ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים
9 בפברואר 2020
הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות. הפרוטוקול המוצג משתמש מושרה המושרה תא גזע הנגזרת הנוירונים המוח כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה ב מפרסטית תורשתית. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של מורפולוגיה שלהם, אשר להקל על המחקר של מחלות ניווניות.
תפקוד מיטוכונדריאלי ביסוד מחלות ניווניות רבות. הפרוטוקול שלנו מספק כלי חשוב לבחינת הדינמיקה המיטוכונדרית באקסונים, ומקל על חקר מחלות נוירולוגיות המערבות ניוון אקסונאלי. על ידי שילוב של תיוג מיטוכונדריאלי, הדמיית תאים חיים וטכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטית המושרה הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לאפיין סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים אנושיים ולנתח את המטומטמים שלהם.
תחבורה מיטוכונדרית לקויה ומורפולוגיה ניתן לראות בתרבויות תאי גזע ומודלים של בעלי חיים של מחלות ניווניות מתן מטרות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול במחלות אלה. לאחר יום שלושים וחמש של תרבות, לנתק את הנוירוזפרות נבדל מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם לתוך אשכולות קטנים עם 1 מ"ג / מ"ל של פתרון ניתוק תאים במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה לאסוף את אשכולות התא על ידי צנטריפוגה ו resuspend את גלולה במיליליטר אחד של NDM.
צלחת על חמישה אשכולות של תאים במאה microliters של בינוני לכל פוליאורניתאין ו לקטוז דהידרוגנאז מרומם את מגרצת ממברנת מרתף מקף ללא וירוס מצופה 35 מילימטר זכוכית התחתון כלים. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של NDM בתוספת B27, מונופוספט אדנוזין מחזורי, גורם גדילה דמוי אינסולין, גורם נוירוטרופי המופק על ידי המוח האנושי וגורם נוירוטרופי הנגזר מתא גליה לכל תרבות. כדי לדמיין מיטוכונדריה לאורך האקסונים של נוירונים forebrain הראשון להכתים את הנוירונים עם 50 צבע פלואורסצנטי אדום nanomolar ב NDM במשך שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס ואחריו שתי שטיפות NDM חם.
לאחר מכן, מקם את התרבות על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ובחר את המטרה 40X. תחת שדה הפאזה זהה את האקסונים בהתבסס על המאפיינים המורפולוגיים שלהם. כדי להבחין בכיוון התנועה המיטוכונדרית לאורך האקסונים לזהות בבירור את גופי התא של נוירונים.
לאחר הבחנה גוף התא האקסון להתאים את זמן החשיפה ואת המוקד של המיטוכונדריה האקסונים וללכוד את התחבורה המיטוכונדרית בתוך האקסונים כל חמש שניות במשך חמש דקות בסך הכל. כדי לנתח הובלה מיטוכונדרית ב ImageJ לפתוח פיג'י ובחר את תוסף ביו פורמטים. השתמשו ביבואן Bio-Formats כדי לייבא את התמונות של סדרת tiff ולבחור ImageJ רגיל ולפתוח את כל הסדרות.
בדקו ערוצים מפוצלים בקנה מידה אוטומטי ולחצו על הלחצן 'אשר' כדי לציין את מספר המסגרת ואת גודל התמונות בפיקסלים. לאחר התאמת הבהירות והניגודיות של כל 60 המסגרות, השתמש בקו מקובע כדי למתוח קו מגוף התא לאקסון המסוף. ליצירת הקימוגרף בחרו בתוסף Kymograph המרובים ובחרו ברוחב הקו.
כדי למדוד את המרחק, ערכי הזמן והמהירות עבור המיטוכונדריה הנעה הפתוחה tsp050607. txt בתוסף פקודות המאקרו. ולצייר קו מקופל מעל עקבות התנועה המיטוכונדרית על הקימוגרף מהממונה על האזור הנחות.
לאחר ציור הקו לפתוח מהירות קריאה מ- tsp בתוסף פקודות המאקרו כדי לקרוא את המהירויות מקולחות המתאימות לקו. לאחר מכן פתחו את התמונה המקורית ולהשתמש בכלי הקו כדי לצייר קו לאורך סרגל קנה המידה. בחר ניתוח כדי למדוד את אורך הקו ולהמיר את ה- dx כעת ואת יחידות המרחק מפיקסלים למיקרומטרים.
לאחר מכן שנה את השעה מפיקסלים לשתיים. כדי לנתח את האורך המיטוכונדריאלי ואת האזור בתוך אקסונים ב ImageJ להתקין את תוסף מקף תחתון מקף תחתון ליישר JAR ולפתוח את תמונת האקסון של עניין. המירו את התמונה של 32 סיביות לשמונה סיביות ולהשתמש בכלי קו מקובע כדי לעקוב אחר האקסון.
בחר את תוסף JAR מקף תחתון ישר ולהגדיר את רוחב קו רחב של תריס ל 50 פיקסלים. עקבו שוב אחר האקסון כדי ליצור אקסון מיישר ולהתאים את סף התמונה. בחרו 'ניתוח מדידות מוגדרות היקפיות מתאימות לאליפסה ולתארי צורה' כדי לקבוע את המדידה ולהשתמש בפונקציית הקו כדי למדוד את סרגל קנה המידה בתמונה המקורית כפי שהוכח.
תחת ניתוח ולהגדרת קנה מידה הזן את המרחק במרחק הידוע של הפיקסלים ואת יחידת האורך כדי לקבוע את קנה המידה. לאחר מכן בחרו 'כללי' כדי להגדיר את הגדרת קנה המידה לכל התמונות. לבסוף בחר לנתח ולנתח חלקיקים כדי לקבוע את האזור ובחר תוצאות תצוגה כדי להציג את המדידה המתקבלת.
לאחר בידול לתוך נוירונים גלוטמטרגיים telencephalic התאים יכולים להיות מאופיינים על ידי T-B-R שלהם אחד בטא שלוש ביטוי סמן tubulin. כתמים בצבע פלואורסצנטי אדום והדמיה לשגות בזמן מאפשר הערכה של התחבורה האקסונאלית של המיטוכונדריה. מיטוכונדריה אחת יכולה להישאר סטטית או לנוע בכיוון אנטרוגרדי או מדרדר בתוך אקסון.
את מהירות התנועה המיטוכונדרית לאורך האקסון ניתן לכמת כפי שמודגם. לדוגמה באמצעות תוכנת ניתוח מסחרית זמינה אחוז המיטוכונדריה מוטיב מופחת באופן משמעותי נוירונים S-P-G-3-A בהשוואה נוירונים סוג הבר. כדי לנתח את אורך האזור המיטוכונדריאלי ואת יחס הגובה-רוחב אקסונים יכולים להתיישר בתוכנת ניתוח התמונה ונבחרים על-ידי התאמת הסף.
לאחר מכן ניתן לקבל את רוחב אורך ההיקף של אזור המיטוכונדריה ויחס הגובה-רוחב מהאקסון המיישר. לדוגמה, הן אורך המיטוכונדריה והן יחס הגובה-רוחב מופחתים באופן משמעותי באקסונים של נוירונים מסוג S-P-G 15 בהשוואה לשליטה באקסונים מסוג בר. חשוב לחמם את המדיום ואת חממת המיקרוסקופ לשטוף את התאים בעדינות ולאפשר לתאים להתייצב במשך עשרים דקות לפני ההדמיה.
לאחר הדמיה של תאים חיים ניתן לתקן את התרבויות ולהעפוף לכשל חיסוני כדי לבחון את הביטוי של חלבונים אחרים בעלי עניין. מאתגר לבחון את הדינמיקה המיטוכונדרית בעצבים אנושיים חיים. טכניקה זו מספקת את הכלי הייחודי לחקר הדינמיקה המיטוכונדרית והתנוונות העצבים במחלות נוירולוגיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הובלת המיטוכונדריה ואת המורפולוגיה שלה באמצעות נוירונים של המוח הקדמי המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים, בהקשר של פלגיה ספסטית תורשתית. הפרוטוקול מאפשר הערכה מפורטת של הדינמיקה המיטוכונדריאלית לאורך האקסונים, ובכך תורם להבנת מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחלות ניוורו-דגנרטיביות
רקע
- תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא גורם מפתח במחלות נוירודגנרטיביות שונות.
- שיבושים בהובלה ובמורפולוגיה של המיטוכונדריה נקשרו לדגנרציה אקסונלית.
- השימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים מספק מודל רלוונטי לחקר תהליכים עצביים אנושיים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לבחינת התנהגות מיטוכונדריאלית באקסונים.
- הבהרת הקשר בין דינמיקה מיטוכונדריאלית למנגנונים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- זיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות למצבים כגון paraplegia spastic תורשית.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- תרבית תאים של נוירונים של המוח הקדמי המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים.
- דימות תאים חיים בשילוב סימון מיטוכונדריאלי להערכת מעקב אחר מיטוכונדריה.
- שלבים חשובים כוללים דיסוציאציה של נוירוספירות וצביעה נכונה בצבעים פלואורסצנטיים.
- ניתוח תמונות שבוצע באמצעות ImageJ, כולל יצירת קימוגרפים.
תוצאים עיקריים
- אפיון התובלה המיטוכונדריאלית חשף הבדלים משמעותיים בדינמיקה המיטוכונדריאלית.
- כימות אורך ותנועת המיטוכונדריה הראה ירידה בניידות בנוירונים שהופקו ממודלים של HSP (הספסטיקה פאראפלגיה תורשית).
- הממצאים מדגישים את חשיבות התפקוד המיטוכונדריאלי בבריאות ובמחלות של מערכת העצבים.
מסקנות
- מחקר זה מספק גישה ניסויית חיונית לניתוח דינמיקה מיטוכונדריאלית בהקשר של ניוון עצבי.
- התובנות שהופקו יכולות להנחות אסטרטגיות טיפוליות עתידיות המכוונות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
- המתודולוגיה עשויה להעמיק את הבנתנו לגבי מנגנונים נוירונליים והתקדמות המחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר הערכה ישירה של הובלה ומורפולוגיה מיטוכונדריאלית בנוירונים המופקים מ-iPSC אנושיים, ובכך נותן מענה לפער קריטי במידול מנגנונים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים. באמצעות כימות מהירות המיטוכונדריה בתנועה אנטרוגרדית ורטרוגרדית, אורכן, שטחן ויחס ההיבט (aspect ratio) שלהן, הפרוטוקול מספק הפחתת סיכונים מנגנונית (mechanistic de-risking) לצורך תיקוף מטרות במסלולים של ניוון אקסונלי. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה לתוצאות פנוטיפיות הרלוונטיות לשיתוק פראפלגיה ספסטית תורשתית ולהפרעות קשורות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי כימות ליקויי תעבורה מיטוכונדריאלית כמדד תפקודי לסיכון לניוון עצבי.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגית באמצעות מדידה סטנדרטית של ניידות ומורפולוגיה מיטוכונדריאלית בנוירונים אנושיים הרלוונטיים למחלה.
- ערך חיזוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי זיהוי תרכובות המשפרות את מהירות ההובלה או פרמטרים מורפולוגיים במודלים המופקים מ-iPSC.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצרת פלטים כמותיים הכוללים מהירות מיטוכונדריאלית (µm/s), אורך, שטח ויחס רב-מימדי (aspect ratio) עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- שחזוריות: משתמשת בניתוח קימוגרף סטנדרטי ובמורפומטריה מבוססת ImageJ כדי להבטיח תוצאות עקביות וניתנות להרחבה בין ניסויים.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מבססת סבב עבודה של דימוי וניתוח הניתן לשימוש חוזר לצורך הערכת תפקוד מיטוכונדריאלי במודלים שונים של דיפרנציאציה נוירונלית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה ליקויים מיטוכונדריאליים שנצפו בנוירונים של חולי paraplegia spastica תורשתית, ובכך מאפשר התאמה של ביומארקרים תרגומיים.
- המשכיות פרה-קלינית: מגשר בין ממצאי הגילוי לאימות פרה-קליני על ידי אספקת מערכת רלוונטית לבני אדם להערכת מעורבות המטרה (target engagement).
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקביעת קריטריונים להמשך קידום על ידי מתאם בין הצלה מיטוכונדריאלית לשיפור פנוטיפי בשלמות האקסונית.
שילוב בצינור העיבוד ובזרימת העבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, תומכת בבחינת השערות בתהליך תיקוף המטרה ומאפשרת זיהוי מובילים (leads) באמצעות קריאות פונקציונליות של המיטוכונדריה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת הדינמיקה המיטוכונדריאלית כפנוטיפ הקשור למסלול בניוון עצבי.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות המוכנות לבדיקה לגבי הובלה ומבנה מיטוכונדריאלי לצורך הערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות של מהירות, אורך, שטח ויחס היבט המאפשרות השוואה ראש בראש של תנאים גנטיים או טיפוליים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית באמצעות פנוטיפים נוירונליים רלוונטיים למחלה וסמנים ביולוגיים מיטוכונדריאליים.
- שימוש חוזר ארגוני: מתפקד כיכולת מודולרית להערכת בריאות מיטוכונדריאלית במגוון מודלים של מחלות ניוון עצבי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור ישיר בין פגמים בתובלה מיטוכונדריאלית לבין מודלים של מחלות ניוורו-דגנרטיביות.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות פרוטוקולים מאושרים של דימות ואנליזה.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי אספקת מדדים מוקדמים ובעלי יכולת ניבוי אנושית לתפקוד מיטוכונדריאלי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם-סיכון, בהתבסס על הצלה של דינמיקה מיטוכונדריאלית אקסונלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהגבהה של iPSC, בדימות תאים חיים ובסימון פלואורסצנטי של מיטוכונדריה.
- תלוי במיקרוסקופיית פלואורסצנציה עם בקרת סביבה ובתוכנה לניתוח המסוגלת להפיק קימוגרפים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרמטרי רכישת תמונות וניתוח לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום על תת-סוגים שונים של נוירונים או מודלים של מחלות.
- מוגבל בשל הצורך באופטימיזציה טכנית של סף התמונה ובחירת קו קימוגרף למדידה מדויקת של מהירות.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:50
Telencephalic Glutamatergic Neuron Generation
1:49
Time-Lapse Imaging of Mitochondrial Transport Along Telencephalic Glutamatergic Neuron Axons
2:44
Cortical Neuron Mitochondrial Transport Analysis
4:17
Cortical Neuron Mitochondrial Morphology Analysis
5:32
Results: Representative Mitochondrial Transport and Morphology Analyses
6:47
Conclusion
