Name: הערכה אלקטרו-מגנטית של אלקטרואופטיקה פעילות מודולציט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: חקור את ההשפעות האלקטרומכניות של GtACR1 בקרדיומיוציטים של ארנב באמצעות טכניקות patch-clamp וסיבי פחמן. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מקיף של פעילות חשמלית ומכנית בתאי שריר לב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסטפני פרז-פלאיז לקבלת סיוע טכני מעולה, ד ר ג'ונאס וויטק (הומבולדט-אוניברסיטת ברלין, גרמניה) למתן pUC57-GtACR1 פלסמיד, פרופ ' ד ר מיכאל שכטר (Charité-אוניברסיטת ברלין, מכון הספורט פארמקולוגיה, ברלין) עבור הייצור אדנווירוס וד ר אנסטסיה Khokhlova (אוראל האוניברסיטה הפדרלית) על שיתוף המומחיות שלה כדי לשפר את פרוטוקול בידוד התא כדי לעצב מחדש את הכיוונון הכיפוף צינורות. הפרויקט מומן על ידי קרן המחקר הגרמני (SPP1926: SCHN 1486/1-1; מלגת אמי-נתר: SCHN1486/2-1) ו-ERC גרנט מתקדם המענק.

<ol><li>Harz, H., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-regulated+calcium+currents+in+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas.</a> Nature. 351, 489-491 (1991).</li>
<li>Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+electric+potential+in+the+phototaxis+of+the+alga+Haematococcus+pluvialis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis.</a> Nature. 271, 476-478 (1978).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-1%3A+A+Light-Gated+Proton+Channel+in+Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Lozier, R. H., Bogomolni, R. A., Stoeckenius, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriorhodopsin%3A+a+light-driven+proton+pump+in+Halobacterium+Halobium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Bacteriorhodopsin: a light-driven proton pump in Halobacterium Halobium.</a> Biophysical journal. 15 (9), 955-962 (1975).</li>
<li>Schobert, B., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halorhodopsin+is+a+light-driven+chloride+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Halorhodopsin is a light-driven chloride pump.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (17), 10306-10313 (1982).</li>
<li>Inoue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-driven+sodium+ion+pump+in+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A light-driven sodium ion pump in marine bacteria.</a> Nature Communications. 4, 1678(2013).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Light+Sensitivity+Optical+Neural+Silencer%3A+Development+and+Application+to+Optogenetic+Control+of+Non-Human+Primate+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A High-Light Sensitivity Optical Neural Silencer: Development and Application to Optogenetic Control of Non-Human Primate Cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 18(2011).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Grimm, C., Silapetere, A., Vogt, A., Bernal Sierra, Y. A., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties%2C+substrate+specificity+and+optogenetic+potential+of+the+engineered+light-driven+sodium+pump+eKR2%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the engineered light-driven sodium pump eKR2.</a> Scientific Reports. 8, 9316(2018).</li>
<li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), New York, N.Y. 409-412 (2014).</li>
<li>Berndt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Guided+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Guided Transformation.</a> Science. 344 (6182), New York, N.Y. 420-424 (2014).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
<li>Mohamed, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+inhibition+of+larval+zebrafish+behaviour+with+anion+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins.</a> BMC Biology. 15 (1), 103(2017).</li>
<li>Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Neuronal+Silencing+in+Drosophila+during+Visual+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Neuronal Silencing in Drosophila during Visual Processing.</a> Scientific Reports. 7, 13823(2017).</li>
<li>Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+channelrhodopsins+for+inhibitory+cardiac+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics.</a> Scientific Reports. 6, 33530(2016).</li>
<li>Kopton, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Electrophysiological+Effects+of+Light-Activated+Chloride+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1806(2018).</li>
<li>Peyronnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Load-dependent+effects+of+apelin+on+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+mechanics+of+rat+cardiomyocytes+under+isometric%2C+unloaded%2C+and+physiologically+loaded+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single cell mechanics of rat cardiomyocytes under isometric, unloaded, and physiologically loaded conditions.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), 196-202 (2004).</li>
<li>Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials%2C+ion+channel+currents+and+transverse+tubule+density+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes+maintained+for+6+days+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action potentials, ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 43 (6), 814-827 (1996).</li>
<li>Burton, R. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolae+in+Rabbit+Ventricular+Myocytes%3A+Distribution+and+Dynamic+Diminution+after+Cell+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Caveolae in Rabbit Ventricular Myocytes: Distribution and Dynamic Diminution after Cell Isolation.</a> Biophysical Journal. 113 (5), 1047-1059 (2017).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Janssen, P. M., Hunter, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force%2C+not+sarcomere+length%2C+correlates+with+prolongation+of+isosarcometric+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Force, not sarcomere length, correlates with prolongation of isosarcometric contraction.</a> The American Journal of Physiology. 269 (2), 676-685 (1995).</li>
<li>Monasky, M. M., Varian, K. D., Davis, J. P., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+force+decline+from+calcium+decline+by+preload+in+isolated+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of force decline from calcium decline by preload in isolated rabbit myocardium.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 456 (2), 267-276 (2008).</li>
<li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+light-sensitive+and+fast+neuronal+activation+with+the+Ca+2%2B-permeable+channelrhodopsin+CatCh%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Schneider-Warme, F., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+to+fight+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Using light to fight atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).</li>
<li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li>
<li>Bernal Sierra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channel-based+optogenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Potassium channel-based optogenetic silencing.</a> Nature Communications. 9 (1), 4611(2018).</li>
<li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9 (1), 3949(2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

בעוד כלים אלקטרואופטיקה לאפשר אפנון של אלקטרופיזיולוגיה התא להתרגש באופן לא פולשני, הם זקוקים לאפיון יסודי בסוגים שונים של תאים (g., CM) כדי לאפשר לאחד לבחור את הכלי הזמין הטוב ביותר עבור עיצוב ניסיוני ספציפי. טכניקת התיקון-מהדק היא שיטה סטנדרטית להערכת מכשירים אלקטרופיזיולוגיה סלולריים. בתצורת התא כולו, היא מאפשרת להקליט זרמים המופעל באמצעות תמונה על פני קרום הפלזמה או שינויי הזמן במתח ממברנה בעקבות גירוי באור/עכבות. מניפולציה אלקטרואופטיקה של עירור חשמל משפיע גם על התכווצויות ס מ. אנו משתמשים במעקב סרקומר ומדידות פחמן בעזרת סיבים לכמת את ההשפעות של החקירה האופטית על הפעילות המכנית של מיציטים.
אנו מתארים פרוטוקול כדי לאפיין את ההשפעות הבסיסיות של ערוץ כלוריד מגודר באור, GtACR1, ב-CM. כמו מערכת מודל, אנחנו בחרה הארנב ס מ, כמו מאפיינים אלקטרופיסיולוגיים שלהם (למשל, צורת AP ותקופה עקשן) דומה לאלה שנצפו ב-CM האנושית יותר קרוב מאשר ס מ מכרסם. יתר על כן, ארנב ס מ יכול להיות תרבותי במשך כמה ימים, מספיק זמן עבור משלוח אדנונגיפי וביטוי של GtACR1-eGFP. בעיקר, מבודד ס"מ לשנות את התכונות המבבניות שלהם בתרבות לאורך זמן, כולל עיגול של סופים תאים ואובדן הדרגתי של הצלב, T-הכרישים מערכת ו בורקולאה23,24. בשורה עם זה, שינויים פונקציונליים דווחו בתרבות CM: depolarization של פוטנציאל הממברנה נח, הארכה של AP ושינויים סלולרי Ca2 + טיפול. לסקירה של עיבודים סלולריים בתרבות, נא לראות Louch ואח '25. משלים איור 2 מציג AP למופת והתכווצות מדידות של ס"מ מבודדים טריים להשוואה עם אלה שנצפו בשנת התרבות (איור 6, איור 7) באמצעות הפרוטוקול המוצג כאן.
הקלטות מצמד התאים המלא מאפשרים מדידות ישירות של מאפייני פוטונוכחיים (לדוגמה, הגברה וקינטיקה) ושינויים בעלי האור בתכונות של ממברנה או מאפייני AP ברזולוציה גבוהה. עם זאת, הקלטות כאלה יש מספר מגבלות: ראשית, ציטוסול מוחלף על ידי פתרון פיפטה בהקלטות שלמות, אשר יתרון לשלוט מעברי האלקטרו-מדרגתיים יוניים, אבל יש את החיסרון הפנימי של שטיפת כביסה הסלולר אורגלים, חלבונים ותרכובות אחרות, ובכך פוטנציאל להשפיע על תגובות חשמל סלולריים. שנית, תופעות לוואי כמו הפעלה של ערוצי יון נוספים הנובע depolarization ארוכה מבחינה פיזיולוגית (למשל, קבועים בזמן איטי של ערוצי יונים מגודרת) קשה להעריך כמו השיטה שלנו רק מאפשר אחד כדי לזהות שינויים APD, אבל לא לנהל מדידות ישירה של ריכוזי יונית בתאי התא הרלוונטיים אלקטרופיזיולוגית. זה יכול להיעשות עם אינדיקטורים פלורסנט (למשל, Ca2 + חיישנים) או יון בררני אלקטרודות. אפיון נוסף עשוי לכלול בעוצמת האור החדירות, קביעת תלות של pH, קינטיקה פוטושוטפת בפוטנציאל ממברנה שונים, וקינטיקה שחזור במהלך גירוי אור חוזר.
בניגוד הקלטות תיקון-קלאמפ, מדידות כוח תא בודד לאפשר ניתוח של התכווצויות הסלולר של מיציטים שלמים מבלי להשפיע על הסביבה תאיים שלהם. השפעות משניות על ריכוזי יונים (למשל, Ca2 +) יכול להיות מוערך בעקיפין על ידי קביעת כוח שנוצר משרעת דינמיקה (g., מהירות מקסימלית של התכווצות והרפיה; כאן לא מנותח). מדידות כוח עם הטכניקה סיבי פחמן יש יתרון על תאים באופן חופשי מתקשרת כפי שהם מספקים מידע ישיר על כוחות פסיבי ופעיל בתאים שנטענו מראש (כלומר, בתנאים דומים יותר באתרו או vivo הגדרות). טעינה מכנית חשובה במיוחד כאשר מנתחים את הסלולר, כמו המתיחה משפיע על ייצור כוח והרפיה26,27.
גישות אלקטרואופטיקה מאפשרות מניפולציה מדויקת באופן מדויק של הפוטנציאל של הממברנה התאית, הן ב-CM אחת והן ברקמות לב שלמות. באופן קלאסי, ChR2, ערוץ הקטיון שאינו סלקטיבי, שימש לדפולריזציה של פוטנציאל הממברנה, בעוד משאבות פרוטונים ו/או כלוריד מונחות אור שימשו להיפולריזציה ממברנה. שתי הקבוצות של מפעילים אלקטרואופטיקה דורשים רמות ביטויים גבוהים, כמו ChR2 מאופיין על ידי מוליכות נמוכה מיסודה הערוץ יחיד28 ומשאבות אור הובלה מקסימאלית יון אחד לכל פוטון נספג. יתר על כן, הפעלה ממושכת של ChR2 ס"מ עשוי להוביל Na+ ו/או Ca2 + עומס יתר, ומשאבות אור מונחה יכול לשנות טרנס-sar, H+ או Cl- מעבריצבע29,30. בחיפוש אחר כלים חלופיים לבקרת האלקטרואופטיקה בפעילות CM, בדקנו לאחרונה את מתעל הGtACR1 הטבעי, המאופיין ביחס מהיר של מוליכות-ערוץ יחיד ורגישות גבוהה יותר בהשוואה לקטיון כגון ChR2. מצאנו כי הפעלה GtACR1 הדפולזים ס מ והוא יכול לשמש עבור צעדים אופטיים עיכוב, בהתאם הדופק האור תזמון ומשך. יתרון נוסף של שימוש ב-ACR במקום הקטיון יכול להיות האפשרות היפוך שלילי יותר של קלרנית- לעומת Na+, הפחתת זרמי יונים שהוצגו באופן מלאכותי. כפי שראינו בעבר, התנועה האופטית עם GtACR1 עשוי להוביל לתקשורת AP כתוצאה מרכיב איטי של סגירת ערוץ GtACR1, אשר ניתן להתגבר על ידי שימוש מהר יותר GtACR1 מוטציות19. עם זאת, נקודת הגישה AP הוא הרבה פחות מבוטא בעת שימוש נמוך יותר, מיותר לשימוש פיזיולוגי תאיים (ראה איור 6). יתר על כן, עיכוב GtACR1-תיווך על ידי תוצאות תאורה ממושכת depolarization ממברנה עמוקה, אשר שוב יכול להפעיל משנית Na+ ו-Ca2 + זרם, ובכך לשנות את הפעילות של ערוצים מגודרת מתח. במדידות שלנו, אנו מוצאים כי AP ופרמטרים התכווצות להתאושש בסיסית בתוך 40 s לאחר עיכוב אור המושרה עבור 1 דקות (ראה Kopton ואח ' 2018, איור 6, איור 7). K+ ערוצים מגודרת מציעים חלופה חזקה עבור השתקה ס מ בלי להשפיע על הממברנה ס מ המנוחה פוטנציאל31.
בעתיד אנו רוצים להשוות בין כלים אלקטרואופטיקה שונים עבור הפוטנציאל שלהם לעכב פעילות לב. לשם כך, אנו בודקים מגוון של ערוצי יונים מגודרת, כולל ACR, ChR2 ו-red-העביר משתנים32, כמו גם היתר מפעילים כגון halorhodopsin או האור מגודרת adenylyl Cyclase bpac בשילוב עם ערוץ אשלגן SthK (PAC-K)31.
הפרוטוקול המוצג כאן יכול לשמש לאפיון מעמיק של המאפיינים האלקטרומכניים של CM. היא ישימה בעיקר גם ס מ ממינים אחרים, ו-CM מבודדים משריר הלב החולה. גירוי אופטי מאפשר אחד לקצב ס"מ בתדרים שונים, יטען שונים ניתן לבדוק במהלך ניסויים התכווצות סיבי פחמן. ניסוי מעניין יהיה להשתמש תאורה בעוצמה נמוכה לדפולריזציה subpol, כדי לחקות את העלייה הדרגתית בפוטנציאל קרום מנוחה, כפי שניתן לצפות במהלך התפתחות של שיפוץ רקמות לב במהלך התקדמות המחלה. לבסוף, מדידות תפקודית יכול להיות משולב עם Ca2 + הדמיה לתובנה נוספת לתוך התכווצות עירור צימוד, או עם התערבויות תרופתי כדי להעריך את ההשפעות של תרופות שונות על פעילות CM.

ChR-תיווך פוטוזרמים הוקלטו לראשונה בעין אצות ירוקות חד-תאיים1,2. זמן קצר לאחר שיבוט גנטי וביטוי הטרוולוגי של Chlamydomonas ריינהרט ChR1 ו ChR2, ChR שימשו ככלים לשנות את פוטנציאל הממברנה ב-xenopus oocytes ו התאים המיונקים על ידי אור3,4. קטיון לא סלקטיבי ChR מקרטת את קרום התאים עם פוטנציאל ממברנה מנוחה שלילי לפוטנציאל ההיפוך של ChR. הם יכולים ובכך לשמש כדי לעורר AP בתאים להתרגש, כולל נוירונים ו-CM, המאפשר התנועה האופטית5,6.
המשלים לקטיון, פרוטון מונחה אור, כלוריד ונתרן7,8,9 שימשו כדי לעכב פעילות עצבית10,11,12. עם זאת, לאלה יש מגבלות, הדורשות עוצמות אור גבוהות ותאורה מתמשכת, כיון אחד מועבר לכל פוטון נספג. ב-2014, שני מחקרים עצמאיים על ידי "וויטק ואח '" ו-berndt et al. תיאר את ההמרה של ביצוע הקטיון באמצעות מוטציות בנקבובית ערוץ13,14. שנה מאוחר יותר, התגלו ACR טבעי בקריפטהיטה גילארדיה תטה (gtacr)15. כפי מהונדסים ACR הראה היקף מוליכות שיורית, הם הוחלפו על ידי ACR טבעי, המאופיין על ידי מוליכות גדולה של ערוץ יחיד ורגישות גבוהה באור15. Gtacr נהגו להשתיק את הפעילות העצבית על ידי הקטפה את פוטנציאל הממברנה כלפי פוטנציאל היפוך של16,17. Govorunova ואח ' להחיל GtACR1 על מתורבת המוח העצמי עכברוש והראה פוטועכבות יעיל ברמות נמוכות של עוצמת אור כי לא היו מספיקים כדי להפעיל כלים מעכבות זמין בעבר, כגון משאבת פרוטון Arch18. הקבוצה שלנו דיווחה לאחרונה כי פוטואינהיביציה בתיווך של ס מ מבוסס על depolarization וכי GtACR1 יכול לשמש גם, לכן, עבור צעדים אופטיים של CM19.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אלקטרופיזיולוגיה ואפקטים מכניים של GtACR1 photoactivation פעלה על הארנב מתורבת CM. אנו מתארים תחילה בידוד תאים, מקולף והתמרה. ההשפעות האלקטפיזיולוגיות נמדדות באמצעות הקלטות שלמות של תאים מהדק. זרמים בתיווך אור במתח ממברנה נתון מוערך במצב V-קלאמפ. הדינמיקה הפוטנציאלית של הממברנה נמדדת בעוד התנועה החשמלית או התנועה האופטית (I-קלאמפ mode). עיכוב אופטי של AP מופעל חשמלית נבדק באמצעות יישום אור מתמשך. השפעות מכניות נמדדות באמצעות סיבי פחמן בשילוב עם מעקב מבוסס הדמיה של אורך סרקומר. כדי לעשות זאת, תאים הניתנים לחיבור מכני הם מכנית מתחת למסך על ידי הצמדת שני סיבי פחמן לקרום פלזמה ליד מסתיים התא הנגדי. שינויים באורך sarcomere נרשמים במהלך הצעדים האופטיים או החשמליים. לבסוף, הפוטועכבות נמדד במהלך גירוי שדה חשמלי של התאים, וכוחות שנוצרו מנותח.
הפרוטוקול כולל את השלבים הבאים המוצגים בתרשים הזרימה באיור 1: הרדמה עמוקה הארנב, הזרקת מנת יתר של הראש, כריתה של הלב, לאנגדורף-פרזיה ועיכול רקמות, דיסוציאציה מכנית של הרקמה לשחרר תאים, ניתוח מיקרוסקופי של תשואה cm, culturing של ס מ, התמרה עם סוג אדנווירוס 5, ו
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig1a.jpg"> איור 1: תרשים זרימה של הפרוטוקול המשמש להשגת ס מ מבחינה חשמלית ואופטית. הלבבות מועכלים מארנבים 9-10 שבועות, ורקמות לב מתעכלים בזמן השימוש בכיוונון לאנגדורף. התאים משתחררים מעצבנות מכנית. התשואה CM נחשבת תחת מיקרוסקופ. ס מ הם מתורבתים, התמרה עם סוג אדנווירוס 5 וניסויים פונקציונליים מתבצעים 48-72 שעות לאחר התמרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig1alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד - בידוד תאים/תרבית/התמרה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adeno-X Adenoviral System 3 CMV</td><td>TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., מאונטיין וויו, קליפורניה, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורית אבי העורקים</td><td>Radnoti</td><td></td><td>4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L מ"מ</td></tr><tr><td>כיסויים ולוכסן; 16 מ"מ, עובי מס' 0</td><td>VWR International GmbH, לובן, בלגיה</td><td>631-0151</td><td>בורוסיליקט זכוכית</td></tr><tr><td>גריפין משי, שחור, 2 מ' אורך, גודל 3, 0.5 מ"מ</td><td>סמואל ממצאים, לונדון, בריטניה</td><td>חממת TSGBL3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ניו ברונסוויק, אפנדורף, Sch&ouml; nenbuch, שוויץ</td><td>Galaxy 170S</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff-perfusion set-up</td><td>Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbl&auml; serei, פרייבורג, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבת לנגנדורף</td> בהתאמה אישית <td>Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Z&uuml; עשיר, שוויץ</td><td>ISM444</td><td></td></tr><tr><td>רשת: ניילון מונודור בד סינון</td><td>קדיש דיוק רשתות בע"מ</td><td></td><td>800 ומיקרו; m חורים,</td></tr><tr><td>תא נויבאואר</td> ברוחב 1 מ '<td>VWR International GmbH, לובן, בלגיה</td><td>717806</td><td></td></tr><tr><td>ארנב, ניו זילנד</td> לבן <td>צ'ארלס נהר</td><td>זן קוד: 052</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Aesculap AG, טוטלינגן, גרמניה</td><td>BC774R</td><td>Bauchdeckenschere ger. 18 ס"מ</td></tr><tr><td>מסנן סטרילי, 0.22 ומיקרו; m</td><td>Merck, דרמשטדט, גרמניה</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד - תיקון-clamp</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplfier</td><td>AxonInstruments, יוניון סיטי, קליפורניה, ארצות הברית</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip &oslash; 50 מ"מ, עובי מס' 1</td><td>VWR International GmbH, לובן, בלגיה</td><td>631-0178</td><td>בורוסיליקט זכוכית</td></tr><tr><td>דיגיטייזר Axon Digidata</td><td>Molecular Devices, San Jos&eacute;, CA, ארצות הברית</td><td>מסנן 1550A</td><td></td></tr><tr><td>(530/20)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>11513878</td><td>BZ:00</td></tr><tr><td>Filter (630/20)</td><td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, ארצות הברית</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>AxonInstruments, Union City, CA, ארצות הברית</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Interface</td><td>Scientifica, אוקפילד, בריטניה</td><td>מתלה 1U, 352036</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 ננומטר</td><td>התקני לומינוס , סאניווייל, קליפורניה, ארצות הברית</td><td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת בקרת LED</td><td>Essel מחקר ופיתוח, טורונטו, קנדה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת בקרת LED</td><td>בהתאמה</td><td></td><td></td>אישית</tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Narishige Co., טוקיו, יפן</td><td>מיקרוסקופ PP-830</td><td></td></tr><tr><td>הפוך</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ממונע</td><td>Scientifica, אוקפילד, בריטניה</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>מד כוח אופטי</td><td>Thorlabs, ניוטון, ניו ג'רזי, ארצות הברית</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>גריז סיליקון</td><td>RS רכיבים, קורבי, בריטניה</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>חוטי כסף</td><td>A-M Systems, Sequim, WA, ארצות הברית</td><td>787500</td><td>כסף, חשוף 0.015 אינץ', מצופה 0.0190 אינץ', אורך 25 רגל</td></tr><tr><td>נימי זכוכית סודה ליים</td><td>Vitrex Medical A/S, Vasekaer, דנמרק</td><td>160213 BRIS, ISO12772</td><td>1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm</td></tr><tr><td>Software Axon pClamp</td><td>Molecular Devices, San Jos&eacute;, CA, ארצות הברית</td><td>גרסת 10.5</td><td></td></tr><tr><td>Software MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטייג' מיקרומטר</td><td>Graticules Optics LTD, טונברידג', בריטניה</td><td>1 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד - סיבי פחמן</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סיבי פחמן</td><td>מסופקים מפרופ' ז'אן-איב לה גואנק</td><td></td><td>BZ:00</td></tr><tr><td>Digitizer Axon Digidata</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ארצות הברית</td><td>מסנן 1550B</td><td></td></tr><tr><td>(530/20)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה</td><td>מסנן 11513878</td><td></td></tr><tr><td>(630/20)</td><td>Chroma Technology, Bellows Falls, ורמונט, ארצות הברית</td><td>ממשק</td> מערכת פלואורסצנטי 227155 <td></td></tr><tr><td></td><td>IonOptix, Milton, MA ארצות הברית</td><td>FSI-800</td><td>2.0 OD x 1.16 ID x 100 L מ"מ</td></tr><tr><td>מערכת מתמר כוח</td><td>Aurora Scientific Inc., אונטריו, קנדה</td><td>406A</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית לכוח מדידות</td><td>מכשירי הרווארד, הוליסטון, מסצ'וסטס, ארצות הברית</td><td>ממשק GC200F-10</td><td></td></tr><tr><td>מכשירים</td><td>לאומיים מכשירים לאומיים, בודפשט, הונגריה</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 ננומטר</td><td>התקני לומינוס , סאניווייל, קליפורניה, ארצות הברית</td><td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td>תיבת בקרת LED</td><td>אסל מחקר ופיתוח, טורונטו, קנדה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקרת LED מערכת</td><td>מיקרו-בקר בהתאמה</td><td></td><td></td>אישית</tr><tr><td></td><td>Parallax Inc., רוקלין, קליפורניה, ארצות הברית</td><td>מדחף</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Narishige Co., טוקיו, יפן</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת MyoCam-S</td><td>IonOptix, דבלין, אירלנד</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת MyoCam-S כוח</td><td>IonOptix, מילטון, MA, ארצות הברית</td><td>MCS-100</td><td></td></tr><tr><td>ממריץ שדה MyoPacer</td><td>IonOptix Collaboration, מילטון, MA, ארצות הברית</td><td>MYP100</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Motor</td><td>Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>E-501.00</td><td></td></tr><tr><td>סיליקון גריז</td><td>RS רכיבים, קורבי, בריטניה</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה Axon pClamp</td><td>Molecular Devices, San Jos&eacute;, CA, ארצות הברית</td><td>גרסה 10.5</td><td></td></tr><tr><td>Software IonWizard</td><td>IonOptix, דבלין, אירלנד</td><td>גרסה 6.6.10.125</td><td></td></tr><tr><td>Software MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטייג' מיקרומטר</td><td>Graticules Optics LTD, טונברידג', בריטניה</td><td>1 מ"מ</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>A9251-100G</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Honeywell Fluka, מוסקגון, מישיגן, ארה"ב</td><td>21114-1L</td><td></td></tr><tr><td>L-קרניטין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>C9500-25G</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 2, 315 U/mg</td><td>וורת'ינגטון, לייקווד, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>קריאטין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>C0780-50G</td><td></td></tr><tr><td>ציטוזין-ובטא;- D-arabinofuranoside</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, קרלסרוהה, גרמניה</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL</td><td>Pfizer Pharma PFE GmbH, ברלין, גרמניה</td><td>PZN-07829486</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin 50 מ"ג/מ"ל</td><td>Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, ארה"ב</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>הפרין-נתרן, 5,000 IU/mL</td><td>Braun Melsungen AG, Melsungen, גרמניה</td><td>PZN-03029843</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין (בקר לבלב)</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>I6634-50MG</td><td></td></tr><tr><td>K-aspartate</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>A6558-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td><td>26764.260</td><td>1 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Honeywell Fluka, מוסקגון, מישיגן, ארה"ב</td><td>35113-1L</td><td></td></tr><tr><td>למינין מסרקומה של עכברים Engelbreth-Holm-Swarm ממברנת הבסיס</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>M199-Medium</td><td>Sigma-Aldirch, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>A9187-1G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>63069-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific, Loughborough, Leics., בריטניה</td><td>10428420</td><td></td></tr><tr><td>NaCl-Solution 0.9%, איזוטון Kochsalz-L&ouml; סונג 0.9%</td><td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>3200950</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>AppliChem GmbH, דרמשטאדט, גרמניה</td><td>A6579</td><td>ללא Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Na-pyruvat</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>P2256-100MG</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מלוח חוצץ</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>פולי(2-הידרוקסיאתיל מתאקרילט)</td><td>סיגמא, פול, בריטניה</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאז XIV מ- Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארצות הברית</td><td>T0625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental Inresa 0.5 גרם</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, פרייבורג, גרמניה</td><td>PZN-11852249</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine hydrochloride, Rompun 2%</td><td>Bayer Vital GmbH, לברקוזן, גרמניה</td><td>PZN-01320422</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה אלקטרו-מגנטית של אלקטרואופטיקה פעילות מודולציט

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

במהלך שני העשורים האחרונים, כלים אלקטרואופטיקה הוקמו כאמצעי חזק כדי לווסת את סוג התא פעילות ספציפית ברקמות להתרגש, כולל הלב. בעוד המתקשר-2 (ChR2) הוא כלי נפוץ כדי לבצע הקטפולאת הפוטנציאל הממברנה בקרדיומיקוציטים (CM), פוטנציאל לעורר פוטנציאל פעולה (AP), כלי יעיל עבור השתקה אמין של פעילות CM חסר. זה כבר הציע להשתמש אניון מתקשרים (acr) עבור מעכבות אלקטרואופטיקה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי להעריך את ההשפעות של הפעלת ACR GtACR1 טבעי מ גילארדיה תטא ב הארנב התרבותי ס מ. הקריאות הראשיות הן אלקטרופיסיולוגית תיקון הקלטות ומעקב אופטי של התכווצויות ס"מ, שניהם ביצעו תוך החלת דפוסים שונים של גירוי באור. הפרוטוקול כולל בידוד ס מ לב ארנב, זריעה ו culturing של התאים עד 4 ימים, התמרה באמצעות קידוד אדנווירוס עבור ערוץ כלוריד אור מגודרת, הכנת מלחציים טלאי הגדרות סיבי פחמן, איסוף נתונים וניתוח. שימוש בטכניקת טלאי-מהדק בתצורת תא שלם מאפשר אחד להקליט זרמים המופעל באור (במצב מהדק מתח, V-קלאמפ) ו-AP (הנוכחי מלחציים מצב, אני-קלאמפ) בזמן אמת. בנוסף לניסויי תיקון-מלחציים, אנו מבצעים מדידות והערכה פונקציונלית להערכת פעילות של CM מבלי להפריע לסביבה התאיים. כדי לעשות זאת, תאים מכנית טעון מרחוק באמצעות סיבי פחמן הצירים נרשמים על ידי מעקב אחר שינויים באורך סרקומר ומרחק סיבי פחמן. ניתוח נתונים כולל הערכה של משך AP מ-I-קלאמפ הקלטות, זרמי השיא מ-V-קלאמפ הקלטות וחישוב כוח מדידות סיבי פחמן. הפרוטוקול המתואר ניתן להחיל על בדיקות של השפעות ביופיזיקלי של מפעילים אלקטרואופטיקה שונים על פעילות CM, תנאי מוקדם לפיתוח הבנה מכניסטית של ניסויים אלקטרואופטיקה ברקמת הלב ולבבות שלמים.

GtACR1-eGFP באה לידי ביטוי בשנת התרבות התרבותית CM (איור 6 הכנס) ו הפוטוזרמים נמדדו עם טכניקת טלאי מהדק. הפעלת photoactivation מראה זרמים גדולים מכוונים פנימה-74 mV. באיור 6הזרם שיא (IP) ב 4 mW/mm2 הוא 245 pA. AP הופעלות או חשמלית (איור 6ב) או אופטית (איור 6ג) עם זריקות הנוכחי 1.5 פעמים את הסף, או קצר הקיטוב פולסים אור של 10 ms, בהתאמה. ניתוח ערכי APD, CM חשמלית מראה את ה-APD 20 של 0.24 ± 0.08 s ו-APD 90 של 0.75 ± 0.17 s, ואילו CM בקצב מהיר מראה APD 20 של 0.31 ± 0.08 s ו-APD 90 של 0.81 ± 0.19 s (SE, n = 5, N = 2, בדוגמה המוצגת כאן APD 20חשמל = 0.17 APD 20אופטי = 0.27 s ו apd 90חשמל = 0.61 s; APD 90אופטי = 0.68 s; איור 6ד). CM בקצב optically מראה התפרצות AP איטית יותר (איור 6D). הפעלה ס מ היתה מעוכבים על תאורה מתמשכת (עבור 64 s, 4 mW/mm2) על ידי הקיטוב פוטנציאל הממברנה כלפי פוטנציאל היפוך של כלוריד, כאן-58 MV (איור 6E). זריקות הנוכחי גבוהה יותר 1.5 פעמים הסף לא לעורר את הדור AP (איור 6F). כוחות שיא שנוצר נקבעו מפני סיבי פחמן (איור 7B, C, E). CM שנוצר 232 μN/mm2 על הצעדים החשמליים (איור 7ב) ו 261 μn/mm2 הבאים התנועה האופטית (איור 7ג). פולסים באור ירוק ממושך מעכבים התכווצויות (איור 7E). בעקבות עיכוב אופטי עבור 64 s, התכווצויות מחדש ליצור כוח התכווצות נמוכה יותר, ואת ערכי כוח להתאושש לקראת בסיס אחרי ~ 10 התכווצויות (הליכה ב 0.25 הרץ, איור 7ד) בשמירה על אובדן סידן דיאסטולי מ ארנבת ס.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig6a.jpg"> איור 6: טלאי הנציג-הקלטות קלאמפ של הקלטה חשמלית ומעכבות בקצב מבחינה אופטית (א) תמונה ייצוגית ב-74 mV באמצעות פולס קל של 300 ms, 4 mW/mm2. IP מציין את השיא הנוכחי. ההוספה מציגה תא GtACR1-eGFP חיובי. (ב) הקלטת ap הנציג ב-0 pa באמצעות הרמפה הנוכחית של 10 ms, 0.6 nA לקצב החשמלית של CM. (C) נציג AP ב-0 pA באמצעות פולסים באור של 10 ms, 0.4 mW/mm2. (ד) התרשים העליון מציג את כיסויהנקודת של ה -10 של הגישה החשמלית (כחול) והמופעל באופן אופטית (ירוק) ב-CM. AP היושרים על-ידי השינוי המירבי בפוטנציאל הממברנה (dV/dt max). הגרף התחתון מראה את ההבדל של פוטנציאל הממברנה בין AP ו חשמלית המופעל מופעל (eאופטי-eחשמלי). (ה) מופעל בחשמל AP מעוכבים תחת אור מתמשך של 64 s, 4 mW/mm2. (ו) AP מעוכבים על ידי זריקות הנוכחי גבוה יותר 1.5 פעמים הסף (מ 0.7 na בשלבים של 0.1 na כדי 2.2 na) תחת אור מתמשך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig6alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig7a.jpg"> איור 7: נתונים מייצגים מתוך הקלטות סיבי פחמן של ס"מ ובקצב חשמלית/מעוכבים. (א) מוצג בתוכנת רכישת הנתונים. תמונה (I) מציג את CM נמדד עם החלון לחישוב אורך סרקומר. רוחב התא מתויג בכתום. (1) טווח תדרים רלוונטיים. (2) קשת כוח FFT מראה את התדירות של המרווח סרקומר בתא. אורך סרקומר הממוצע מחושב מתדר שיא. (3) חלון מעקב אורך sarcomere. (4) מעקב בעוצמה. (5) מעקב האינטנסיביות המוכפל בחלון המינג הוא סימן האינטנסיביות של החלונות. ערכה (II) מציגה את החתך האליפטי של התא. רוחב בכתום ועובי בכחול מקווקו. תמונה (III) מראה את המיקום של סיבי פחמן עם תיבות זיהוי בהתאמה, שמאל באדום וימין בירוק. (6) מעקב בעוצמה. (7) הנגזרת הראשונה של מעקב האינטנסיביות (ראה תוכנת רכישת נתונים ידנית). (ב) סימן מייצג של התכווצויות חשמלית מעוררת. פאנל (I) מראה את קיצור האורך סרקומר, פאנל (II) את המרחק בין שתי סיבי פחמן. (ג) הסימן המייצג של התכווצויות הוטיות בצורה אופטית (525 nm, 0.25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). פאנל (I) מראה את קיצור האורך סרקומר, פאנל (II) את המרחק בין שתי סיבי פחמן. (ד) שנוצר כוח שיא מכיווץ 1 עד 11 לאחר השהיה הנגרמת על ידי עיכוב של יצירת AP. (ה) מעקב מייצג של עיכוב אופטי של התכווצויות תחת תאורה מתמשכת (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). פאנל (I) מראה את קיצור האורך סרקומר, פאנל (II) אורך בין שתי סיבי פחמן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig7alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>קצת</td>
			<td>אזור</td>
		</tr>
<tr>
<td>ACR</td>
			<td>בעלי מתקשר</td>
		</tr>
<tr>
<td>AP</td>
			<td>פוטנציאל פעולה</td>
		</tr>
<tr>
<td>APD</td>
			<td>משך זמן פוטנציאלי לפעולה</td>
		</tr>
<tr>
<td>CFU</td>
			<td>יחידה להקמת מושבה</td>
		</tr>
<tr>
<td>ChR</td>
			<td>מתקשרים</td>
		</tr>
<tr>
<td>ס מ</td>
			<td>החייאה</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל מיכל</td>
			<td>חלבון פלורסנט ירוק משופר</td>
		</tr>
<tr>
<td>ESD</td>
			<td>הקצה דפורמציה תא סיסטולי</td>
		</tr>
<tr>
<td>איחוד האירופי</td>
			<td>יחידות אנדוטוקסין</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>כוח</td>
		</tr>
<tr>
<td>FFT</td>
			<td>התמרת פורייה מהירה</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל שגיא</td>
			<td>גילרדיה תטא אניעל מתעל דוסין</td>
		</tr>
<tr>
<td>GUI</td>
			<td>ממשק משתמש גרפי</td>
		</tr>
<tr>
<td>I-קלאמפ</td>
			<td>מלחציים נוכחיים</td>
		</tr>
<tr>
<td>IU</td>
			<td>יחידות בינלאומיות</td>
		</tr>
<tr>
<td>MOI</td>
			<td>ריבוי של זיהום</td>
		</tr>
<tr>
<td>פולי-HEMA</td>
			<td>פולי (2-הידרוקסיל מתיאקריל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>מהדק V</td>
			<td>מהדק מתח</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 5: רשימת קיצורים.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1a.jpg"> משלים איור 1: מדידות אינטנסיביות אור עם מד כוח אופטי. (A) מדידה של 10 ms פולסים באור ב 4 mW/mm2. (ב) מדידה של תאורה מתמשכת של 64 s ב-4 mW/mm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2a.jpg"> איור משלים 2: מאפיינים של ס"מ מבודדים טריים והסתגלות מבנית שלהם בתרבות. (א) הקלטת AP של ס"מ מבודדים טריים (apd 20 של 1.11 ± 0.34 s, apd 90 של 1.96 ± 0.32 s, n = 7, n = 2). מתכוון לנוח ממברנה פוטנציאל של-79.3 ± 0.8 mV (n = 7, N = 2). (ב) פחמן סיב הקלטה של ס מ מבודדת טרי בקצב מבודד. ממוצע כוח שיא של 205 ± 78 μn/mm2 (N = 7, n = 2). (ג) תמונות מיקוד של ס מ מבודד טרי (I); (II) והתמרה (III) CM לאחר 48 שעות בתרבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2alarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
חומר משלים: MatLab סקריפט כדי לקבוע APD ומנוחה פוטנציאל הממברנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/SupplementalMaterial.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

אנו מציגים פרוטוקול להערכת ההשפעות האלקטרו-מאלקטרומכניים של הפעלת GtACR1 בקרדיוציטים בארנבים. אנו מספקים מידע מפורט על בידוד התא, culturing ו אדנונגיפי התמרה, ועל ניסויים פונקציונליים עם מלחציים טלאי וסיבי פחמן.

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

באמצעות הפרוטוקול כהשפעה ביופיזית של מפעילים אופטוגנטיים שונים על פעילות cardiomyocyte ניתן לבדוק כדי לסייע בפיתוח ניסויים אופטוגנטיים ברקמת הלב ולבבות שלמים. על ידי שילוב טכניקת מהדק טלאי עם מעקב סרקומר ומדידות כוח בסיוע סיבי פחמן, אנו יכולים ללמוד את ההשפעות של פוטואקטיביזציה GtACR1 על החשמל והמכניקה של קרדיומיוציטים חדרית. עיכוב אופטוגנטי יכול לשמש דפיברילציה אופטית.GtACR1 הוא כלי אופטוגנטי המאפשר השתקה של פעילות לבבית. טכניקה זו ישימה באופן מלא לתחומי מחקר אחרים כגון מחקרים חלקים ותא שרירים חד-תאי. למרות שלא ניתן להשתמש בפרוטוקול זה להקרנת תפוקה גבוהה, הוא מספק אמצעי לניתוח מקיף של תפקוד חשמלי ומכאני קרדיומיוציט.אז כמו שאומרים, תמונה אומרת יותר מאלף מילים. כמה מידע נוסף אנחנו יכולים לקבל על פני וידאו? חלק מהכולים והטכניקות שלנו המעורבים במתיחות מיוציט יחיד בהכנת בדיקה הם מורכבים מאוד והרבה יותר קל להעביר אותם בסרטון בהשוואה לתיאור.לאחר שהדם נשטף מהלב המפוזר מלוחים וארנב לבן ניו זילנדי בן תשעה עד עשרה שבועות, מעבירים את הזלוף לתמיסת סידן נמוכה, אשלגן גבוה ומבלבלים את הלב לשתי דקות נוספות לאחר שהלב מפסיק לפעום. יש להחדיר את תספור האנזים, להתחיל לחזור למאגר לאחר שתי דקות של עיכול, ולהקטין את המהירות ל-16 מיליליטר לדקה לאחר חמש דקות של עיכול. לאחר הרקמה מופיע רך לאחר 40-50 דקות של עיכול, לחתוך את הלב את cannula ומיד למקם את הלב בתת פתרון חסימה.הוסף פתרון חסימה עד הרקמה מכוסה במלואה. חותכים את החדר הימני ואת מחיצה ולהפריד את החדר השמאלי. הסר את שרירי papillary ולהשתמש מטסים עדין פיפטה בעדינות לפרק את הרקמה כדי לשחרר את התאים על ידי דיסוציאציה מכנית.סנן את ההשעיה של התא דרך רשת שינוי עם נקבוביות בריבוע מילימטר אחד ומשקם את התאים על ידי צנטריפוגה. ואז לחדש את גלולת cardiomyocyte בת פתרון חסימה טרי. לניסוי מהדק טלאי, כיסויים autoclaved מעיל בצלחת פטרי עם 100 מיקרוגרם למיליליטר של למינין מיד לפני תרבות התא.לניסוי סיבי פחמן, מעיל צלחות פטרי עם 0.12 גרם למיליליטר של פולי-HEMA בתתא 95-5 אתנול למים. עשר עד 15 דקות לאחר שימוש חוזר בקרדיומיוציטים, להסיר את supernatant ולתלות מחדש את התאים במדיום תרבות. לאחר הספירה, זרע את התאים על כיסוי בצלחת פטרי בצפיפות יעד של 1.75 פעמים 10 לארבעת התאים למיליליטר.דגירה התרבויות במשך שלוש עד ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. בסוף הדגירה, החלף את המדיום מתרבות הכיסויים במדיום טרי המכיל אדנווירוס סוג חמש קידוד עבור GtACR1-eGFP בריבוי של זיהום של 75. להחזיר את התרבויות לאנקובטור במשך 48 שעות.כדי לבצע ניסוי מהדק טלאי, השתמש במשך מיקרופייט כדי למשוך 1.7 עד 2.5 מגה-פחם פיפס טלאי משני זכוכית סודה ליים ולאתחל את תוכנת רכישת הנתונים. מניחים כיסוי עם תאים לתוך תא המדידה המכיל פתרון חיצוני ולבחור את cardiomyocyte מבוסס על פלואורסצנטיות eGFP שלה. לאחר מכן, למלא פיפטה תיקון עם פתרון פנימי ולצרף את פיפטה למחזיק פיפטה החדרת חוט כסף מצופה כלוריד כסף כסף לתוך הפתרון הפנימי.הגדר את בדיקת הממברנה כדי להחיל פולסים של 10 מילי-וולט למשך 15 אלפיות שניה עם בסיס של אפס מילי-וולט. לאחר הגעה לתצורה המחוברת לתא, עבור למצב תא שלם עם פוטנציאל החזקה של מינוס 60 מילי-וולט בתוכנת רכישת הנתונים. לאחר מכן בעדינות להחיל לחץ שלילי כדי לגשת לתצורת התא כולו על ידי קרע את הממברנה.קרע מוצלח יוצג על ידי עלייה מיידית בקיבוליות הנמדדת. הקלט פרוטוקולי פוטואקטיביזציה במצב מהדק מתח במינוס 74 מילי-וולט עם פולסים קלים של 300 אלפיות שניה או פוטנציאל פעולה במצב מהדק נוכחי באפס פיקומפר. כדי לייצר את סיבי הפחמן, תחילה לעלות פיפטה על מחזיקי פיפטה של מושך.משוך את נימי הזכוכית לתוך שתי פיפטים עם אורך מחודד כולל של כ 11 מילימטרים קוטר פנימי סופי של כ 30 מיקרומטר. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי ליישר נימי אחד בעיגול הכיוון ולכופף אותו עד 45 מעלות על ידי דחיפת כלפי מטה על קצה נימי עם כשף. מחממים את התסיסה עד נימי שומר על זווית 45 מעלות גם לאחר הנדר מוסר.לאחר כיפוף נימי, להשתמש מלספות בסדר מצויד צינורות רכים לקחת סיבי פחמן אחד מתוך הצינור להתאים אותו לתוך הקצה בסדר של נימי. לדחוף את הסיבים נימי עד העיקול. חותכים את סיבי הפחמן כך שהם מקרינים שני מיליליטר מהקצה של נימי ולהשתמש דבק cyanoacrylate כדי לתקן את הסיבים בחלק הקדמי של כל נימי.כדי לכייל את הסיבים, חבר נימי אחד למחזיק הנשלט על ידי מיקרומניפולטור ומנוע פיזו. הזיזו את נימי לכיוון החיישן ויישרו אותו ביחס לחיישן. מניחים את קצה הסיב במגע עם חיישן הכוח מבלי לייצר כל כוח.התנועה הכוללת של מנוע הפייזו היא 60 מיקרומטר. הזז את מנוע הפיזו בשישה 10 צעדים מיקרומטר לכיוון חיישן הכוח. החיישן יש רגישות של 0.05 millinewtons לכל וולט וטווח כוח של אפס עד 0.5 מילניוטון.קרא את המתח הנמדד עבור כל צעד ולהסיר את סיבי הפחמן מהחיישן. כדי לתעד את הכוח של קרדיומיוציטים מתכווץ, לצפות את פני השטח של coverglass עם Poly-HEMA ולמקם אותו בתא המדידה. ממלאים את התא בתסרון אמבטיה חיצוני.חבר את שני נימי סיבי הפחמן הטעונים למיקרומניפולטור הבמה ויישר אותם בזווית כך שסיבי הפחמן יהיה קרוב אופקי לפני השטח של תא המדידה. כדי לבדוק אם הסיבים מיושרים כהלכה, התמקדו על פני השטח של תא המדידה, הורידו את הסיב הראשון והזיזו את הסיב אופקית. קצה הסיב צריך להיות מחליק על פני השטח של תא המדידה.בצע את אותו הליך עבור הסיב השני. עם האורות כבויים, להוסיף כמה טיפות של השעיית תאים מתורבתים לתא ולהחיל פולסים אור ירוק קצר כדי לבחור תאים מתכווצים בתגובה לגירוי אור ירוק. כדי לחבר את הסיב הראשון, בעדינות לדחוס את התא על ידי הורדת הסיב ואז לשחרר את הלחץ.חבר את הסיב השני במקביל לזה הראשון בקצה השני של הקרדיומיוציט על מנת שיהיה מספר מרבי של סרקומרים בין שני הסיבים. לאחר חיבור שני הסיבים, הרם את הסיבים כך שהתא לא יהיה עוד במגע עם פני התא. הכניסו את הסרקוומרים לפוקוס, קבעו את חלון המעקב באורך סרקומר בין הסיבים, ולהשתמש במודול זיהוי הקצה כדי לעקוב אחר כיפוף הסיבים.הגדר את אזורי הזיהוי עם החלונות האדומים והירוקים והגדר סף בנגזרת הראשונה של מעקב עוצמת האור. באופן אופטי קצב התא תוך מעקב אחר אורך sarcomere וכיפוף סיבים. במקרה הזה, צעדנו ב-0.25 הרץ.לאחר הקלטת לפחות 15 התכווצויות אופטיות, השדה לעורר את התא חשמלית. מצא את הסף לגירוי הצירים והחל פי 1.5 ממתח הסף לצעידה חשמלית. עבור פרוטוקול עיכוב, להחיל גירויים חשמליים כדי להפוך התכווצויות ולאחר מכן לחשוף את התא לדופק אור מתמשך ברמות אור שונות.הקלט לפחות 15 התכווצויות לאחר עכבות הנגרמות על ידי אור. GTACR1 בא לידי ביטוי קרדיומיוציטים ארנב מתורבת. פוטואקטיביזציה GTACR1 בעוצמת אור של ארבעה מילי וואט למילימטר בריבוע עבור 300 אלפיות שנייה תוצאות זרמים גדולים מופנים פנימה במינוס 74 מיליליטר עם זרם שיא נמדד של 245 picoampere.בניסוי מייצג זה, פוטנציאל פעולה הופעלו גם חשמלית עם זריקות זרם 1.5 פעמים את הסף או אופטי עם פולסים אור 10 אלפיות שנייה. קרדיומיוציטים בקצב אופטי הפגינו התפרצות פוטנציאלית של פעולה איטית יותר. פוטנציאל פעולה המופעל חשמלית עכב תחת אור מתמשך.זריקות זרם גבוהות יותר ו 1.5 פעמים את הסף במהלך יישום אור מתמשך גם לא לליצור פוטנציאל פעולה. הקרדיומיוציט יצר כוח התכווצות של 232 מיקרונוטון למילימטר בריבוע על צעידה חשמלית ו-261 מיקרונווטון למילימטר בריבוע לאחר צעידה אופטית. פולסים ממושכים של אור ירוק עיכבו את הצירים עם התכווצויות חוזרות שלאחר העכבה ויצרו כוח התכווצות נמוך יותר בהתאם לאובדן הסידן הדיאסטואלי מקרדיומיוציטים ארנבים.אנו ממליצים לתרגל את הטכניקות לפני ביצוע ניסוי, במיוחד כאשר מיקום המיקרו-חיידקים בחושך יכול להיות מאתגר. חשוב מאוד בעת ניתוח התכווצויות cardiomyocyte כפי שהוא יכול להשפיע על ייצור כוח הרפיה. עומסים שונים ניתן ליישם גם עבור ניתוח התכווצות איזוטונית ו auxotonic.טכניקות אלה מאפשרות אפיון של ההשפעות הביופיזיות של הפעלת מפעילים אופטוגנטיים שפותחו לאחרונה בקרדיומיוציטים אשר חיוני לבחירת הכלי האופטוגנטי המתאים ביותר עבור כל ניסוי. שים לב כי התמרה אדנווירוס וכל השלבים הבאים לאחר ההטרנסה צריך להתבצע תחת תנאים ברמה biosafety II.

electromechanical-assessment-optogenetically-modulated-cardiomyocyte

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

כאן אנו מציגים שיטה אופטית התמונה פוטנציאל פעולה, במיוחד cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה דמוי חדרית. השיטה מבוססת על הביטוי מונחה המקדם של חלבון פלואורסצנטי רגיש מתח.

סוג משנה ספציפי פוטנציאל הפעולה אופטי הקלטות-אנוש המושרה Cardiomyocytes חדרית נגזר תאי גזע Pluripotent

כאן אנו מציגים פרוטוקול על הדרכת אוכלוסיה התא באמצעות גירויים חשמליים ומכניים הדמיית פיזיולוגיה של הלב. גירוי מכאני חשמלי זה משפר את הפוטנציאל cardiomyogenic של תאים שטופלו, אסטרטגיה מבטיח טיפול בתאי נוספת, מידול המחלה, והתרופות הקרנה.

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

אנו מציגים את המתודולוגיה עבור בידוד של מוציטים מורטין וכיצד להשיג מתח או סימני הסידן במקביל עם הקיצור סרקומר באמצעות מכשירי האור הפלואורסצנטית עם מדידות הגיאומטריה הדיגיטלית בו.

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

פרוטוקול זה נועד לתאר צעד אחר צעד את הטכניקה של מיצוי והערכה של תפקוד הלב באמצעות cardiomyocytes עור. מתודולוגיה זו מאפשרת מדידה ואימודולציה חריפה של תפקוד myofilament באמצעות ביופסיות קפואות קטנות שניתן לאסוף ממקומות לב שונים, מעכברים לגברים.

להערכת ויטרו של תפקוד הלב באמצעות קרדיומיוציטים עור

כאן אנו מתארים רכישה אופטית ואפיון של פוטנציאל פעולה מתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית במהירות גבוהה.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

עבודה זו מדווחת על שיטה לשליטה בקצב הלב של לבבות מורין שלמים של עכברי channelrhodopsin-2 מהונדסים (ChR2) באמצעות פוטוסטימולציה מקומית עם מערך מיקרו-LED ומיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל קרום הלב.

ניהול מתקדם של קצב הלב על ידי יישום פוטו-גירוי אופטוגנטי מרובה אתרים בלבבות מורין

קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים (hiPSC-CMs) מציעים חלופה לשימוש בבעלי חיים לבדיקת רעילות לב פרה-קלינית. מגבלה לאימוץ נרחב של hiPSC-CMs בבדיקת רעילות פרה-קלינית היא הפנוטיפ הלא בשל, דמוי העובר של התאים. מוצגים כאן פרוטוקולים להבשלה חזקה ומהירה של hiPSC-CMs.

בדיקת קרדיוטוקסיות בתפוקה גבוהה באמצעות מונושכבות קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בוגרים

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד התכווצות בקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים מלבבות תורמים באמצעות מערכת MyoBLAZER, פלטפורמה אמינה להערכת שינויים בהתכווצות הנגרמת על ידי תרופות במהלך הפיתוח הפרה-קליני.

מדידת התכווצות הלב בקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים מבודדים

פרוטוקול זה מדגים שיטה לגירוי אופטוגנטי של נוירונים לבביים פנימיים בלבבות עכברים טרנסגניים. הגישה המתוארת משמשת לחקירת הקינטיקה של הפעלה פתאומית של נוירונים לבביים בלבבות ex vivo ויחסי הגומלין בין פעילות כולינרגית לפעילות קטכולמינרגית.

הפעלה אופטוגנטית של נוירונים אוטונומיים לבביים פנימיים בלבבות עכברים שנכרתו

השימוש באור לשליטה בתאי הלב והרקמות מאפשר גירוי ללא מגע, ובכך שומר על המצב והתפקוד הטבעיים של התאים, מה שהופך אותו לגישה בעלת ערך הן למחקר בסיסי והן ליישומים טיפוליים.

מערכת מיקרופיזיולוגית לבבית לחקר התפשטות Ca2+ באמצעות גירוי אופטי לא גנטי

חקור את ההשפעות האלקטרומכניות של GtACR1 בקרדיומיוציטים של ארנב באמצעות טכניקות patch-clamp וסיבי פחמן. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מקיף של פעילות חשמלית ומכנית בתאי שריר לב.

הערכה אלקטרו-מגנטית של אלקטרואופטיקה פעילות מודולציט

גלה סרטונים נוספים