הערכה אלקטרו-מגנטית של אלקטרואופטיקה פעילות מודולציט

באמצעות הפרוטוקול כהשפעה ביופיזית של מפעילים אופטוגנטיים שונים על פעילות cardiomyocyte ניתן לבדוק כדי לסייע בפיתוח ניסויים אופטוגנטיים ברקמת הלב ולבבות שלמים. על ידי שילוב טכניקת מהדק טלאי עם מעקב סרקומר ומדידות כוח בסיוע סיבי פחמן, אנו יכולים ללמוד את ההשפעות של פוטואקטיביזציה GtACR1 על החשמל והמכניקה של קרדיומיוציטים חדרית. עיכוב אופטוגנטי יכול לשמש דפיברילציה אופטית.

GtACR1 הוא כלי אופטוגנטי המאפשר השתקה של פעילות לבבית. טכניקה זו ישימה באופן מלא לתחומי מחקר אחרים כגון מחקרים חלקים ותא שרירים חד-תאי. למרות שלא ניתן להשתמש בפרוטוקול זה להקרנת תפוקה גבוהה, הוא מספק אמצעי לניתוח מקיף של תפקוד חשמלי ומכאני קרדיומיוציט.

אז כמו שאומרים, תמונה אומרת יותר מאלף מילים. כמה מידע נוסף אנחנו יכולים לקבל על פני וידאו? חלק מהכולים והטכניקות שלנו המעורבים במתיחות מיוציט יחיד בהכנת בדיקה הם מורכבים מאוד והרבה יותר קל להעביר אותם בסרטון בהשוואה לתיאור.

לאחר שהדם נשטף מהלב המפוזר מלוחים וארנב לבן ניו זילנדי בן תשעה עד עשרה שבועות, מעבירים את הזלוף לתמיסת סידן נמוכה, אשלגן גבוה ומבלבלים את הלב לשתי דקות נוספות לאחר שהלב מפסיק לפעום. יש להחדיר את תספור האנזים, להתחיל לחזור למאגר לאחר שתי דקות של עיכול, ולהקטין את המהירות ל-16 מיליליטר לדקה לאחר חמש דקות של עיכול. לאחר הרקמה מופיע רך לאחר 40-50 דקות של עיכול, לחתוך את הלב את cannula ומיד למקם את הלב בתת פתרון חסימה.

הוסף פתרון חסימה עד הרקמה מכוסה במלואה. חותכים את החדר הימני ואת מחיצה ולהפריד את החדר השמאלי. הסר את שרירי papillary ולהשתמש מטסים עדין פיפטה בעדינות לפרק את הרקמה כדי לשחרר את התאים על ידי דיסוציאציה מכנית.

סנן את ההשעיה של התא דרך רשת שינוי עם נקבוביות בריבוע מילימטר אחד ומשקם את התאים על ידי צנטריפוגה. ואז לחדש את גלולת cardiomyocyte בת פתרון חסימה טרי. לניסוי מהדק טלאי, כיסויים autoclaved מעיל בצלחת פטרי עם 100 מיקרוגרם למיליליטר של למינין מיד לפני תרבות התא.

לניסוי סיבי פחמן, מעיל צלחות פטרי עם 0.12 גרם למיליליטר של פולי-HEMA בתתא 95-5 אתנול למים. עשר עד 15 דקות לאחר שימוש חוזר בקרדיומיוציטים, להסיר את supernatant ולתלות מחדש את התאים במדיום תרבות. לאחר הספירה, זרע את התאים על כיסוי בצלחת פטרי בצפיפות יעד של 1.75 פעמים 10 לארבעת התאים למיליליטר.

דגירה התרבויות במשך שלוש עד ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. בסוף הדגירה, החלף את המדיום מתרבות הכיסויים במדיום טרי המכיל אדנווירוס סוג חמש קידוד עבור GtACR1-eGFP בריבוי של זיהום של 75. להחזיר את התרבויות לאנקובטור במשך 48 שעות.

כדי לבצע ניסוי מהדק טלאי, השתמש במשך מיקרופייט כדי למשוך 1.7 עד 2.5 מגה-פחם פיפס טלאי משני זכוכית סודה ליים ולאתחל את תוכנת רכישת הנתונים. מניחים כיסוי עם תאים לתוך תא המדידה המכיל פתרון חיצוני ולבחור את cardiomyocyte מבוסס על פלואורסצנטיות eGFP שלה. לאחר מכן, למלא פיפטה תיקון עם פתרון פנימי ולצרף את פיפטה למחזיק פיפטה החדרת חוט כסף מצופה כלוריד כסף כסף לתוך הפתרון הפנימי.

הגדר את בדיקת הממברנה כדי להחיל פולסים של 10 מילי-וולט למשך 15 אלפיות שניה עם בסיס של אפס מילי-וולט. לאחר הגעה לתצורה המחוברת לתא, עבור למצב תא שלם עם פוטנציאל החזקה של מינוס 60 מילי-וולט בתוכנת רכישת הנתונים. לאחר מכן בעדינות להחיל לחץ שלילי כדי לגשת לתצורת התא כולו על ידי קרע את הממברנה.

קרע מוצלח יוצג על ידי עלייה מיידית בקיבוליות הנמדדת. הקלט פרוטוקולי פוטואקטיביזציה במצב מהדק מתח במינוס 74 מילי-וולט עם פולסים קלים של 300 אלפיות שניה או פוטנציאל פעולה במצב מהדק נוכחי באפס פיקומפר. כדי לייצר את סיבי הפחמן, תחילה לעלות פיפטה על מחזיקי פיפטה של מושך.

משוך את נימי הזכוכית לתוך שתי פיפטים עם אורך מחודד כולל של כ 11 מילימטרים קוטר פנימי סופי של כ 30 מיקרומטר. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ סטריאו כדי ליישר נימי אחד בעיגול הכיוון ולכופף אותו עד 45 מעלות על ידי דחיפת כלפי מטה על קצה נימי עם כשף. מחממים את התסיסה עד נימי שומר על זווית 45 מעלות גם לאחר הנדר מוסר.

לאחר כיפוף נימי, להשתמש מלספות בסדר מצויד צינורות רכים לקחת סיבי פחמן אחד מתוך הצינור להתאים אותו לתוך הקצה בסדר של נימי. לדחוף את הסיבים נימי עד העיקול. חותכים את סיבי הפחמן כך שהם מקרינים שני מיליליטר מהקצה של נימי ולהשתמש דבק cyanoacrylate כדי לתקן את הסיבים בחלק הקדמי של כל נימי.

כדי לכייל את הסיבים, חבר נימי אחד למחזיק הנשלט על ידי מיקרומניפולטור ומנוע פיזו. הזיזו את נימי לכיוון החיישן ויישרו אותו ביחס לחיישן. מניחים את קצה הסיב במגע עם חיישן הכוח מבלי לייצר כל כוח.

התנועה הכוללת של מנוע הפייזו היא 60 מיקרומטר. הזז את מנוע הפיזו בשישה 10 צעדים מיקרומטר לכיוון חיישן הכוח. החיישן יש רגישות של 0.05 millinewtons לכל וולט וטווח כוח של אפס עד 0.5 מילניוטון.

קרא את המתח הנמדד עבור כל צעד ולהסיר את סיבי הפחמן מהחיישן. כדי לתעד את הכוח של קרדיומיוציטים מתכווץ, לצפות את פני השטח של coverglass עם Poly-HEMA ולמקם אותו בתא המדידה. ממלאים את התא בתסרון אמבטיה חיצוני.

חבר את שני נימי סיבי הפחמן הטעונים למיקרומניפולטור הבמה ויישר אותם בזווית כך שסיבי הפחמן יהיה קרוב אופקי לפני השטח של תא המדידה. כדי לבדוק אם הסיבים מיושרים כהלכה, התמקדו על פני השטח של תא המדידה, הורידו את הסיב הראשון והזיזו את הסיב אופקית. קצה הסיב צריך להיות מחליק על פני השטח של תא המדידה.

בצע את אותו הליך עבור הסיב השני. עם האורות כבויים, להוסיף כמה טיפות של השעיית תאים מתורבתים לתא ולהחיל פולסים אור ירוק קצר כדי לבחור תאים מתכווצים בתגובה לגירוי אור ירוק. כדי לחבר את הסיב הראשון, בעדינות לדחוס את התא על ידי הורדת הסיב ואז לשחרר את הלחץ.

חבר את הסיב השני במקביל לזה הראשון בקצה השני של הקרדיומיוציט על מנת שיהיה מספר מרבי של סרקומרים בין שני הסיבים. לאחר חיבור שני הסיבים, הרם את הסיבים כך שהתא לא יהיה עוד במגע עם פני התא. הכניסו את הסרקוומרים לפוקוס, קבעו את חלון המעקב באורך סרקומר בין הסיבים, ולהשתמש במודול זיהוי הקצה כדי לעקוב אחר כיפוף הסיבים.

הגדר את אזורי הזיהוי עם החלונות האדומים והירוקים והגדר סף בנגזרת הראשונה של מעקב עוצמת האור. באופן אופטי קצב התא תוך מעקב אחר אורך sarcomere וכיפוף סיבים. במקרה הזה, צעדנו ב-0.25 הרץ.

לאחר הקלטת לפחות 15 התכווצויות אופטיות, השדה לעורר את התא חשמלית. מצא את הסף לגירוי הצירים והחל פי 1.5 ממתח הסף לצעידה חשמלית. עבור פרוטוקול עיכוב, להחיל גירויים חשמליים כדי להפוך התכווצויות ולאחר מכן לחשוף את התא לדופק אור מתמשך ברמות אור שונות.

הקלט לפחות 15 התכווצויות לאחר עכבות הנגרמות על ידי אור. GTACR1 בא לידי ביטוי קרדיומיוציטים ארנב מתורבת. פוטואקטיביזציה GTACR1 בעוצמת אור של ארבעה מילי וואט למילימטר בריבוע עבור 300 אלפיות שנייה תוצאות זרמים גדולים מופנים פנימה במינוס 74 מיליליטר עם זרם שיא נמדד של 245 picoampere.

בניסוי מייצג זה, פוטנציאל פעולה הופעלו גם חשמלית עם זריקות זרם 1.5 פעמים את הסף או אופטי עם פולסים אור 10 אלפיות שנייה. קרדיומיוציטים בקצב אופטי הפגינו התפרצות פוטנציאלית של פעולה איטית יותר. פוטנציאל פעולה המופעל חשמלית עכב תחת אור מתמשך.

זריקות זרם גבוהות יותר ו 1.5 פעמים את הסף במהלך יישום אור מתמשך גם לא לליצור פוטנציאל פעולה. הקרדיומיוציט יצר כוח התכווצות של 232 מיקרונוטון למילימטר בריבוע על צעידה חשמלית ו-261 מיקרונווטון למילימטר בריבוע לאחר צעידה אופטית. פולסים ממושכים של אור ירוק עיכבו את הצירים עם התכווצויות חוזרות שלאחר העכבה ויצרו כוח התכווצות נמוך יותר בהתאם לאובדן הסידן הדיאסטואלי מקרדיומיוציטים ארנבים.

אנו ממליצים לתרגל את הטכניקות לפני ביצוע ניסוי, במיוחד כאשר מיקום המיקרו-חיידקים בחושך יכול להיות מאתגר. חשוב מאוד בעת ניתוח התכווצויות cardiomyocyte כפי שהוא יכול להשפיע על ייצור כוח הרפיה. עומסים שונים ניתן ליישם גם עבור ניתוח התכווצות איזוטונית ו auxotonic.

טכניקות אלה מאפשרות אפיון של ההשפעות הביופיזיות של הפעלת מפעילים אופטוגנטיים שפותחו לאחרונה בקרדיומיוציטים אשר חיוני לבחירת הכלי האופטוגנטי המתאים ביותר עבור כל ניסוי. שים לב כי התמרה אדנווירוס וכל השלבים הבאים לאחר ההטרנסה צריך להתבצע תחת תנאים ברמה biosafety II.