זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי

פרוטוקול זה משתמש בהדמיה תרמית כדי לזהות תרכובות חדשות מסוגל לווסת את התרחשות הצמח. טכניקה זו היא רב-תכליתית לגבי מיני הצמחים שניתן לבדוק, אופי המתחם וסוג ההדמיה. כדי להקים את הצמחים לטיפוח, תחילה להוסיף שכבה בעובי ארבעה ס"מ של vermiculite עדין רגיל 10 על 20 מגשי צמח אינץ 'ללא חורים ומחזיקי זרעים מניחים שני סנטימטרים זה מזה במגשים.

ממלאים את מחזיקי הזרעים בווריקולייט ומ מניחים זרע חמניות אחד מחודד כלפי מטה לכל מחזיק כך שחצי מהזרע נשאר חשוף. כאשר כל הזרעים כבר מצופים, לכסות אותם עם שני סנטימטרים נוספים של vermiculite בסדר ערפל עם מים מלמעלה. לאחר שעה, מכסים את המגשים במכסים ומ מניחים את הצמחים בתא צמיחה בחממה.

כדי להקים את מערכת הידרופוניקה, למלא מיכל בגודל מתאים מתאים לגידול צמחים הידרופונית עם מים מזוקקים ולהוסיף דשן הידרופוניקה כללי כפי שצוין על ידי היצרן. לאחר מכן השתמש במשאבות אוויר ומים כדי להפוך את פתרון הידרופוניקה וכתוצאה מכך עם תנועה מתמדת. כדי להכין את המצופים הידרופוניקה, לחתוך גיליון של שני סנטימטר עבה קצף פוליסטירן מורחב לממדים של המיכל ולהשתמש בכלי שריפת עץ כדי להפוך חורים בקוטר 1 עד 2 ס"מ בקצף.

ואז למקם את המצופים לתוך מערכת הידרופוניקה. חמישה ימים לאחר השתיל, מוציאים בעדינות את השתילים מהוורמיקולייט. מיד מניחים את השתילים במיכל מים במשך 30 דקות כדי להסיר vermiculite עודף כדי לרכך את pericarps הנותרים.

כאשר השורשים העיקריים המתעוררים גלויים, להסיר את pericarps ביד לפי הצורך. מעבירים את השתילים בתוך מחזיקי הזרעים לתוך מצופי קצף הפוליסטירן המוכנים במערכת ההידרופוניקה. לגדל את הצמחים הידרופוניקה במשך יומיים.

תן לכימיקלים מהספרייה המורכבת הקטנה להפשיר בטמפרטורת החדר. תווית שישה צינורות ללא כובע שני מיליליטר לטיפול שליטה שלילית, שלושה צינורות לטיפול ABA, ואת 60 צינורות הסופי לניתוח ההשפעות של 20 כימיקלים של עניין triplicate. הוסף 10 microliters של כל כימיקל לתוך כל אחד מבחנות, 10 microliters של 10 מילימולרים ABA ו דימתיל סולפוקסיד לתוך שלושת צינורות ABA, ו 10 microliters של דימתיל סולפוקסיד לתוך שש צינורות הבקרה.

ואז בזהירות לערבב 990 microliters של 10 מילימולר MES אשלגן הידרוקסיד לתוך כל צינור. מניחים את הצינורות לתוך מתלה צינור עם שליטה חיובית ושלילית צינורות ניסיוני מופץ באופן שווה בתוך המדף כדי להסביר את ההטיה הקשורה למיקום. כדי להגדיר את מצלמת ההדמיה התרמית, הר תחילה את המצלמה על מעמד צילום וחבר את כל הכבלים למחשב נישא.

הפעל את המצלמה לפני הפעלת המחשב הנייד ולפתוח את תוכנת ניתוח ההדמיה התרמית. כדי להתאים את פרמטרי ההקלטה, גלגל את העכבר מעל לחצן הקלט כדי לאפשר בחירה של סמל מפתח הברגים תחת הגדרות רשומה ובחר את מצב הרשומה והאפשרויות המתאימים. לטיפול שתילים, בזהירות להרים את מחזיק הזרעים במהירות לטבול את השורש לתוך המנה הרדודה המכילה מים.

חותכים את השורש העיקרי של כל שתיל מתחת למים 0.8 עד סנטימטר אחד מתחת לקצה הבסיסי ביותר של מחזיק הזרעים כדי למנוע קפיטציה ולהכניס את הצמח לחתוך טרי לתוך צינור אחד של כימיקלים. כאשר כל השתילים הועברו, מניחים את הצמחים מתחת למצלמת ההדמיה התרמית ומאשרים שכל הצמחים נמצאים בשדה המבט של המצלמה. כדי למקד את המצלמה על פני הקוטילדונים, הקש Control Alt A ולחץ על הקלט סרט.

ייפתח חלון חדש המאשר את ההקלטה. אחרי 1-2 שעות, תפסיק את ההקלטה. לניתוח נתונים, פתח את קבצי seq הנכונים והשהה את הסרט.

לחץ על הוסף אזור סמן מדידה של עניין סמל שלושה על שלושה פיקסלים והזז את העכבר מעל מרכז הקוטיילדון של הצמח הראשון. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התמונה כדי לתייג את הקוטילדון. סמן את הקוטילדון השני של הצמח הראשון באותו אופן.

לאחר שכל הצמחים תויגו בשני סמנים, לחץ על סמל אזורי העריכה של עניין ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על החזק וגלול כדי לבחור את כל אזורי העניין. לאחר מכן, גלגל את העכבר מעל סמל הצופה הסטטיסטי ובחר עלילה זמנית. ייפתח חלון חדש.

הפעל את הסרט, גרף יתמלא בנתונים. לאחר מכן, בחלון התרשים, לחץ על החץ הכפול כדי לפתוח תפריט חדש ולחץ על סמל השמירה כדי לשמור את הנתונים. השימוש אריתרוסין צבע אדום B מדגים את היכולת של כימיקלים להיספג בעליל דרך שורש לחתוך לתוך הקוטילדונים של שתיל חמניות בתוך 10 דקות.

כאשר צמחים מטופלים עם ABA, עלייה בטמפרטורת העלה מזוהה cotyledons חמניות בתוך 30 דקות הקשורות לירידה בצמצם stomatal ואת המוליכות stomatal. בנוסף, טמפרטורת עלווה מוגברת נצפתה 15 דקות לאחר הטיפול עם 10 micromolar ABA ו 20 דקות לאחר הטיפול עם חמישה micromolar ABA המוכיח כי מדידת טמפרטורת העלה על ידי הדמיה תרמית היא פרוקסי טוב למדידת צמצם stomatal ומוליכות. בניסוי מייצג זה, טיפול סטטיסטי מבוסס ציון סטנדרטי מאפשר זיהוי של כימיקלים המקדמים סגירה או פתיחה סטומטלית.

כדי למדוד את ההשפעות של תרכובות על התרחשות, חשוב לגדל צמחים בתנאים אופטימליים של אור, לחות וטמפרטורה. ניתן להחיל פרוטוקול זה על רוב הדיקוטים. זה יכול לשמש גם כדי להעריך את ההשפעה של תרכובות חדשות על ביצועים פוטוסינתטיים, למשל על ידי מדידת פלואורסצנטיות כלורופיל.