</li>
</ol>5. אנליזה סטטיסטית של MT דינמיקה
<ol><li>יבא את קובצי ה-m לתוכנית של ניתוח סטטיסטי מועדף. הערה: במקרה שלנו, אנו מייבאים תחילה את הקבצים בגיליון אלקטרוני רגיל כדי להפוך אותם לקריאים. קובצי m מכילים מידע סטטיסטי (חציון, ממוצע וסטיית תקן) בפרמטרים שונים (לדוגמה, מהירות צמיחה, מאיץ הדינמיות של MT). הרשימה המפורטת של הפרמטרים מוענק בדו ח הטכני המסופק עם הגירסה הקודמת של התוכנה,ב50,52. קבצי m שנוצר יכול גם להיות מיובאים לתוך תוכנות עיבוד נתונים אחרים.</li>
	<li>בחר את "מהירות צמיחה ממוצע" הפרמטר ולייבא אותו לתוך שולחן לסטטיסטיקה ולהציג. הזן את המידע על פרמטרים אחרים, (לדוגמה, "דינמיות") בטבלה חדשה או בעמודה חדשה של אותה טבלה ומזימה מקובצת.</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, אנו מתארים שינוי של שיטה שהוקמה לראשונה על ידי ארפטיכון ואח '.44. יחד עם מספר שינויים אחרים, אנו משלבים את הטכניקה הזו של הניתוח MT דינמיקה עם הדמיה כפולה מסתובב הדיסק. השימוש בדיסק מסתובב כפול משפר את הרזולוציה של הגוברת MTs תוך הפחתת רעילות התמונה36. אנחנו עוד להקטין את התמונה הלבנה ונזק לייזר המושרה של התאים על ידי מעבר לכתב פלורסנט אורך גל ארוך יותר. חלבון פלורסנט tdTomato יש מקדם גבוה יותר של פוטויציבות ובהירות בהשוואה ל-EGFP46. לבסוף, מידת...

Microtubules (MTs) הם מבנים דינמיים מאוד למצוא כמעט כל התאים איקריוטית ובכמה חיידקים1. . הם מפסל את שלדהציטו2,3 תא החטיבה4, מולקולה הובלה5, מכות הדגל6, התחושה של הסביבה המקיפה דרך הסייום7, שמיעה (kinocilium)8,9, embryogenesis10,11,12, פלישה גרורות13,14, ואפילו היווצרות זיכרון15,16,17,18, ותהליכים רבים אחרים מסתמכים בעיקר על MTs. השתתפות MTs בכל האירועים הללו יהיה בלתי אפשרי ללא היכולת המדהימה שלהם לעבור במהירות בין הצמיחה (פלמור) והצטמקות (דפלוניזציה). מאפיין זה מתואר כאי-יציבות דינאמית19. הר הדינמיות משתנה בתנאים פתולוגיים רבים20,21,22. לפיכך, קביעת אופי הנכס יכול לעזור להבין את מנגנוני המחלות ולאחר מכן את הטיפול שלהם.
רשימה ארוכה של שיטות פותחו עבור ניתוח MT דינמיקה, שרובם מבוססים על טכניקות דימות23. בתחילה, מיקרוסקופים אור שדה רחב שימשו להתבוננות היווצרות פולימרים טובולין בתוך מבחנה24. הגילוי של מחייב הקצה (EB)-חלבונים שאוספים ב-MT פלוס-מסתיים ופיתוח של שיטות כדי לתייג חלבונים באנרגיה fluorescently אופן מאפשר לבחון את התנהגותו של MTs ישירות בתאים חיים עם שדה רחב ו-מיקרוסקופ מיקרוסקופים פלואורסצנטית25,26,27. EB-פרוטאין אחד הוא חלבון מחייב הקצה 3 (EB3)28; על ידי הבעת יתר ומעקב EB3 התמזגו חלבון פלורסנט, MT פלוס-end תעריפי ההרכבה ניתן לקבוע29,30.
לייזר confocal וקד סריקת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (CLSM) משמש לעתים קרובות כדי לעקוב MT הדינמיקה. עם זאת, טכניקת הדמיה זו מהווה סיכון גבוה לפוטורעילות ופוטוהלבנה, שני תהליכים לא רצויים עבור תא חי והדמיה לדוגמה עמומה31. כדי לקבל יחס טוב יותר של אות לרעש, את כוח הלייזר ואת משך החשיפה צריך להיות גבוה מספיק בעוד לא לפגוע בדגימות, וזה דורש הקרבת החלטה בתמורה למהירות. חלופה מתאימה ל-CLSM היא ספינינג32מיקרוסקופ דיסק. מודאליות זו מבוססת על השימוש של דיסק Nipkow33, אשר מורכב דיסק נע הנושאת מערך של חורים, ועובד אופן מיקרוסקופים CLS רבים הדמיה זהה בו34. לכן, האור מהלייזר יאיר מספר אזורים במדגם בו זמנית, אך ישמור על הטבע הטוב. הדיסק Nipkow, לכן, מאפשר קבלת תמונות דומות CLSM אבל מהיר יותר באמצעות כוח לייזר פחות. The Nipkow הדיסק היה שיפור נוסף על ידי Yokogawa אלקטריק, אשר הציג דיסק שני עם מערך של microlenses על זה כי בנפרד אור ישיר לתוך pinhole בהתאמה, הפחתת הרעילות הרבה יותר phototoxicity לבנת35. כך, מסתובב מיקרוסקופית דיסק סריקה לייזר הפכה לשיטה של בחירה עבור הדמיה תא חי, וזה מאפשר להשיג תמונות עם יחס אות לרעש גבוה במהירות גבוהה31,36, אשר חיוני לפתרון אותות כגון אלה מתוך הצמיחה המהירה MT.
הדינמיקה של MT שונה באופן זמני. לדוגמה, mitotic MTs הם דינמיים יותר מאשר האינטרפאזה37,38. באופן דומה, הבדלים בקצב הצמיחה הצטמקות נצפו גם בתוך שלב אותו מחזור התא, כגון מיטוזה39,40. לכן, כדי להימנע מאיסוף נתונים שווא, יש להגביל את המדידה של הדינמיקה של MT לחלון זמן צר במהלך מחזור התא. לדוגמה, מדידה של MT דינמיקה ב prometaphase ניתן להשיג על ידי טיפול בתאים עם dimethylenאסטרה (dme), אנלוגי monastrol המונע את המנוע קינזין Eg541 ומונע את היווצרות של הmitotic ציר דו-קוטבית42. עיכוב של תאים ב prometaphase עם Eg5 מעכבי dme ונגזרים monastrol אחרים לא משפיעים על MT דינמיקה43,44,45, מה שהופך dme כלי שימושי ללמוד mt דינמיקה הן בתאים קבועים וחיים44.
כאן אנו משלבים את השיטה של ניתוח הדינמיקה MT בתאים prometaphase שתוארו על ידי Ertych ואח '44 עם הדמיה דיסק מסתובב כפול. שיטה זו מאפשרת מדידה של הדינמיקה MT ב prometaphase תאים שנאספו ממישור מוקד אחד עם קצב הדמיה גבוה יותר, אך ללא הלבנת ומינימלית פוטורעילות. יתר על כן, כעיתונאי פלורסנט, אנו משתמשים בחלבון פלורסנט (tdTomato) הכולל בהירות ופוטויציבות לעומת חלבון פלורסנט ירוק (EGFP) והוא נרגש עם אור אנרגיה נמוכה46. לכן, tdTomato דורש פחות כוח לייזר עבור עירור והוא פחות פוטורעיל. בסך הכל, אנו משפרים עוד את השיטה על-ידי הפחתת הרעילות ושיפור הרזולוציה והטיפול בדואר הנדרש לניתוח הדינמיקה של MT. בנוסף, אנו יוצרים בסיס לשינויים עתידיים בשיטה על-ידי שילובם בשיטות סינכרון אחרות.

<table><tbody><tr><td>Dimethylenastron</td><td>Merck</td><td>324622</td><td></td></tr><tr><td>DMEM עם פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>31053-28</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Biochrom</td><td>S0415</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין פלזמה בקר</td><td>Merck</td><td>F4759</td><td>אבקה סטרילית</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>תחליף גלוטמין יציב</td></tr><tr><td>jetPRIME</td><td>Polyplus</td><td>114-15</td><td></td></tr><tr><td>EB3-TdTomato</td><td>Addgene</td><td>פלסמיד #50708</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Merck</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2143</td><td>0.05%/0.02% w/o סידן ומגנזיום</td></tr> <tr><td>ומיקרו;- שקופית</td><td>Ibidi</td><td>80426</td><td>שקופית 4 בארות עם #1.5 כיסוי</td></tr><tr><td>Eclipse Ti מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>CFI Apo TIRF 100xC שמן</td></tr><tr><td>ACAL לייזר Excahnger</td> תיבת לייזר <td>ניקון</td><td></td><td>. 405, 458, 488, 514, 561 ו 647 ננומטר</td></tr><tr><td>מודול דיסק מסתובב</td><td>Andor</td><td>CSU-W</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>אנדור</td> תא סביבתי <td>iXon Ultra 888</td><td></td></tr><tr>תא<td>כהה</td><td>Okolab</td><td></td><td>מצויד באספקת CO2, בקרת טמפרטורה ומכשיר אדים</td></tr><tr><td>HeLa Cells</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements v4</td><td>Nikon</td><td></td><td>Spinning דיסק מיקרוסקופ. תוכנת רכישה</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>סביבת מחשוב</td></tr><tr><td>פריזמה 8</td><td>GraphPad</td><td></td><td>תוכנת ניתוח ותצוגה סטטיסטית</td></tr></tbody></table>

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר mitotic צירים

Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles

אנו מתארים שינוי של שיטה מבוססת לקביעת הדינמיקה המיקרוכדורית בתאי החיים. הפרוטוקול מבוסס על הביטוי של סמן מקודד גנטית עבור הקצוות החיוביים של microtubules (EB3 מתויג עם חלבון פלורסנט tdTomato) ו במהירות גבוהה, ברזולוציה גבוהה, הדמיה של תא חי באמצעות מיקרוסקופ הדיסק מסתובב מיקרוסקופית. סנכרון התאים והצפיפות המוגברת של microtubules מתבצעים על ידי הפרדה מרבית בתאי הmitotic, וניתוח הצמיחה מבוצע באמצעות תוכנת U-Track של מקור פתוח. השימוש בחלבון פלורסנט בהיר ואדום הוזז, בשילוב עם כוח לייזר נמוך יותר וזמן חשיפה מופחת הנדרש עבור מיקרוסקופ דיסק מסתובב להפחית את הרעילות וההסתברות של חפצים המושרה באור. הדבר מאפשר הדמיה של מספר גדול יותר של תאים בהכנה זהה תוך שמירה על התאים במדיום גדילה תחת תנאי תרבות סטנדרטיים. מכיוון שהניתוח מבוצע באופן אוטומטי מפוקח, התוצאות הן עמידות סטטיסטית ומפוקחת.

בעקבות הפרוטוקול הנתון המתואר באיור 1A, ה-PEB3-tdTomato באופן מידי התבטא באופן מבוקר בתאי חלה הגדלים באופן אסינכרוני. התאים סונכרנו 48 h לאחר הprometaphase באמצעות טיפול DME (איור 1B). שלב זה הבטיח כי המדידה של MT דינמיקה נעשתה תמיד באותו שלב של מחזור התא. הסרטים בזמן הקפיצה היו מעובדים ונותחו באמצעות U-Track v 2.2.0 כפי שמתואר בתיעוד המשלים שלה50,51,52. למרות שהפרוטאינ...

כאן אנו מציגים שיטה איתנה ומפורטת של ניתוח מיקרוטוכדורית בתאים מסונכרנים בprometaphase באמצעות מיקרוסקופ הדיסק המסתובב של תא חי מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה מבוסס MATLAB.

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים

We describe a modification of an established method to determine microtubule dynamics in living cells. The protocol is based on the expression of a ...

מה שאנו מציגים כאן הוא שיטה חזקה ופשוטה לנתח דינמיקה microtubule באמצעות דימות קונפוסל דיסק מסתובב תא חי בתאים מסונכרנים prometaphase, ותמונות מנותחות לאחר מכן על פלטפורמה מבוססת MATLAB. השימוש בחלבון פלואורסצנטי אדום בשילוב עם מיקרוסקופ דיסק מסתובב מפחית פוטוטוקסיות. לכן, מספר גדול יותר של תאים ניתן לדמיין בתוך אותה הכנה.דינמיקת המיקרוטובול משתנה במספר רב של מצבים פתולוגיים. לכן, הבנת הרגולציה וההתנהגות של דינמיקת המיקרוטובול בתהליכים אלה יכולה לעזור לנו להבין את מנגנון המחלה, ובסופו של דבר לפתח טיפולים כדי לפצות עליהם. השיטה היא גם יוקרתית, כך שזה יכול להיות מיושם במאמץ גילוי סמים.ניתן לשנות את השיטה על ידי שינוי פרוטוקול desynchronization פלואורסצנטיות וקבלת תאים מהשלבים השונים של מחזור התא. זה יכול להיות שימושי בעת סינון תרופות נגד microtubules וזיהוי פגם על תאים מתחלקים ולא מתחלקים. יש צורך למטב את פרוטוקול ההמרה ואת צפיפות הזריעה עבור כל סוג תא.רמת הביטוי של EB3 צריכה להיות נמוכה, על מנת לזהות microtubules גדל יחיד. התחל על ידי שטיפה אסינכרונית גדל תאי HeLa ב DPBS, ולאחר מכן דגירה אותם עם טריפסין-EDTA במשך חמש דקות, ב 37 מעלות צלזיוס. הפסק את ההפסקה על-ידי הוספת RPMI-1640 בינוני בתוספת FCS 10%heat מושבת ביחס של שלושה לאחד, טריפסין-EDTA הוסיף.לחשב את הריכוז של התאים על פי הוראות כתב יד, וזרע 50, 000 תאים לתוך כל באר של מוכן, כריכה קאמרית. מחזירים את הכיסויים לאנקובטור, ומגדלים תאים במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. למחרת, להסיר את התאים מהאינקובטור, ושחרר חכם להוסיף 100 microliters של תערובת transfection לתוך כל באר.מחזירים את התאים לחממה, ולאחר ארבע שעות של דגירה משלימים את התאים עם מדיום טרי ובנוסף אינקובט במשך 20 שעות. הכן פתרון 2.5 micromolar של dimethylenastron, או DME, ב DMEM חינם אדום פנול, בתוספת 10% FCS ושני מילימולר L-גלוטמין. החלף את מדיום הצמיחה בכיסוי התאי במדיום הצמיחה של DME והחזר את התאים לאנקובטור.לאחר 3.5 שעות של דגירה, להעביר את התאים למיקרוסקופ על ידי הרכבה כיסוי תא לתוך תא סביבתי להגדיר 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, עם לוחות כהים להדמיה. לאחר מכן המשיכו את הדגירה במשך ארבע שעות בסך הכל. בצע את הדמיית לשגות הזמן במיקרוסקופ הפוך עם צמצם מספרי 100X, 1.49, מטרת טבילת שמן, מערכת קונפוקל דיסק כפולה, ומערכת מיקוד אוטומטית אמינה.הגדר את פרמטרי ההדמיה כמתואר בכתב היד של הטקסט. מצא תא בפרופזה, והתמקד במישור Z המתאים למרכז הציר המיטוטי המונופולרי. לאחר מכן לרכוש תמונות כל 5 שניות, על פני סך של דקה אחת, ללא binning וללא תאורה בין חשיפות.התחל על-ידי טעינת תוכנת הניתוח המספרי והוספת התיקיה V2.2.0 של u-track לנתיב החיפוש של התוכנה, הנקראת GUI של בורר סרטים, מחלון הפקודה. לאחר מכן יבא את הקבצים הגולמיים שנוצרו על-ידי תוכנת רכישת התמונות. הזן באופן ידני את הצמצם המספרי של המטרה ואת מרווח הזמן המשמש להדמיה.לאחר שכל התמונות נטענות, שמור את סידרת לשגות הזמן שהוזנה כסרט על-ידי בחירה באפשרות שמור כרשימת סרטים ואת אפשרות ה- U-track בצד ימין של חלון הדו-שיח. בחר microtubule plus-ends מהתפריט הנפתח ולחץ על אישור, הפותח חלון דו-שיח חדש כדי לקבוע את הפרמטרים של שלושת שלבי הניתוח. עבור השלב הראשון, לחץ על הגדרות ובחר זיהוי שביט מהתפריט הנפתח.הגדר את הפרמטרים להבדל של מסנן גאוסיאני ופילוח קו פרשת המים, כמתואר בכתב היד. לאחר מכן בחר החל הגדרות על כל הסרטים ולחץ על החל. עבור השלב השני, בחר את הדינמיקה של microtubule plus-end, ולהשתמש באפשרויות ההגדרה כדי להגדיר את הערכים לקישור, לסגירת רווחים, למיזוג ולפיצול ולפונקציות המסנן של קלמן, בהתאם לכתב היד של הטקסט.לבעיות בממדיות, בחרו שתיים מהתפריט הנפתח, ולהשתמש בחמש מסגרות לסגירה של רווח מרבי ושלוש מסגרות לאורך מינימלי של מקטעי רצועה מהשדה הראשון. כמו קודם, בחר להחיל הגדרות על כל הסרטים ולחץ על החל. עבור שלב שלישי, בחר סיווג דינמיקת microtubule כשיטה לניתוח מסלול והגדר את הפרמטרים באמצעות לחצן ההגדרה.בחר את התיבות להסרת רצועות בתחילת הסרט ובסוף הסרט והפוך אותן להיסטוגרמות סטטיסטיקה. מהרשימה הנפתחת, בחר באמצעות שתיים עד שלוש מסגרות לפני רווח קדימה, והאחוזון ה-95 של התפלגות מהירות הפער קדימה, עבור סיווג מחדש קדימה ואחורה, בהתאמה. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, בחר החל בדיקה/ביטול סימון על כל הסרטים והפעל את כל תיבות הסרטים מחלון ה- U-track של חלוניות הפקדים ולאחר מכן לחץ על הפעל.הודעה מוצגת לאחר השלמת עיבוד הסרט. הפלסמיד pEB3-tdTomato בא לידי ביטוי באופן ארעי בתאי הלה. התאים סונכרנו עם טיפול DME.סרטים לשגות זמן של צמיחת microtubule נותחו, ואת מהירות הצמיחה וכתוצאה מכך ואת הדינמיקה היו התווה. הפרמטרים המתוארים כמשפיעים על הניתוח, כגון אורך רווח מרבי ומגורם הצטמקות מרבי, שונו עבור אותה קבוצה של סרטים לשגות בזמן. הערכים המתאימים של מהירות הצמיחה והדינמיקה חושבו.בעוד מהירות הצמיחה וכתוצאה מכך לא הושפעה באופן משמעותי, הדינמיקה הייתה שונה כאשר אורך הפער המרבי השתנה. בכל שלושת המקרים, הגילוי של מסלולי משנה microtubule היה דומה, עדיין שחזור של מסלולי MT מלא הושפע בעיקר כאשר אורך הפער המרבי נקבע ל 15. כדי להעריך אם תנאי ההדמיה הפריעו להתנהגות המיקרוטובול, נותחו החצאים הראשון והשני של סדרת הזמן בנפרד, והשוו את מהירות הצמיחה והדינמיקה המתאימות.כצפוי, לא התגלו הבדלים משמעותיים. חשוב לזכור, כי בגלל התאים מסונכרנים prometaphase, הצפיפות של microtubule הוא גבוה מאוד. לכן, יש להגדיר את הפרמטרים של הניתוח בזהירות רבה, לא כדי מזהה בטעות microtubule שונים.ניתן להשוות את המדידה של דינמיקת microtubule בשיטה זו עם מחקרים של מטרות ביולוגיות אחרות ישירות, בעקיפין, ויסות microtubules.

measurement-microtubule-dynamics-spinning-disk-microscopy-monopolar

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מתארים את טכניקת מיקרוסקופ השתקפות ההפרעות (IRM) כדי לדמיין מיקרוטובולים הגדלים על משטח כיסוי בנוכחות חיץ מתאים. עם הארה עם תאורת אירוע, ממשק חיץ הכיסוי וממשק החיץ-מיקרוטובול מחזירים אור, המשתלב ליצירת תבנית התאבכות, ומאפשר הדמיה של מיקרוטובולים כתמונות בעלות ניגודיות גבוהה על רקע בהיר.

מיקרוסקופ השתקפות הפרעות להדמיה ללא תוויות של דינמיקה של מיקרוטובולים

Microtubules מטבעם פולימרים לא יציבים, ומיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות microtubules המפולח עם כובעי ייצוב photoablatable. Depolymerization של microtubules המפולח יכול להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע לניתוח של תנועות עם קצות microtubule פירוק.

הכנת Microtubules מקוטע לחקר תנועות מונעים על ידי מסתיים microtubule הפירוק

פרוטוקולים לתרבית תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC), טרנספקציה חולפת של סמנים פלואורסצנטיים של צמיחת מיקרו-צינוריות, הדמיית תאים חיים וניתוח אוטומטי של דינמיקת צמיחת מיקרו-צינורות בין-פאזיים.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

ההרכבה והמיקום של הציר המיטוטי תלויים בכוחות המשולבים הנוצרים על ידי דינמיקת מיקרו-צינורות, חלבונים מוטוריים ומקשרים צולבים. כאן אנו מציגים את השיטות שפותחו לאחרונה בהן הכליאה הגיאומטרית של טיפות אמולסיה כדוריות משמשת לבנייה מחדש מלמטה למעלה של צירים מיטוטיים בסיסיים.

כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים

ניצני שמרים הוא מודל יתרון לחקר הדינמיקה microtubule in vivo עקב גנטיקה חזקה שלה ואת הפשטות של שלד התא microtubule שלה. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להפוך ותאי שמרי התרבות, לרכוש תמונות מיקרוסקופיה confocal, וגם כמותית לנתח דינמיקת microtubule בתאים חיים שמרים.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

פרוטוקול זה הוא מדריך ליישום מיקרוסקופ הפרעות הפרעה על מיקרוסקופ מתקן פלואורסצנטית רגיל עבור תוויות ללא תווית, ניגודיות גבוהה, הדמיה במהירות גבוהה של microtubules באמצעות משטחי החוץ מבחנה assays.

יישום של מיקרוסקופ רפלקציה הפרעות עבור הדמיה ללא תווית, במהירות גבוהה של Microtubules

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת הדינמיקה של היווצרות צירים והתקדמות mitotic. היישום שלנו של הדמיה זמן לפקיעה מאפשר למשתמש לזהות תאים בשלבים שונים של mitosis, לעקוב ולזהות פגמים mitotic, ולנתח את הדינמיקה הציר ואת הגורל mitotic cell בעת חשיפה לתרופות נגד mitotic.

הדמיה של תא חי כדי להעריך את הדינמיקה של תזמון מטאמפאזה ואת הגורל התאים בעקבות Mitotic צירים רטבאליות

פרוטוקול זה מוקדש להדמיה של מיקרוטובול פלוס-קצה על ידי טרנספקטציה של חלבון EB3 כדי לחקור את התכונות הדינמיות שלהם בתרבית התאים העיקרית. הפרוטוקול יושם על פיברובלסטים ראשוניים אנושיים שהתקבלו מחולים במחלת הנטינגטון.

הדמיה של מיקרוטובול פלוס-אנד דיינמיקס במודל מחלת הנטינגטון המבוססת על פיברובלסטים של העור העיקרי האנושי

כאן, בדיקת שחזור במבחנה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF מוצגת כדי לכמת ולהשוות בו זמנית את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות microtubule. שיטה מתוארת כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של חלבונים מרובים הקשורים microtubule הקשורים על חבילות microtubule מקושרים ו microtubules יחיד.

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשחזור צרורות מיקרוטובולים במבחנה וכימות ישיר של הכוחות המופעלים בתוכם באמצעות השמנה אופטית סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. בדיקה זו מאפשרת מדידה ברמה ננומטרית של הכוחות והתזוזות הנוצרים על ידי הרכבי חלבונים בתוך רשתות מיקרוטובולים פעילות.

מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית (DDM) משלבת תכונות של פיזור אור דינמי ומיקרוסקופיה. כאן מוצג התהליך של שימוש ב- DDM כדי לאפיין רשתות שלד ציטוסקטון משוחזרות על ידי כימות הדינמיקה התת-מפוזרת והכלוב של חלקיקים ברשתות וימנטין והתנועה הבליסטית של מרוכבים פעילים המונעים על ידי מיוזין אקטין-מיקרוטובול.

כימות דינמיקת שלד ציטוסקלטון באמצעות מיקרוסקופיה דינמית דיפרנציאלית

למדו שיטה לניתוח דינמיקת מיקרוטובולים בתאי HeLa מסונכרנים בפרומטאפז באמצעות מיקרוסקופיית דיסק סיבובי ועיבוד תמונה ב-MATLAB. השיטה מפחיתה פוטוטוקסיות ומאפשרת מחקר מנגנוני מחלה וגילוי תרופות.

מדידה של מיקרוטוכדורית על ידי ספינינג מיקרוסקופ דיסק ב-מונוסולאר Mitotic צירים

גלה סרטונים נוספים