Name: קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: למדו שיטה לבידוד אנטרואידים ממעי דק של עכבר ולכימות תאים מתרבים ומתים באמצעות ציטומטריית זרימה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון השפעות של תרופות וציטוקינים דלקתיים על תאי אפיתל מעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31971062, 31900326, ו 31601022), הקרן המדע הטבעי של מחוז ג'יאנגסו (BK20190043, BK20180838), קרן מחקר של המעבדה מפתח המדינה של ביוטכנולוגיה התרופות, אוניברסיטת נאנג'ינג (KF-GN-202004). הקרן המדע הטבעי של ג'יאנגסו מוסדות ההשכלה הגבוהה של סין (19KJB320003), תוכנית פרנסה וטכנולוגיה של סאזהאו City (SYS2019030), ואת תוכנית חדשנות מחקר עבור בוגרי המכללה של מחוז ג'יאנגסו (KYCX19-1981) . עבודה זו נתמכת גם על ידי טאנג המלומד של אוניברסיטת Soochow.

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים והשתמש של קיימברידג '-Suda מרכז משאבים גנומית (CAM-SU) באוניברסיטת Soochow.
1. בידוד ותרבות אורגאיד מעיים
<ol><li>בידוד של קריפטטים מעיים ותרבות בידור<ol>
<li>המתת חסד בעכבר בן 8 שבועות בסוג פראי עם שאיפת CO2 . השתמש מלקחיים רקמות ומספריים קשתית עדין כדי לנתח כ 8 ס מ של ileum.</li>
		<li>ריקון החוצה באמצעות מזרק עם gavage האכלה מחט עם כ 40 מ ל של מלוחים הקרח קר של Dulbecco של המלח (DPBS), ואז לחתוך לאורכו עם מספריים ולפתוח את ileum.</li>
		<li>חותכים את המעי העקום לחתיכות קטנות (0.5-1.0 ס מ). מניחים את החלקים ב 5 מ ל של DPBS קר קירור קרח ב 15 מ"ל שפופרת חרוט, ואז סלע עבור 5 דקות על הקרח.</li>
		<li>השתמש בבקר הצינורות כדי לבשל את DPBS ולהחליף אותו עם 10 מ ל של מאגר קר 1 (2mm EDTA ב DPBS). . רוק ל -30 דקות על הקרח</li>
		<li>השתמש בבקר הפיפטה כדי לבשל מאגר 1 ולהחליף עם 10 מ ל של מאגר קר 2 (54.9 מ"מ D-sorbitol, 43.4 mM סוכות ב DPBS). נענעי עבור 2-3 דקות ביד (~ 80 שייקים/דקות).</li>
		<li>קח את droplet 20 μL של מאגר 2 תוכן לאחר טלטול ולבדוק תחת מיקרוסקופ.</li>
		<li>מסנן מאגר 2 תוכן עם מסננת תא 70 יקרומטר מעוקר, ולאחר מכן לאסוף את המאגר המסונן עם צינור 50 mL חרוט.</li>
		<li>פיפטה 20 μl של פילטרט על השקופית כדי לספור את הקריפטטים. העבר נפח מספיק של מאגר 2 משלב 1.1.7 כדי להבטיח כי יש ~ 500 הקריפטטים/טוב.</li>
		<li>ספין למטה ב 150 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. , ברגע שמסתובב מסתובב. הוא מזהם את הסופרנטאנט בזהירות</li>
		<li>להשעות קריפטטים ב 50 μL של מטריצה מרתף ממברנה (g., מטריצות) לכל 500 קריפטטים, פיפטה למעלה ולמטה (להיות זהיר כדי למנוע בועות), ואז למקם 50 μL droplet של מטריצה קרום מרתף/קריפטה לערבב במרכז של אחד טוב בצלחת 24. מודדת במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפולימלמטריקס מטריצות קרום מרתף.</li>
		<li>לאחר 30 דקות של פולימוניזציה, בקפידה להוסיף 600 μL של מדיה מיניגוט (מתקדם בינונית הנשר המתוקן של החברה [DMEM]/F12, 2 מ"מ L-alanine-L-גלוטמין, עט/דלקת [100 יחידות/mL], 10 מ"מ Hepes, תוספת N2 [1:100], B27 תוספת [1:50] עם פקטור גידול עוריות [EGF; 50 ng/mL], הראש [100 ng/mL], R-החתן [500 ng/mL], ו Y27632 [10 μM]) לכל באר, ואז להחזיר את הצלחת לחממה 37 ° c. שימו לב תחת מיקרוסקופ כל יום, והחליפו את התקשורת כל שניים-שלושה ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הבעת ההתיישנות הערה: בתרבויות ארוכות יש לפצל את המרכנואידים בקירוב בכל שבוע.<ol>
<li>, כדי לעבור את המרכנואידים. הניחו את צלחת תרבות הרקמה על הקרח ולהוסיף 1 מ ל של DPBS קר לכל טוב. השתמש בטיפ P1000 לפיפטה למעלה ולמטה עד שלא יישארו נתחי מטריצות מוצקים של קרום המרתף.</li>
		<li>מעבר למעלה ולמטה פעם אחת באמצעות מזרק אינסולין 1 מ ל (27 גר') ולתוך צינורית חרוט של 15 מ ל. ספין למטה עבור 5 דקות ב 150 x g ב 4 ° c.</li>
		<li>השתמש בפיפטה כדי להסיר את DPBS. השהה מחדש ב-50 μL של מטריצת קרום המרתף/ובכן.</li>
		<li>מניחים את הצלחת בחממה 37 ° c עבור 30 דקות כדי לאפשר מטריצת קרום מרתף פולימלזציה. כיסוי כל טוב עם 600 μL של מדיה ENR (מיניגוט מדיה, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL ראש, 500 ng/mL R-החתן), ואז להחזיר את הצלחת לחממה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הזרימה Cy, ניתוח של תאים EdU-חיוביים ב-Enteroids
הערה: איור 1 מציג את זרימת העבודה עבור ניתוח cy, המנסה של תאים של EdU-חיוביים ב-enteroids.
<ol><li>דגירה של בידור עם EdU<ol>
<li>לגדול enteroids משלב 1.2.4 עבור 5 – 7 ימים. מעבר בידור לתוך צלחת חדשה 24 טוב ביחס מפצל של 1:2. הוסף 600 μL של מדיום ENR לכל באר. מיכל הדגירה 4-5 ימים בחממה 37 ° c.</li>
		<li>הגדר את קבוצת הביקורת (בידור לא מטופל) ואת הקבוצה הניסיונית (בידור שטופלו עם 5 ng/mL באינטרלוקין 22 [IL-22]). הכינו לפחות שלוש משכפל עבור כל קבוצה.</li>
		<li>הוסף את EdU למדיום ENR כדי להכין את מדיום EdU עם ריכוז של 50 μM. הוסף 600 μL של EdU מדיום לכל טוב ומארג עבור 2 h בחממה 37 ° c. הגדר באר אחת של בידור ללא הטיפול ב-EdU כפקד שלילי לחיסור הרקע.</li>
	</ol></li>
	<li>קציר של בידור מתוך מטריצת קרום המרתף<ol>
<li>השתמש בבקר פיפטה לאספירין בינונית EdU ולשטוף 1x עם DPBS. הוסף 1 מ ל של DPBS.</li>
		<li>השתמש בP1000 הקצה ובפיפטה למעלה ולמטה עד שאין נתחי מטריצות מוצקים של קרום המרתף יישארו. העבר לצינור 15 מ"ל ו ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.</li>
		<li>הוסף 500 μL של אנזימי תא-דיסוציאציה (טבלת חומרים) ו-דגירה עבור 15 דקות ב 37 ° c. השתמש בP200 הקצה ובפיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את הenteroids תאים בודדים.</li>
		<li>הוסף 3 מ ל של מדיום DMEM בינונית המכילה 10% סרום של שור עוברי (FBS) ו פיפטה שוב ושוב עם טיפ P1000.</li>
		<li>ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות ומכה את המדיום supernatant. השהה מחדש את התאים באמצעות 1 מ ל של DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>קיבעון וחדירות של תאים<ol>
<li>העבר את ההשעיה התא לצינור 1.5 mL, ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות, ולהיפטר supernatant.</li>
		<li>להשעות את התאים עם 1 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית), לתקן עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ו ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות. מרוב הסופרנטאנט עם טיפ פיפטה, לשטוף 1X עם dpbs, ו ספין למטה כדי להסיר את הסופרנטאנט.</li>
		<li>השהה מחדש תאים עם 1 מ ל של 0.5% nonionic. דגירה עבור 10 דקות ב RT.</li>
		<li>ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות ומכה את הסופרנטאנט. שטוף 1x עם DPBS ו ספין למטה כדי להסיר את הסופרנטאנט.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי של EdU<ol>
<li>הכנת פתרונות מניות עבור כל רכיב מראש: 1) פתרון עבודה של מאגר התגובות אלקסה Fluor, 2) פתרון עבודה של 1 x EdU התגובה במאגר, ו 3) מניות 10x פתרון של התוסף מאגר של EdU.</li>
		<li>הכינו את תוסף המאגר של 1x EdU על-ידי דילול הפתרון ה1:10 של 10x במים מאוהים. . הכינו את התמיסה הזו רעננה</li>
		<li>הכינו קוקטייל תגובה לפי שולחן 1. הערה: הוסף את המרכיבים בסדר המפורט בטבלה. השתמש בקוקטייל התגובה בתוך 15 דקות של הכנה.</li>
		<li>הוסף 100 μL של קוקטיילים התגובה לכל שפופרת 1.5 mL. להשעות מחדש את התאים, להגן מפני אור, הדגירה עבור 30 דקות ב RT.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ומכה את פתרון התגובה עם טיפ פיפטה בעדינות.</li>
		<li>הוסף 0.5% nonionic חומרים פעילי שטח החדירה לצינור כל לשטוף 1 x ב RT. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות, מטפי את supernatant עם טיפ בעדינות, ולהשעות מחדש את התאים 1 מ ל של dpbs.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח תאים על ידי הציטוקימטריה<ol>
<li>סנן את התאים שהושעו מחדש עם מסננת מ40 יקרומטר, ולאחר מכן אסוף את התאים המסוננים באמצעות צינורית חרוט של 15 מ"ל. בצע זיהוי של FACS במחשב בהקדם האפשרי. הערה: אם התנאים מוגבלים, יש לאחסן את הדגימות המוכתמת בתא בחשיכה ב-4 ° c ובדיקת זרימה תוך 3 ימים.</li>
		<li>בחר את הערוץ המתאים (בהתאם לסוג של אלקסה fluor אזיד ב-EdU kit; כאן, ערוץ אדום) ומתח (כאן, ~ 150 – 350 V) עבור הניתוח cy, מנסה להזרים.</li>
		<li>אסטרטגיית מדון<ol>
<li>ציירו מזימה מדומה של FSC-A (ציר x) לעומת מדינת מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-מדינת-התחתית (ציר y) והפיצו את רוב התאים לטווח הגלוי של מפת הנקודות על-ידי התאמת המתח. בחר את אוכלוסיית התא (R1) והוצא את הריסות התאים בפינה השמאלית התחתונה.</li>
			<li>מאוכלוסיית התאים R1, צור FSC-A (ציר x) vs. מגרש צבע מדומה FSC-H (ציר y) והגדר את השער כדי לבחור תאים בודדים (R2) כדי לכלול את האפשרות של קיבוץ תאים.</li>
			<li>מאוכלוסיית התאים R2, צור את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית (ציר x) לעומת מספר תא (ציר y), והשתמש בפקד השלילי כדי להגדיר את השער. האזור של אות הפלורסנט הוא אזור תא חיובי (R3). השוואת היחס של תאים EdU-חיוביים (R3) בין קבוצות הניסוי והבקרה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. הזרמת Cy, ניתוח של תאי PI-חיוביים במרכנואידים
הערה: איור 2 מציג את זרימת העבודה עבור הניתוח cy, מנסה הזרימה של תאים PI-חיוביים ב-enteroids.
<ol><li>דגירה של תאים enteroid עם PI<ol>
<li>לגדול enteroids משלב 1.2.4 עבור 5 – 7 ימים. מעבר בידור לתוך צלחת חדשה 24 טוב ביחס מפצל של 1:2. הוסף 600 μL של מדיום ENR לכל באר. מיכל הדגירה 4-5 ימים בחממה 37 ° c.</li>
		<li>הגדר את קבוצת הפקדים (לא מטופלת) והקבוצה הניסיונית (IL-22 שטופלו), תוך שימוש בשלוש משכפל עבור כל קבוצה לפחות.</li>
		<li>הוסף PI למדיום ENR כדי להכין מדיום PI עם ריכוז של 3 μM.</li>
		<li>הוסף 600 μL של מדיום PI לכל טוב ומארג עבור 30 דקות בחממה 37 ° c. להגדיר היטב אחד של בידור ללא טיפול PI כפקד שלילי לחיסור הרקע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קציר בידור מתוך מטריקס קרום המרתף בעקבות צעדים 2.2.1-2.2.5.</li>
	<li>ניתוח תאים על ידי הציטוקימטריה<ol>
<li>סנן את התאים שהושעו מחדש עם מסננת מ40 יקרומטר ואסוף את התאים המסוננים באמצעות צינורית חרוט של 15 מ ל.</li>
		<li>בצע זיהוי של FACS במחשב בהקדם האפשרי. הערה: אם התנאים מוגבלים, יש לאחסן את הדגימות המוכתמת בתא בחשיכה ב-4 ° c ובדיקת זרימה תוך 3 ימים.</li>
		<li>בחר את הערוץ המתאים (כאן, ערוץ אדום) ומתח (כאן, ~ 150 – 350 V) לצורך הזרמת הניתוח cy,.</li>
		<li>השתמש באותה אסטרטגית העליה כמתואר בסעיף 2.5.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li>
<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+from+the+crypt%3A+new+insights+into+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li>
<li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier%3A+a+fundamental+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
<li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הנחוצים לתרבות של בידור באמצעות מבחנה וכימות של תאים של EdU ו-PI-חיוביים ב-enteroids על ידי הזרמת cy, try. יש מספר יתרונות של אסטרטגיה זו. ראשית, התוויות של EdU משמשות לזיהוי תאים מתרבים ב-enteroids. בהשוואה לשיטת BrdU המסורתית, שיטת התיוג של EdU היא מהירה יותר, רגישה יותר ומדויקת יותר. EdU דומה מאוד תימין (T), אשר מחליף תימין ב סינתזה DNA במהלך חלוקת התא. לעומת הנוגדן brdu, EdU קל יותר לפזר לתא, וזיהוי של EdU אינו דורש דנטורציה DNA ו אנטיגן נוגדן תגובה. שנית, הניתוח cy, מנסה הזרימה יכול במהירו...

פונקציה יסודית של תאים אפיתל המעי היא להגן על כניסת תוכן הלומיאל כגון חיידקים פתוגניים ורעלים1,2. כדי לבצע פונקציה כזו, תאי גזע המעיים ברציפות מתרבים ולהבדיל למגוון של תאים אפיתל, כולל בידור תאים הפרשה, אשר יוצרים מכשול על ידי יצירת קשרים הדוקים3. התחדשות מהירה של תאים אפיתל המעי דורש תיאום מחמיר של התפשטות התא, בידול התא, ואת המוות התאים4,5. הפצת תאים מופחתת או מוות מופרז של תאים מוביל נזק אפיתל ופגיעה בתפקוד המכשול1,6. תפקוד של מכשול המעיים שויך מחלות מעיים דלקתיות7,8.
שיטה לקריפטטים מעיים תרבותי פותחה בעבר. באמצעות טכניקה זו, עכבר מבודד קריפטים לגדול לתוך מעיים אורגנואידים (enteroids), אשר יש קריפטה-villus כמו מבנים ומכילים את כל השושלת האפיתל המעי תא9,10. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) הוא אנלוגי תימידין כי הוא מסוגל להחליף תימין (T) ב-DNA כי עובר שכפול במהלך הפצת תאים. התאים הניתנים להתרבות יכולים להיות מסומנים במהירות ובדייקנות על-ידי EdU מכתים. Propidium יודיד (PI) הוא אנלוגי של אתידיום ברומיד המשחרר את הזריחה האדומה בעת הכניסה לתוך ה-DNA התקוע כפול. PI מזהה באופן ספציפי תאים מתים, שכן הוא עובר רק דרך קרום התא ניזוק.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים תחילה כיצד לבודד קריפטטים מן המעי הקטן מורטין ואז לתרבות אותם כמו בידור בתוך מבחנה. לאחר מכן נתאר כיצד לנתח את התאים המתרבים והמתים ב-enteroids על ידי EdU ו-PI התאגדות וזרימה cy, לנסות.

<table><tbody><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 גרם מחט גבאג</td><td>'VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 מ"מ מסננת תאים סטריליים</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים סטרילית 70 מ"מ</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>מתקדם DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT אקוסטי מיקוד ציטומטר</td><td>Invitrogen</td><td>A24863</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף</td><td>GIBCO</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>מאגר 1</td><td></td><td></td><td>2 מ"מ EDTA במאגר DPBS</td></tr><tr><td>2</td><td></td><td></td><td>54.9 מ"מ D-סורביטול, 43.4 מ"מ סוכרוז בעכברי</td></tr> <tr><td></td><td>DPBS C57/B6מכון המחקר הביו-רפואי של אוניברסיטת</td><td></td><td></td>נאנג'ינג</tr><tr><td>אנזימי דיסוציאציה תאית (TrypLE)</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>חממת CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr> 14190144 <tr><td>D-סורביטול</td><td>BBI</td><td>SB0491</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BBI</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>ENR מדיה</td><td></td><td></td><td>Minigut, 50 ננוגרם/מ"ל EGF, 100 ננוגרם/מ"ל נוגין, 500 ננוגרם/מ"ל R-spondin</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס עדין</td><td>Tansoole</td><td>2037454</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>אולימפוס</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>עיזים סרום</td><td>חיים טכנולוגיות</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>HDMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Minigut Media</td><td></td><td></td><td>Advanced DMEM/F12, 2 מ"מ גלוטמקס, Penn/Strep (100 יחידות/מ"ל), 10 מ"מ Hepes, תוסף N2 (1:100), תוסף B27 (1:50)</td></tr> <tr><td>תוסף N2</td> R<td>& D</td><td>AR009</td><td></td></tr><tr><td>פעילי שטח לא יוניים (Triton X)</td><td>BBI</td><td>TB0198-500ML</td><td></td></tr><tr><td>מספריים הפעלה (12.5 ס"מ)</td><td>Tansoole</td><td>2025785</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>sigma</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגודיות פאזה</td><td>Nikon</td><td>TS1000</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי R-Spondin 1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td></td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים IL-22</td><td>PeproTech</td><td>210-22-10</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td></td><td>BBI SB0498</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לרקמות</td><td>טנסול</td><td>2026704</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HC1</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב enteroids

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

אפיתל המעי משמש מחסום המונע תוכן הלומיאלי, כגון מיקרוביוטה פתוגניים ורעלים, מלהיכנס לשאר הגוף. תפקוד המכשול אפיתל דורש שלמות של תאים אפיתל המעי. בעוד התפשטות התא אפיתל שומרת על שכבה רציפה של תאים המהווה מחסום, נזק אפיתל מוביל לתפקוד המכשול. כתוצאה מכך, תוכן הלומיאל יכול לחצות את מחסום המעי דרך מסלול בלתי מוגבל. התפקוד של מחסום המעיים נקשר למחלות מעיים רבות, כגון מחלות מעי דלקתיות. מבודד עכבר מעיים קריפטים יכול להיות תרבותי ומתוחזק כמו קריפטה-villus מבנים כמו, אשר מכונים אורגנואידים מעיים או "enteroids". בידור הם אידיאליים ללמוד את התפשטות ומוות התאים של תאי אפיתל המעי בתוך מבחנה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לכמת את מספר התאים המתרבים והמתים בידור תרבותי. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ו propidium יודיד משמשים לתווית תאים מתרבים ומתים ב-enteroids, ושיעור של תאים מתרבים ומתים מנותח לאחר מכן על ידי מנתחים cy, לנסות. זהו כלי שימושי כדי לבדוק את ההשפעות של טיפול תרופתי על התפשטות תא אפיתל המעי הישרדות התא.

קריפטטים מעיים קטנים היו מבודדים ומתורבתים כמו בידור בתוך מטריצת קרום המרתף. בידור החל ליצור ניצנים 2 ימים לאחר בידוד. ביום 6, enteroids היו ניצנים רבים עם המון פסולת (תאים מתים) ב לומן. המונונואידים היו מוכנים להיות בשלב זה (איור 3).
מחקרים רבים הראו כי ציטוקינים דלקתיים חיוניים לתחזוקת הומאוסטזיס אפיתל המעי. ביטוי חריג של ציטוקינים דלקתיים קשורה היטב עם התרחשות של מחלות המעי דלקתיות11. למשל, המחקר הקודם שלנו הראה כי IL-22 מקדם התפשטות של ...

הפרוטוקול המוצג משתמש cy, לנסות לכמת את מספר התאים מתרבים ומתים בתוך העכבר התרבותי enteroids. שיטה זו שימושית להערכת ההשפעות של טיפול תרופתי בשגשוג והישרדות של אורגנואיד.

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

פרוטוקול זה שימושי עבור בידוד enteroid בתרבות בנוסף לחקירת התפשטות התא ואת ההישרדות enteroids. מדענים יכולים ליישם טכניקה זו על enteroids תרבות וללמוד את ההשפעה של תרופות ציטוקינות דלקתיות על תאי אפיתל המעי במבחנה. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול במים של מחלות מעי דלקתיות.אנו מיישמים שיטה זו כדי למצוא כמה ציטוקינות טיפוליות. שיטה זו מספקת תובנות על התפשטות אפיתל המעי והישרדות;בנוסף זה עשוי לשמש גם אורגנואידים, מתורבת סביב רקמות אחרות מאשר המעי. כדי לבודד קריפטות מעיים ולבצע תרבות enteroid, להשתמש במטלות רקמות ולמצוא מספריים איריס לנתח כשמונה סנטימטרים של ileum מעכבר בר בן שמונה שבועות המתת דם.השתמש מזרק עם מחט האכלה gavage לשטוף את ileum עם כ 40 מיליליטר של קרח קר פוספט-Buffered מלוחים, ואז לחתוך לאורך עם מספריים ולפתוח את ileum. חותכים את האיליום לחתיכות קטנות ומ מניחים אותם לחמישה מיליליטר של DPBS קר כקרח סטרילי בצינור חרוט 15 מיליליטר. ואז לנענע את הדגימה במשך חמש דקות על קרח.השתמש בבקר פיפטה כדי לשאפת את ה- DPBS ולהחליף אותו ב- 10 מיליליטר של מאגר קר אחד. לאחר נדנדה במשך 30 דקות על קרח, להשתמש בבקר פיפטה כדי לשווסף חיץ אחד ולהחליף עם 10 מיליליטר של חיץ קר 2. לאחר מכן יש ללחוץ במשך 2-3 דקות ביד בערך 80 שייק לדקה.לאחר רעידות, לבדוק טיפה עשרים מיקרו ליטר של חיץ שני תוכן תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שיש קריפטות עם תאים פאנית פרטניים. סנן מאגר שני תכנים עם מסננת תאים סטריליים של 70 מיקרון ואאסוף את המאגר המסונן בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. פיפטה 20 מיקרוליטרים של סינון על השקופית כדי לספור את הקריפטות.העבר נפח מספיק של המאגר המסונן שני תכנים כדי להבטיח כי ישנם כ 500 קריפטות לכל באר. לסובב למטה ב 150 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן בזהירות שאף את supernatant. תפזרו מחדש את הקריפטות ב-50 מיקרוליטרים של מטריצת קרום מרתף לכל 500 קריפטות.פיפטה למעלה ולמטה דואגת להימנע מבועות. מניחים טיפה של 50 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף ותערובת קריפטה במרכז באר אחת של צלחת 24 באר. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפוך את מטריצת קרום המרתף.לאחר 30 דקות של פולימריזציה, בזהירות להוסיף 600 microliters של מדיה minigut לכל באר. מחזירים את הצלחת לאנקובטור של 37 מעלות צלזיוס, ומתבוננים תחת מיקרוסקופ כל יום, מחליפים את המדיה כל יומיים עד שלושה ימים. כדי לעבור את enteroids, מניחים את צלחת תרבות הרקמה על קרח, שאף את התקשורת, ולהוסיף מיליליטר אחד של DPBS קר לכל באר.השתמשו בקצה P1000 כדי לצנרת למעלה ולמטה עד שלא יישארו גושי מטריצה. מעבירים את הדגימה דרך מזרק אינסולין מיליליטר אחד ומטה לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר. לאחר מסתובב למטה במשך חמש דקות ב 150 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס, להשתמש פיפטה כדי להסיר את DPBS.להשעות מחדש את enteroids ב 50 microliters של מטריצת קרום מרתף לכל באר. מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך 30 דקות כדי לאפשר מטריצת קרום המרתף כדי פולימריזציה. לאחר מכן, שכבו כל באר עם 600 מיקרוליטרים של מדיה ENR והחזירו את הצלחת לאנקובטור.לגדל enteroids במשך חמישה עד שבעה ימים לפני עובר אותם לתוך צלחת חדשה 24 באר באמצעות יחס פיצול של אחד עד שניים. מוסיפים 600 מיקרוליטרים של בינוני ENR לכל באר, ולאחר מכן להתבגר enteroids במשך ארבעה עד חמישה ימים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. הגדר את קבוצת הביקורת של enteroids מטופלים ואת הקבוצה הניסיונית של enteroids שטופלו חמישה ננוגרם למיליליטר של אינטרלוקין-22.הכן לפחות שלושה שכפולים עבור כל קבוצה. הוסף 600 מיקרוליטרים של מדיום EdU לכל באר של enteroids למעט אחד גם להשתמש כבקרה שלילית עבור חיסור רקע. דוגרים את הצלחת במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.כדי לקצור enteroids מטריצת קרום המרתף, להשתמש בבקר פיפטה כדי לשאוף מדיום EdU ולשטוף פעם אחת עם DPBS. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של DPBS. השתמשו בקצה פיפטה P1000 כדי לצנרת למעלה ולמטה עד שלא יישארו גושי מטריצת קרום מרתף מוצקים.מעבירים את הדגימה לצינור 15 מיליליטר ומסתובבים למטה פי 300 G במשך חמש דקות לפני השלכת העל-טבעי. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אנזימי דיסוציאציה של תאים ודגירה למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמשו בקצה פיפטה P200 כדי לצנרת למעלה ולמטה ולשבור enteroids לתאים בודדים.לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום הנשר המשונה של Dulbecco המכיל נסיוב חזיר עוברי של 10%, ופעמה חוזרת ונשנית עם קצה פיפטה P1000. לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, ושואפים את העל טבעי, אנו להשעות את התאים במיליליטר אחד של DPBS. כדי לבצע קיבעון ו permeabilization של תאים, תחילה להעביר את ההשעיה התא לנקודה אחת חמש צינור מיליליטר, להסתובב למטה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי.אנחנו משהים את התאים במיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde ולתקן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, שאף את supernatant עם קצה פיפטה. לשטוף את התאים פעם אחת עם DPBS, ולסובב שוב למטה כדי להסיר את supernatant.תן שימוש חוזר בתאים עם מיליליטר אחד של 0.5% פעילי שטח לא יוניים, ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת התאים עם DPBS כמו קודם. כדי לזהות את EdU, להוסיף 100 microliters של קוקטייל תגובה לכל צינור 1.5 מיליליטר. תדליקו מחדש את התאים, ותגנו עליהם מפני אור, הדגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, בעדינות לשאוף את פתרון התגובה עם טיפ פיפטה להוסיף 0.5% לא יוני פעילי שטח חדירה לכל צינור לשטוף פעם אחת בטמפרטורת החדר. בעקבות צנטריפוגה כמו קודם, אנו להשעות את התאים במיליליטר אחד של DPBS. לסנן את התאים המתווסכלים עם מסננת 40 מיקרון ולאסוף את התאים המסוננים בצינור חרוט 15 מיליליטר.בצע עובדות על זיהוי מכונה בהקדם האפשרי. בחר את הערוץ והמתח המתאימים לניתוח ציטומטריית זרימה. עבור אסטרטגיית gating, לצייר FSC-A לעומת SSC-A העלילה פסאודוקולור ולהפיץ את רוב התאים לטווח הנראה של מפת הנקודות על ידי התאמת המתח.בחר את אוכלוסיית התאים כ- R1 ואל תכלול את פסולת התא בפינה השמאלית התחתונה. מאוכלוסיית תא R1, להקים FSC-A לעומת FSC-H העלילה פסאודוקולור. הגדר את השער כדי לבחור תאים בודדים המוגדרים כ- R2 ולא לכלול גושי תאים.מאוכלוסיית תא R2, להקים את עוצמת הפלואורסצנטיות לעומת התוויית מספר תא ולהשתמש בפקד השלילי כדי להגדיר את השער. האזור של אות הפלואורסצנטי הוא אזור תא חיובי המיועד R3.Compare היחס של תאים חיוביים אלה EdU בין קבוצות הניסוי והבקרה. קריפטות מעיים קטנות היו מבודדות ותרבותיות כזכיות במטריצת קרום המרתף.Enteroids התחילו ליצור ניצנים יומיים לאחר הבידוד. ביום השישי, לאנתנואידים היו הרבה ניצנים עם הרבה פסולת בלומן. האסטרואידים היו מוכנים לעבור בשלב זה.Enteroids טופלו IL-22 במשך 3 ימים, לאחר מכן DNA סינתטי היה מסומן עם EdU באדום כדי להצביע על התפשטות התא. IL-22 enteroids מטופלים הציגו מספר גדל של תאים חיוביים EdU. IL-22 גדל תאים מתרבים מ 40.1% ל 83.5% כפי שנותחו על ידי ציטומטריה זרימה.IL-22 טיפול גם הגדיל את המוות התאי enteroids מסומן על ידי כתמי יודיד פרופידיום באדום. IL-22 עלה בתאים מתים מ-4.9% ל-16.2% כפי שניתח על ידי ציטומטריית זרימה. במהלך התקדמות בידוד הקריפטה יש צורך לרעוד הוגן לאחר הוספת חיץ כדי להבטיח מספיק קריפטות מזועזעות.אנו ממליצים לבדוק את התוכן תחת מיקרוסקופ. בעקבות הליך זה, אנו יכולים גם לכמת את סוגי האפיתליאלים המובחנים ואת enteroids באמצעות שיטה ספציפית שיטה זו תסייע לחוקרים לחקור דיפרנציאלי אפיתל מעיים enteroids. לאחר התפתחותה שאלה זו סוללת דרך לחוקרים בתחום הגסטרואנטרולוגיה לחקור את השאלות ההתפתחותיות או הפתולוגיות בחיתוך.

quantification-of-proliferative-and-dead-cells-in-enteroids

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה להקמת אנטרואידים אנושיים מקריפטות מעי דק וקולונואידים מקריפטות המעי הגס שנאספו הן מרקמות כירורגיות והן מביופסיות. במאמר מתודולוגי זה, אנו מציגים את אופני התרבות החיוניים לצמיחה ותחזוקה מוצלחת של אנטרואידים וקולונואידים אנושיים.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

Enteroids מתגלים כמודל הרומן במחקר של מחלות אנושיות. הפרוטוקול מתאר כיצד לדמות מודל enteroid של האדם enterocolitis נפאסיאטיס באמצעות טיפול ליפופוליסכריד (LPS) enteroids שנוצר מרקמות neonatal. Enteroids שנאספו להדגים שינויים דלקתיים דומה לאלה לראות enterocolitis נפאסיאטיס אנושי.

הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית

פרוטוקול זה מתאר את הדור של מטופלים שמקורם בחולים, וניתוח במורד הזרם כולל כימות של התפשטות, בדיקות ציטורעילות, הזרמת cy, כתמים והדמיה מיקוד, על מנת להעריך את התרופה פוטנציאל המועמדים כtherapeutics אנטינאופלסטית. פרוטוקול זה תומך ברפואה מדויקת עם זיהוי תרופות ספציפיות לכל מטופל ולשלב המחלה.

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

פרוטוקול זה מתאר מודל אנטרוקוליטיס נמקית (NEC)-בצלחת המשתמש באנטרוואידים של המעי הדק עם קוטביות הפוכה, ומאפשר גישה למשטח האפיקלי. אנו מספקים פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה אפיתליאלית הקשורה ל- NEC ושיטה לקביעת הכדאיות של אנטרואידים אפיקליים הנתונים לפרוטוקול NEC-in-a-dish.

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

פרוטוקול זה מפרט את התבססותם של אנטרואידים, מודל מעיים תלת-ממדי, מרקמת המעי העוברית. הדמיה אימונופלואורסצנטית של סמנים ביולוגיים אפיתליאליים שימשה לאפיון מודלים. חשיפה אפית של ליפופוליסכרידים, אנדוטוקסין חיידקי, באמצעות טכניקת מיקרו-הזרקה המושרה חדירות אפיתל באופן תלוי מינון שנמדד על ידי דליפה של דקסטרן פלואורסצנטי.

בדיקת חדירות אפיתל באנטרוידים שמקורם ברקמות עובריות

פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של אנטרוקוליטיס נמקית (NEC), אשר יכול לשמש למחקרים מכניסטיים על פתוגנזה של מחלות. הוא מכיל שבב מיקרופלואידי שנזרע עם אנטרואידים במעי שמקורם במעי היילוד האנושי, תאי אנדותל ומיקרוביום המעי של יילוד עם NEC חמור.

מודל מיקרופלואידי של אנטרוקוליטיס נמקית המשלב אנטרואידים ממעיים של ילודים אנושיים ומיקרוביום דיסביוטי

אנטרואידים מתגלים כמודל חדשני לחקר פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של רקמות, פיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית. כאן, אנו מתארים מערכת תרבית דו-ממדית ממקור אנטרואידים של תאים ראשוניים בקר, המאפשרת תרבית משותפת עם סוגי תאי רקמה רלוונטיים. מודל זה מציע יתרון תרגומי למודלים של מחקר במערכת העיכול.

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית לחקור ולכמת מוות תאי באורגנואידים אנושיים של המעי הגס בתגובה להפרעות ציטוטוקסיות כגון ציטוקינים. הגישה משתמשת בצבע מוות פלואורסצנטי של תאים (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), במיקרוסקופ פלואורסצנטי חי ובתוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח כדי לכמת תגובות אורגנואיד יחיד לגירויים ציטוטוקסיים.

כימות מוות תאי הנגרם על ידי ציטוקינים באורגנואידים של המעי הגס האנושי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי

מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של אורגנואידים חזיריים שמקורם במעי הדק והגס. הצמיחה של חד-שכבות אלו מסומנת על ידי הגדלת ערכי TEER, המעידים על שלמות אפיתל חזקה. בנוסף, חד-שכבות אלה מציגות תגובות הפרשה פיזיולוגיות בניסויי תא אוסינג לאחר יישום פורסקולין.

אורגנואידים דו-ממדיים במעי חזיר המשקפים את התכונות הפיזיולוגיות של המעיים הטבעיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעי אפיקליים מתרביות אורגנואידים סטנדרטיות משובצות מטריצה. הוא גם מתאר את השילוב הבא של EdU בתאים המתרבים באופן פעיל ואת הכימות האוטומטי למחצה של תאים חיוביים ל-EdU.

יצירת אורגנואידים במעי אפיקלי החוצה והערכת קצב התפשטות האורגנואידים באמצעות תיוג EdU

למדו שיטה לבידוד אנטרואידים ממעי דק של עכבר ולכימות תאים מתרבים ומתים באמצעות ציטומטריית זרימה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון השפעות של תרופות וציטוקינים דלקתיים על תאי אפיתל מעי.

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

גלה סרטונים נוספים