חקירת פירוק מחסום המעיים באורגנואידים חיים

במטרה לחקור את שלמות מחסום המעי, פיתחנו שיטה למדידת שלמות מחסום המעי באורגנואידים מעיים קטנים בעכבר. לעומת זאת, אנו מתייחסים לתרבות תאי monolayer משומשים, ההתמדה שלנו מבוססת על אורגנואידים מעיים קטנים תלת מימדיים. התאמת היכרות דו מימדית למודל שלנו הייתה חיונית למעשיותו.

ההתמדה מבוססת על אורגנואידים מתורבתים במבחנה וייקומה יעזור להגדיר תמריצים ומעכבים של שלמות מחסום המעי. ויסות חלבוני צומת הדוק הוא תכונה חשובה של כל תאי האפיתל. ההתגלות שלנו מאפשרת את התפקוד והניתוח של שלמות מחסום האפיתל.

כדי למדוד את שלמות המחסום של אורגנואידים מבודדים מרקמה במעיים של העכבר, תחילה הקדימו את כל צינורות הצנטריפוגה שישמשו לאחסון האורגנואידים במהלך תהליך ציפוי עם מספיק 0.1%BSA ב- PBS כדי לכסות את כל משטחי הפלסטיק. מיד להסיר את פתרון BSA ולה מניחים את הצינורות על קרח. לאחר מכן, להפשיר את פתרון מטריצת התא ואת מדיום תרבות האורגנואידים על הקרח בזהירות להסיר את מדיום התרבות מכל באר של צלחת תרבות אורגנואידית 48 היטב.

לשטוף כל באר עם מיליליטר אחד של PBS קר לפני צינורות נמרצות כדי להמיס את מטריסות התא. כאשר הושגו השעיות תאים הומוגניות יחסית, לשטוף את האורגנואידים עם PBS טרי פעמיים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש כל תרבות אורגנואידית ב 40 microliters של מדיום קר. נתק את המבנים האורגנואידיים הגדולים באמצעות קצה פיפט 10 מיקרוליטר חמש פעמים כדי לאסוף מבנים בגודל של 40 עד 60 מיקרומטר ולערבב כל השעיה אורגנואידית עם 40 מיקרוליטרים של פתרון מטריצת תאים טריים.

מוסיפים כל מתלה פתרון מטריצת תא אורגנואיד למרכז בארות בודדות של 8 כיסויים תאים היטב ומ מניחים את השקופית על חבילת קרח במשך חמש דקות. בסוף הדגירה, מניחים את השקופית ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 20 דקות כדי לאפשר פימור של מבנה מטריצת התא האורגנואידי לפני הוספת 150 microliters של תרבות אורגנואידית בינוני לכל באר עבור אינקובציה 24 שעות ביממה באינקובטור תרבות התא. בסוף הדגירה, לטפל בארות שליטה חיובית עם 10 ננוגרם למיליליטר של גמא אינטרפרון מורין רקומביננטי במשך 48 שעות.

כדי לבצע בדיקה חפוזה, להעביר את הכיסוי התאי לתא הדגירה מחומם 37 מעלות צלזיוס של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך ולהגדיר את דו תחמוצת הפחמן של התא ל 5%נעל את הכיסוי בחוזקה על שלב המיקרוסקופ ולהתאים את הגדרות ההדמיה של המיקרוסקופ כדי לדמיין את האורגנואידים באר אחת של התא. לאחר מכן, להוסיף שלושה microliters של 100 מילימולרי לוציפר צהוב מוכן טרי ב 150 microliters של בינוני אחד גם במשך שעה אחת דגירה בתא מיקרוסקופ. בסוף הדגירה, להתאים את המוקד כדי לדמיין את הלומן של אורגנואיד התייחסות ולהגדיר את אנרגיית הלייזר הנדרשת עבור העירור הצהוב לוציפר ואת רגישות הגילוי בהתאמה של המכשיר כדי לדמיין את האות הצהוב לוציפר ב 30 עד 40% של הטווח הדינמי הזמין של המכשיר.

לחלופין, ניתן לשנות את עוצמת האות על ידי שינוי זמן החשיפה. כדי למצוא את המיקומים של כ -10 אורגנואידים עם מבנה כדורי קרוב למשטח הכיסוי ל הבאר על ידי הפרעה דיפרנציאלית ניגודיות הדמיה חיה, לכידת אורגנואידים עם קטרים דומים והתמקדות בפרוסה המרכזית של האורגנואידים כדי לדמיין את הלומן. רשום את ניגודיות ההפרעה הדיפרנציאלית ואת הפלואורסצנטיות הצהובה של לוציפר של כל תנוחה כדי לתעד את הצורה והפלואורסצנטיות האוטומטית של כל אורגנואיד.

כאשר כל האורגנואידים דימוי, להוסיף 150 microliters של מדיום, כולל לוציפר צהוב, לוציפר צהוב טיפול בארות תמונה כל בארות כל חמש דקות במשך 70 דקות. בסוף סשן ההדמיה, הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של EGTA שהוכן טרי ל-100 מיקרוליטרים של מדיום. הוסף את EGTA מדולל ל בארות המתאימות.

לאחר מכן, להקליט את הפלואורסצנטיות של האורגנואידים בכל באר כל חמש דקות במשך 30 דקות. הקפד לתרגל את הטיפול והתרבות או אורגנואידים מראש כמו הכדאיות התאית ושלמות הם תנאי מוקדם להצלחת ההתדאגה. בניסוי מייצג זה, לאחר 70 דקות של טיפול עם פלואורסצנטיות צהובה לוציפר צהובה לוציפר היה גלוי רק אורגנואידים מבעלי חיים מסוג בר שטופלו גמא אינטרפרון.

לא פקדים לא מסווגים, ולא אורגנואידים שמקורם קולטן אינטרפרון גמא-2 חיות נוקאאוט הראו פלואורסצנטיות צהובה לוציפר תוך-לאומית בסוף תקופת הטיפול. התוספת של EGTA גרמה לפירוק לא ספציפי של שלמות מחסום המעי על ידי בידוד גורמים צומת הדוק, וכתוצאה מכך לוציפר צהוב לקחת ביטוי בכל האורגנואידים ללא קשר למקור או תנאי טיפול. ניתן לכמת גם את ערכי האינטנסיביות היחסית של רמת הפלואורסצנטיות הצהובה של לוציפר בתוך לומן האורגנואיד ומחוץ לכל אורגנואיד.

הקפד לבחור אורגנואידים עם גודל דומה סביב התצורה ולבחור את הציר להגדיר, כך שאתה יכול לדמיין את הלומן המרכזי של organoid. בנוסף לשימוש בחומרים הגורמים להתמוטטות מחסום המעי, אנו יכולים גם לחקור אסטרטגיות לעיכוב הרס מחסום המעי. מכיוון שמתודולוגיה זו מבוססת על תאים ראשוניים מבעלי חיים בודדים, ניתן להשתמש בה עבור מים רבים, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים לכל ניסוי.