Name: זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) Antisense חלבון (ASP) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-PCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: למדו לזהות תעתיקי ASP של HIV-1 בחולים באמצעות שיטת strand-specific PCR. השיטה משתמשת בפריימרים ביוטינילציים וטמפרטורות דנטורציה גבוהות כדי למנוע מוצרים לא ספציפיים ולאפשר הגברה ספציפית של cDNA אנטי-סנס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפטריזיה אמגליו, אלסנדרה נוואל, קרייג פנוויק, ומתיו פרברו, שתמיד יהיו זמינים לדון בעבודתנו ובכל האנשים במעבדת האיידס Immunopathogenesis לסיוע הטכני היקר שלהם. אנחנו גם רוצים להודות לג ואהרון וודל מ VSB המשויכים Inc. שתרמו עם יצירות אמנות מעולה. לבסוף, תודות מיוחדות רבות לכל המטופלים, מבלי שהעבודה הזאת לא הייתה אפשרית. עבודה זו לא קיבלה כל מענק ספציפי משום סוכנות מימון.

מחקר זה אושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת מרכז אשפוז ודוייס (CHUV).
1. זיהום של דם היקפי תאים ברורים (PBMCs) עם HIV-1HXB2 זן
<ol><li>
יום 1: גירוי PBMCs
	<ol>
<li>לבודד PBMCs מעיל באפי תורם בריא.</li>
		<li>לספור ולהשעות מחדש PBMCs בריכוז של 1x106/mL בשנת מלאה רוזוול פארק הזיכרון המכון (RPMI) 1640 בינוני המכיל 10% סרום העוברי (fbs) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין (R-10), עם תוספת של 50 U/ml של interleukin-2 (IL-2) ו 3 μg/ml פיטופפניטין (PHA).</li>
		<li>Pipet למעלה ולמטה ולפצל את התאים ב 2 6-טוב צלחות (3 מ ל של השעיית תא/טוב).</li>
		<li>דגירה עבור 3 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
יום 3: זיהום PBMCs הערה: השתמש באחת משתי הלוחיות כמו בשלב 1.1.3 כפקד שלילי (אל תדביק תאים אלה). התראה: בצע את ההליך כולו במעבדה III ברמת בטיחות (P3).<ol>
<li>PBMCs בריכה מצלחת אחת לתוך שפופרת בז 50 mL וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות.</li>
		<li>להיפטר supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב 2.2 mL של R-10 המכיל 20 U/mL של IL-2 ו-2 μg/mL polybrene.</li>
		<li>הפשרת מבחנות המכילה את נגיף ה-HIV-1HXB2 ולהוסיף 1.8 mL של השעיה ויראלי (0.376 Ng/μl) אל התאים.</li>
		<li>מודרת התאים 2 h ב 37 ° c, בעדינות מתערבל את הצינור כל 30 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות.</li>
		<li>בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים ב-1x106/ml ב-R-10 המכיל IL-2 (50 U/ml).</li>
		<li>העבר את ההשעיה התא לצלחת 24-באר בריכוז של 1 מ ל/ובכן ו דגירה עבור 5 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
		<li>קציר 1 גם כל יום ולהעביר את התאים 1.5 mL שפופרת (מתויג עם יום של זיהום). הערה: לפני צנטריפוגה, העברת 150 μL של השעיית התא לצינור cy try זרם עבור PBMCs בקרת איכות זיהום (ראה שלב 1.3)</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x g עבור 10 דקות ולהיפטר supernatant.</li>
		<li>הקפא את כדורי התא בשעה-80 ° צ' עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
זיהום PBMCs: בקרת איכות
	<ol>
<li>עבור כל יום של זיהום, לאסוף 150 μL של הנגועים PBMCs ולהעביר אותם לתוך הצינור cy, לנסות לזרום.</li>
		<li>הוסף 1 מ ל של מלוחים מאגור פוספט (PBS) ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.</li>
		<li>להיפטר supernatant ולהוסיף 50 μL של PBS המכיל 1 μL של אקווה חיים/צבע מת (בעבר מדולל 1:10 עם PBS).</li>
		<li>מודקון ב 4 ° צ' עבור 15 דקות.</li>
		<li>הוסף 1 mL של PBS, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות, ולהיפטר supernatant.</li>
		<li>הוסף 250 μL של הפתרון קיבעון/החדירות ו-דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
		<li>להוסיף 1 מ ל של 1x סלסול/לשטוף מאגר (מניות 10x פתרון המכיל הן fbs ו סאפונין מדולל 1:10) ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.</li>
		<li>להיפטר supernatant ולהוסיף 50 μL של PBS המכיל HIV מחסום p24 fluorescein isothiocyanate (FITC)-נוגדן מצומדת (מדולל 1:10).</li>
		<li>דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
		<li>הוסף 1 mL של PBS, צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות, ולמחוק את supernatant.</li>
		<li>הוסף 150 μl של x cellfix (מניות 10x פתרון המכיל 10% פורמלדהיד, 3.55% מתנול, 0.93% נתרן אזיד מדולל 1:10) ולנתח תאים על ידי הזרמת cytometry.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. גירוי של CD4 + תאים אנושיים עם אנטי CD3/CD28 נוגדנים
<ol><li>בודד CD4 + T תאים מתוך PBMCs של שני חולים נגועים ב-HIV-1 ותורמים בריאים.</li>
	<li>להכין אנטי CD3/CD28 נוגדן לערבב על ידי דילול anti-CD3 (1:100) ו anti-CD28 (1:50) ב-PBS.</li>
	<li>מעיל 48-צלחת לוח על-ידי הוספת 200 μL של שילוב נוגדן לכל טוב למספר מתאים של בארות ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 2 h.</li>
	<li>משף את פתרון הנוגדן ולהוסיף 1 מ"ל של CD4 + T תאים ב-1x106/mL כדי ANTI-CD3/CD28 מצופה נוגדן בארות. הערה: להמריץ CD4 + T תאים עד 5 ימים.</li>
</ol>3. תמלול הפוך
הערה: כדי להשיג מטופל ספציפי התחל, הספק DNA מבודדים מתאי CD4 + T מכל מטופל היה מוגבר באמצעות HIV-1HXB2 פאן ASP תחל. באמצעות הרצף הפנימי. של התחל הפאן-ASP כל התחל והבדיקות המשמשות במחקר זה מפורטות בטבלה 2.
<ol><li>
בידוד ה-RNA הכולל מתאים
	<ol>
<li>לכמת RNA ולחסל זיהום DNA על ידי טיפול בדגימות עם DNase.</li>
		<li>בצע תגובות RT באמצעי אחסון של 50 μL. העברה 0.1-1 μg של ה-RNA הכולל למספר מתאים של בארות של הצלחת 96-היטב PCR. הכינו את תערובת ה-RNA על ידי הוספת המרכיבים הבאים ל-RNA: 5 μL של ביוטילנטי לאחור (20 μM) 2.5 μL של דיאוקסינוקלאוטיד triphosphates (dNTPs) (10 ממ) 25 μL של דיאטילפירוקרבונט (מתחת למים)-מטופלים מזוקקים (dH2O). הכינו את הפקדים האנדוגניים על ידי הוספת 5 μL של nuclease-מים ללא תשלום במקום פריימר הפוכה ASP ביולוגי.</li>
		<li>מניחים את הצלחת 96 היטב ה-PCR לתוך הציקלונינר וחום תערובת RNA ל 94 ° צ' עבור 5 דקות.</li>
		<li>מיד לצנן את תערובת RNA במים קר לפחות 1 דקות.</li>
		<li>הכינו את תערובת הריאקציה על ידי הוספת הרכיבים הבאים לצינור 1.5 mL (חשב את המספר הכולל של דגימות ועוד 1): 10 μL של מאגר של 5x RT 2.5 μL של 0.1 M של 1, 4-dithioitol (DTT) 2.5 μL של RNase out (40 יחידות/μL) 2.5 μL של אנזים RT (200 יחידות/μL)</li>
		<li>העברת 17.5 μL של תערובת זו לכל אחת מבארות המכילות RNA. הכינו את הבקרות האחרות המחליפים את ההמרה הפוכה עם 2.5 μL של מים ללא השכרה.</li>
		<li>מערבבים בעדינות את הצלחת ב 55 ° c עבור 60 דקות באמצעות הציקלייט.</li>
		<li>הפוך את התגובות על ידי חימום ב 70 ° c עבור 15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. טיהור אהדה של cDNA של ASP ביולוגיים
הערה: לא לטהר את התגובות RT-מינוס.
<ol><li>להכין 1 L של 2x כביסה/כריכה מאגר המכיל 10 מ"מ-HCl (pH 7.5), 1 מ"מ מדיום חומצה (EDTA) ו 2 M הנאל. סנן את הפתרון.<ol>
<li>הכן 50 mL של מאגר כביסה/איגוד של 1x באמצעות מים בכיתות PCR.</li>
		<li>עבור כל תגובה, להשתמש 10 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin מעלה. בהתבסס על מספר התגובות, להעביר נפח מתאים של חרוזים לצינור 1.5 mL.</li>
		<li>שטוף את החרוזים על ידי הוספת נפח שווה של מאגר כביסה/כריכה של 2x ו מערבולת עבור 15 s.</li>
		<li>מניחים את הצינור לתוך מתלה הפרדה מגנטית ו דגירה עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר בזהירות את supernatant מבלי להפריע את החרוזים ולהוסיף את אותו נפח של כביסה/כריכת מאגר 2x כאמצעי האחסון הראשוני של חרוזים.</li>
		<li>מערבולת עבור 30 s ולהעביר 10 μL של הבולם חרוזים למספר מתאים של 1.5 mL.</li>
		<li>מניחים את הצינורות במתלה הפרדה מגנטית ו דגירה עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מחק את הסופרנטאנט והוסף 50 μL של מאגר כביסה/כריכה של 2x.</li>
		<li>הוסף 50 μL של cDNA biotinylated לצינורות המתאימים המכילים את החרוזים.</li>
		<li>דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר מסתובבת בעדינות.</li>
		<li>הפרד את החרוזים מן הסופרנטנט על ידי מתלה הפרדה מגנט עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שטוף את החרוזים על ידי הוספת 200 μL של מאגר כביסה/כריכה של 1x. מניחים את הצינורות בארון הפרדה של מגנט במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים את הסופרנטאנט. . אני חוזר פעמיים</li>
		<li>השהה מחדש את החרוזים ב -10 μL של מים בכיתות PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. התקן PCR
הערה: מטרת ה-PCR הסטנדרטי היא להגביר את כל ה-ORF של הגן של ASP. מוצרי הגברה לאחר מכן משובטת לתוך pCR 2.1 פלאמיד כדי לפתח עקומות סטנדרטיות עבור כימות ASP RNA על ידי PCR בזמן אמת (ראה הפסקה בזמן אמת PCR).
<ol><li>בצע בדיקות סטנדרטי בנפח כולל של 50 μL. הכן נפח מתאים של התמהיל הראשי של ה-PCR (מספר הדגימות ועוד 1). עבור כל דוגמה, הוסף את הרכיבים הבאים לשפופרת 1.5 mL: 1 μL של 10 שירותי התחל ASP (קדימה ואחורה) 1 μL של 10 ממ מ מסוג Dntps מגנזיום כלוריד (MgCl2) (ריכוז תלוי בשימוש התחל) dH2O לנפח הסופי של 49 μl<ol>
<li>מערבבים היטב, במהירות לסובב את התוכן ולהעביר 49 μL/טוב של התמהיל הראשי של ה-PCR לצלחת 96-היטב PCR.</li>
		<li>בזהירות מערבולת צינורות המכילים את החרוזים המשמשים עבור האהדה של ASP cDNA לטיהור עבור 15 s.</li>
		<li>הוסף 1 μL של חרוזים לתוך הבארות המתאימות ולהפעיל את ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה: 95 ° c עבור 2 דקות, 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 30 s, 55 ° c עבור 30, ו 68 ° צ' עבור 40 s, אז 68 ° c עבור 7 דקות.</li>
		<li>הפרד בין מוצרי ה-PCR ל-1% מעלה ג'ל, חותכים את הלהקות ומשובטים את המוצרים המגבונים לתוך pCR 2.1 פלמיד.</li>
		<li>רצף ולנתח את הרצפים של כל שיבוט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. בזמן אמת כמותי PCR (qPCR)
הערה: פיתוח תחל וזונדים ספציפיים למטופלים באמצעות הגישה המתוארת בשלב 3 "תמלול הפוך". עבור התקני qPCR כוללים הדלקות של ASP בעקומות סטנדרטיות. פלמידים המכילים מוסיף מטופלים ספציפיים מפותחים כאמור בהערה בתחילת שלב 5 "ה-PCR הסטנדרטי".
<ol><li>הכן את העקומה הסטנדרטית באמצעות 1:10 מדלל סדרתי של ASP, החל מ -3 x 106 עותקים/μl עד 3 עותקים/μl.<ol>
<li>
הסיבוב הראשון PCR (pre-amp). לבצע תגובות בנפח כולל של 25 μL. הכנת נפח מתאים של התמהיל הראשי של ה-PCR (מספר דגימות ועוד 1). עבור כל דוגמה, הוסף את הרכיבים הבאים לשפופרת 1.5 mL: 0.5 μl של שילוב של ASP או של עטפה פריימר (ריכוז סופי 0.2 μm כל אחד) (קדימה ואחורה) 0.5 μL של שילוב dNTPs (ריכוז סופי 0.2 mM כל אחד) MgCl2 (הריכוז תלוי בזוגות הפריימר) dH2O עד כמות אחרונה של 24 μl</li>
		<li>העבר 24 μL של שילוב מאסטר של ה-PCR למספר מתאים של בארות של לוחית ה-PCR ב96.</li>
		<li>מערבולת בזהירות את הצינורות המכילים את החרוזים עם cDNA עבור 15 s.</li>
		<li>הוסף 1 μL של חרוזים לבארות המתאימות. עשה את אותו הדבר. לדילול הפלזמה</li>
		<li>הפעל את ה-PCR באמצעות האלגוריתם הבא: דנטורציה עבור 2 דקות ב-95 ° צ'; 30 s ב 95 ° צ', 30 s ב 55 ° צ', 40 s ב 68 ° c עבור 18 מחזורים; הארכה ב 68 ° c עבור 7 דקות.</li>
		<li>לדלל את הסיבוב הראשון בדיקות תגובות 1:5 עם המים PCR כיתה.</li>
		<li>
. הסיבוב השני של ה-pcr לבצע תגובות בנפח כולל של 20 μL. הכנת נפח מתאים של התמהיל הראשי של ה-PCR (מספר דגימות ועוד 1). עבור כל דוגמה, הוסף את הרכיבים הבאים לשפופרת 1.5 mL: 1.8 μL 10 מיקרומטר (קדימה ואחורה) 1 μL of בדיקה של 5 μM 6.2 μL של dH2O</li>
		<li>העברה 19 μL של מיקס מאסטר qPCR לתוך מספר מתאים של בארות של 96-ובכן qPCR לוחית ולהוסיף 1 μL של התגובות ה-PCR העגול הראשון מדולל לבארות המקביל. עשה את אותו הדבר. עבור הדילול הפלסטי</li>
		<li>הפעל את ה-qPCR עם האלגוריתם הבא: דנטורציה עבור 10 דקות ב-95 ° צ'; 15 ס ב 95 ° c, 1 דקות ב 60 ° צ' עבור 40 מחזורים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li>
<li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv%2B+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li>
<li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li>
<li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74(2011).</li>
<li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71(2007).</li>
<li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38(2012).</li>
<li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li>
<li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li>
<li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li>
<li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043(2015).</li>
<li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li>
<li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, Pt 4 1019-1027 (2010).</li>
<li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+antisense+protein+%28ASP%29+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li>
<li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells%3A+improvement+by+tagged+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li>
<li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221(2009).</li>
<li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li>
<li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li>
<li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+%28HTLVs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

בדוח זה אנו מתארים שיטת ה-RT הספציפית לסטרנד המוחלת על איתור RNA של ASP בתאים CD4 + T מבודדים מאנשים שנדבקו ב-HIV-1. התרחשות של הטרמה לא ספציפית במהלך RT הסלים את הזיהוי של התעתיקים RNA עם הקוטביות הימנית, המוביל וטעה של התוצאות. הקבוצות הקודמות פיתחו מספר אסטרטגיות שמטרתן למנוע סינתזה בלתי תלויה cDNA במהלך התגובה RT. תיוג בהילוך הפוך על 3 ' סוף עם רצפים שאינם קשורים HIV הוכיחה יעיל להשגת הגברה ספציפית סטרנד6,8,9. עם זאת, גישה ז...

החלבון antisense (ASP) הגן הוא מסגרת קריאה פתוחה (ORF) הממוקם על סטרנד שלילי של הנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) המעטפה (env) גן, הפורש את הצומת gp120/gp411. במהלך 30 השנים האחרונות, מספר דיווחים הראו כי הגן HIV ASP הוא אכן מועתק ותורגם2,3,4,5,6,7,8,9. למרות התעתיקים של ASP antisense כבר מאופיין באופן מלא בתוך מבחנה, עד לאחרונה מידע על הייצור בפועל של ה-RNA של ASP בחולים עדיין חסר.
הרצף של ASP הוא הפוך ומשלים ל-env. זה מייצג מכשול גדול כאשר מנסים לזהות תעתיקים של ASP. שיטת הפוך סטנדרטית לתגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR) שיטות משתמשות גנטית ספציפית אנטי הגיון לסנתז DNAs משלימה (cDNAs) של הקוטביות הימנית. גישה זו, לעומת זאת, אינה מאפשרת לקבוע את הכיוון (תחושה או אנטי-היגיון) של תבנית ה-RNA הראשונית, מכיוון שסיכות או לולאות של RNA יכולות להיות מראש בשני הכיוונים בהעדר התחל10, תופעה הידועה כ-RT-הטרמה עצמית. רוב החוקרים ASP הבעיה של RT הטרמה עצמית באמצעות תחל מתויג עם רצפים שאינם קשורים ל-HIV-111,12. אסטרטגיה זו, עם זאת, אינה מבטלת את התרחשות התופעה, ועלולה לגרום לנשיאה פוטנציאלית של cDNAs שאינו ספציפי ל-PCR11.
פיתחנו לאחרונה הרומן מיוחד סטרנד-PCR שיטת המחקר של RNA antisense ואנחנו השתמשנו בו עבור הזיהוי של ה-RNA ASP בקבוצה של שישה חולים נגועים באיידס, כפי שמוצג בטבלה 1. ההליך המתואר להלן פורסם בעבר על ידי אנטוניו Mancarella ואח '13. בפרוטוקול שלנו, אנו נמנעים מהפקת cDNAs לא ספציפי באמצעות גישה כפולה. ראשית, אנו מסלקים מבנים משניים של RNA על ידי שימוש ב-RNA בטמפרטורה גבוהה (94 ° c), ושנית, אנו הפוכה להפוך את ה-RNA של ASP באמצעות פריימר ביולוגי ברמה של ASP ואהדה-לטהר את התוצאה cDNA. על-ידי גישה זו, אנו מסוגלים להגביר רק את היעד שלנו cdna, מאז מוצרי RT אחרים שאינם ספציפיים מנועים או שנוצר (הטמפרטורה הגבוהה דנטורציה של RNA) או נמחק לפני ה-PCR (טיהור האהדה).

<table><tbody><tr><td>BD LSR II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v1.1 ערכת ריצוף מחזור</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set (100 mM)</td> <td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD4+ T Cell ערכת בידוד</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Biowest</td><td>S1010-500</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פתרון קיבוע/פרמיביליזציה</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>HIV Gag p24 זרימה ציטומטריה נוגדן - Kc57-FITC</td><td>בקמן קולטר</td><td>6604665</td><td></td></tr><tr><td>אנושי IL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-743</td><td></td></tr><tr><td>לקטין מ- Phaseolus vulgaris (PHA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>61764-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כתמי תאים מתים צהובים חיים / מתים הניתנת לתיקון, לעירור 405 ננומטר</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>L34967</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD28</td><td>Becton Dickinson</td><td>55725</td><td></td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD3</td><td>Becton Dickinson</td><td>55329</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים ובדיקות</td><td>DNA משולב טכנולוגיות (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>פלטינה טאק DNA פולימראז נאמנות גבוהה</td><td>Invitrogen, תרמו פישר 11304011</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זיהום פוליברן / מגיב טרנספקציה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy מיני קיט</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 גיבקו בינוני</td><td>, תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus מערכת PCR בזמן אמת</td><td>ביוסיסטם יישומי, תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III טרנסקריפטאז הפוך</td><td>Invitrogen, תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan ביטוי גנים מאסטר מיקס</td><td>ביוסיסטם יישומי, תרמו פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת שיבוט 4369016 TOPO TA לתת-שיבוט, עם One Shot TOP10 תאי E. coli מוכשרים כימית</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>K450001</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase (2 U/&micro; L)</td> <td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (hiv-1) antisense חלבון (asp) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-pcr

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

ב retroviruses, שעתוק החושים שתוארו בנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) ו-T-lymphotropic וירוס 1 (HTLV-1). ב-HIV -1, החלבון antisense של ASP גן ממוקם על סטרנד שלילי של env, במסגרת הקריאה -2, הפורש את הצומת gp120/gp41. בכיוון ההגיון, הקצה של 3 מסגרת הקריאה של ASP חופף עם V4 של אזורים gp120-משתנים ומספר V5. המחקר של ה-RNA ASP סוכלה על ידי תופעה המכונה RT-self-הטרמה, לפיו מבנים משניים RNA יש את היכולת הממשלה RT בהעדר של פריימר ספציפי, יצירת cDNAs לא ספציפי. השימוש המשולב בשילוב עם כדורי היסוד הפוכים ביולוגית בתגובת RT, יחד עם האהדה לטיהור של cDNA על streptavidin מצופה חרוזים מגנטיים, אפשרה לנו באופן סלקטיבי להגביר את ה-RNA של ASP בתאים CD4 + T נגזר מאנשים נגועים ב-HIV-1. השיטה שלנו היא בעלות נמוכה יחסית, פשוט לבצע, מאוד אמין, ובקלות להיות מתוכדל. במובן זה, הוא מייצג כלי רב עוצמה לחקר שעתוק החושים לא רק ב-HIV-1 אלא גם במערכות ביולוגיות אחרות.

טמפ גבוהה רנ א מצמידים לטיהור אהדה של cDNA biotinylated מונע הגברה של מוצרי ASP שאינם ספציפיים במהלך ה-PCR ב-PBMCs נגוע מבחנה בתאי CD4 + T מבודדים מהחולים. RT הטרמה עצמית הוכח להתרחש במהלך שעתוק לאחור של antisense rnas10,14,15,16,17. כדי למנוע תופעה זו, פיתחנו גישה מקורית באמצעות הטכניקה שתוארה במקור על ידי השוד ואח '10. ההליך ...

הסיכות ולולאות של RNA יכולות לתפקד כצבעי יסוד לתמלול הפוכה (RT) בהיעדר התחל העצמי הספציפי ברצף, הפרעה למחקר של התעתיקים החופפים של התמלילים. פיתחנו טכניקה מסוגל לזהות את ה-RNA ספציפי סטרנד, ואנחנו השתמשנו בו כדי ללמוד HIV-1 antisense חלבון ASP.

זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) Antisense חלבון (ASP) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

RT-PCRs קונבנציונליים אינם מאפשרים אפליה בין רצפי החושים והאנטי-חושיים כאשר נעשה בהם שימוש כדי לזהות RNAs המקודדים על ידי גנים חופפים. פרוטוקול זה מאפשר לזהות RNAs אנטי-חושיים במיוחד. השימוש פריימרים biotynylated יחד עם טמפרטורות denaturation RNA גבוה מאפשר הגברה של cDNAs אנטי חושי, מניעת היווצרות של מוצרי RT לא ספציפיים.השתמשנו בשיטה זו כדי להדגים כי ASP או כמו אנטי חוש RNA או מבשר חלבון, זה אנטיגן HIV חדש, עושה את זה פוטנציאל יעד HIV חדשני לטיפול. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת, שבה ניתן לזהות RNAs אנטי-חושיים מגנים חופפים. התחל בתכנון פריימרים ספציפיים למטופל באמצעות רצף הדנ"א הפרו-ויראלי הפנימי של פריימרים PanASP.לאחר מכן, לכמת את RNA ולמנוע זיהום DNA על ידי טיפול בדגימות עם DNase. העבר בין 0.1 ומיקרוגרם אחד של RNA הכולל לתוך בארות המתאימות על צלחת PCR 96 היטב. לאחר מכן להגדיר את התמלול ההפוך, או תגובת RT, על פי הוראות כתב היד.הכן את פקדי RT אנדוגניים על ידי הוספת חמישה microliters של מים חופשיים גרעין במקום פריימר הפוך ASP. מכניסים את הצלחת לתרמוצ'ילר ומחממים את ה-RNA ל-94 מעלות במשך חמש דקות. ואז מיד לקרר אותו במים קרים לפחות דקה אחת.הכן את תערובת התגובה בצינור 1.5 מיליליטר כמתואר בכתב היד טקסט, ולאחר מכן להעביר 17.5 microliters לכל אחד RNA המכיל בארות. דנטורציה RNA חייב להתבצע ב 94 מעלות צל"ש. ללא denaturation מוחלט, סינתזות של מוצרים לא ספציפיים מן RNA החוש עלול להתרחש, המוביל הגברה של cDNAs לא ספציפי.מערבבים בעדינות את תכולת הבאר ומטמיבים את הצלחת ב-55 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. לאחר מכן, להשבית את התגובות על ידי חימום הצלחת ל 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הכינו ליטר אחד של כביסה פי 2 וחוצץ מחייב לפי הוראות כתב היד וסננים את הפתרון.לאחר מכן, הכינו 50 מיליליטר של כביסה פי 1 ומאגר מחייב באמצעות מים בדרגת PCR. מעבירים את המספר המתאים של חרוזים מגנטיים נדנים לצינור 1.5 מיליליטר ואז שוטפים אותם על ידי הוספת נפח שווה של שטיפת פי 2 ומאגר קשירה ומערבולת הצינור למשך 15 שניות. מניחים את הצינור לתוך מתלה הפרדה מגנטית להדרור אותו במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להסיר בזהירות את supernatant מבלי להפריע את חרוזים ולהוסיף את אותו נפח של 2X כביסה חיץ מחייב כמו הנפח הראשוני של חרוזים. Vortex את חרוזים במשך 30 שניות ולהעביר 10 microliters של ההשעיה למספר מתאים של צינורות 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינורות במתלה ההפרדה המגנטית ומדרגרים אותם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, השליכו את העל-טבעי והוסיפו 50 מיקרוליטרים של חיץ כביסה וכריכה 2X. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של cDNA biotynylated לצינורות המתאימים עם חרוזים דגירה אותם במשך 30 דקות תוך סיבוב בעדינות. לאחר הדגירה, מניחים את הצינורות על מתלה ההפרדה המגנטית במשך שלוש דקות ואז לשטוף את חרוזים עם 200 microliters של 1X כביסה חיץ מחייב, ואחריו דגירה שלוש דקות על מתלה ההפרדה.השליכו את העל-טבעי וחזרו על הכביסה פעמיים. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בחרוזים ב-10 מיקרוליטרים של מים בדרגת PCR. הכן כרך מתאים של PCR מאסטר מיקס בהתאם לכיווני כתב היד.מערבבים אותו היטב במהירות לסובב אותו, ולאחר מכן להעביר 49 microliters לגם לצלחת PCR 96 היטב. בזהירות מערבולת הצינורות עם cDNA מטוהרים במשך 15 שניות ולהוסיף מיקרוליטר אחד של ההשעיה ל בארות המתאימות. הפעל את PCR ולהפריד את המוצרים על 1%agarose ג'ל.חותכים את הרצועות מהג'ל ומשכפלים את המוצרים המוגברים לפלסמיד PCR 2.1. לאחר מכן לרצף את השיבוטים ולנתח כל רצף. התגובות הראשוניות של RT בוצעו עם פריימר אנטי-חושי רגיל שאינו ביוטיני, והביאו להגברה מוצלחת של ASP.עם זאת, רצועה של אותו משקל מולקולרי ופקדי פרימר מינוס הוגברה גם היא. כדי לעקוף בעיה זו, פריימר אנטי חוש ספציפי היה שכותרתו עם biotyn ואת cDNA אנטי חוש וכתוצאה מכך היה מטוהר לפני PCR. זה אפשר להגביר את רצף ASP עם זיהום מופחת מאוד מן cDNA לא ספציפי בפקדי פרימר מינוס.אופטימיזציה נוספת של שיטה זו הושגה על ידי denaturation מלא של RNA ב 94 מעלות צלזיוס לפני RT, ואחריו קירור מיידי על מי קרח, אשר הביא הגברה יעילה של הלהקה ASP ולא מוצרים שאינם ספציפיים. הקינטיקה של ASP RNA נמדדו ותאי CD4 מבודדים משלושה נבדקים נשאי HIV עם וירמיה הניתנת לגילוי והיעדר טיפול בעקבות גירוי עם אנטי CD3/CD28. כימות של ASP RNA היה אפשרי גם בחולים שעברו אמנות, עם וירמיה שאינה ניתנת לגילוי.בשניים מתוך שלושה חולים, ASP RNA זוהה ברמות נמוכות ב שלושה עד חמישה ימים לאחר גירוי. שני חולים נותחו עבור ASP ו ENV RNAs, אחד מטופל ואחד מטופל. עבור המטופל שלא טופל, ניתן היה לזהות את שני ה- RNAs.עבור המטופל המטופל המטופל, ASP ו env בקושי היו ניתנים לגילוי לאחר מספר ימים של גירוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי denaturation ליניארית RNA כך מבנים משניים מסוגלים ראש RT נהרסים. בעוד, שטיפת חרוזים שוטף משם cDNAs שאינם biotynylated.לאחר טיהור ה- cDNAs עם הקוטביות הנכונה, ניתן לבצע qPCR כדי לנתח ביטוי גנים. יתר על כן, cDNAs ניתן גם לשכפל ושמש לניתוח רצף. שיטה זו מאפשרת ללמוד גנים חופפים בכיוון ההפוך ועשויים להיות שימושיים בהבהרת רגולציה ופתוגנזה של חיידק ומחלות הקשורות לנגיף כולל סוגים מסוימים של סרטן.

detection-human-immunodeficiency-virus-type-1-hiv-1-antisense-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

HIV כמיהות ניתן להסיק באזור V3 המעטפה ויראלי. V3 הוא PCR מוגבר בשלושה עותקים באמצעות מקוננות RT-PCR, רצף, ופירשו באמצעות תוכנת bioinformatic. דוגמאות עם רצף עם 1 או יותר (ים) עם ציונים נמוכים g2P מסווגים וירוס לא R5.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

מספר 2'-Fluoro aptamers נגד HIV-RNA 1Ba-L gp120 עם זיקה nanomole מבודדים מספריית RNA על...

פיתוח נייד מסוג ספציפי נגד HIV gp120 aptamers למסירה siRNA

לכמת רמות של HIV-1 RNA בפלסמה רצף יחיד HIV-1 הגנום של אנשים עם המון ויראלי מתחת לגבול הגילוי (50-75 עותקים / מ"ל) קשה. כאן אנו מתארים כיצד לחלץ ולכמת רנ"א נגיפי בפלסמה בזמן אמיתי באמצעות PCR assay כי מהימן אמצעים HIV-1 RNA עד 0.3 עותקים / מ"ל ​​וכיצד להגביר את הגנום הנגיפי על ידי רצף הגנום יחיד, ממדגמים עם המון ויראלי נמוך מאוד.

הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

בדיקת עמידות לתרופות ל-HIV-1 אנשים נגועים נכשלו טיפול תרופתי (ART) יכולה להדריך את הטיפולים בעתיד ולשפר את תוצאות טיפול. תוצאות בריאותיות אופטימיזציה של פרט ואוכלוסייה בשכיחות איידס גבוהה, אך משאב מוגבל הגדרות סופו של דבר תדרוש גנוטיפ עמידות לתרופה במחיר סביר ונגיש ושיטות פרשנות.

שיטת ניטור משתלמת HIV-1 תרופות התנגדות להגדרות משאב מוגבלת

הנוכחות של HPV בסיכון גבוה ברקמת גידול ראש והצוואר קשורה בתוצאות טובות. RNA שפותח לאחרונה בטכניקת הכלאה באתר שנקרא RNAscope מאפשר הדמיה ישירה של HPV E6/E7 mRNA בסעיפי רקמות FFPE.

RNAscope עבור<em&gt; באתרו</em&gt; איתור של נגיף הפפילומה אנושי תעתיק פעיל בראש וצוואר קשקש קרצינומה של תאים

תחרות צמיחה בין נגיפים כמעט איזוגניים מספקת מדידה רגישה לקביעת כושר השכפול היחסי. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים בניית שיבוטים רקומביננטיים של HIV-1, תחרות התפשטות וגידול וירוסים ושיטות ניתוח המותאמות להניב תוצאות רגישות ועקביות.

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

מסופק הוא פרוטוקול לפיתוח בדיקת הגברת פולימראז רקומבינאז בזמן אמת כדי לכמת את הריכוז הראשוני של דגימות DNA באמצעות מחזורי תרמי או מיקרוסקופ ומחמם במה. כמו כן מתואר פיתוח של בקרה חיובית פנימית. סקריפטים מסופקים לעיבוד נתוני פלואורסצנטיות גולמיים בזמן אמת.

פיתוח של כמותי recombinase פולימראז ההגברה Assay עם בקרה פנימית חיובית

כאן אנו מציגים בגישה רצף עמוק המספקת של קביעה לא משוחדת של nascent-3' טרמיני, כמו גם פרופילים mutational של מולקולות דנ א חד גדילי. היישום העיקרי הוא אפיון nascent retroviral משלימים DNAs (cDNAs), intermediates שנוצר במהלך התהליך של retroviral שעתוק במהופך.

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

למדו לזהות תעתיקי ASP של HIV-1 בחולים באמצעות שיטת strand-specific PCR. השיטה משתמשת בפריימרים ביוטינילציים וטמפרטורות דנטורציה גבוהות כדי למנוע מוצרים לא ספציפיים ולאפשר הגברה ספציפית של cDNA אנטי-סנס.

זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) Antisense חלבון (ASP) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-PCR

גלה סרטונים נוספים